一种提高台湾泥鳅高度不饱和脂肪酸含量的分子育种方法

1.本发明属于分子育种领域，涉及一种台湾泥鳅长链脂肪酸延长酶5(elongase of very long chain fatty acids 5,elovl5)基因，本发明还涉及该基因在台湾泥鳅分子育种中的应用，以及一种利用crispr/cas9系统敲除台湾泥鳅elovl5基因从而提高台湾泥鳅高度不饱和脂肪酸含量的分子育种方法。


背景技术：

2.随着人类社会的发展，人们对营养与健康的要求越来越高。高度不饱和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids，hufa)是人和动物体内必需的营养素，与人类健康密切相关，主要有二十碳四烯酸(又称花生四烯酸,arachidonic acid,aa)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,epa)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,dha)等。食物中的长链不饱和脂肪酸，尤其是dha，对肝脏脂代谢和预防肝脂肪变性有着重要作用。由于人体内无法自身合成hufa，必须从食物中摄取，因此hufa被称为必需脂肪酸。dha和epa是人类健康饮食的重要组成部分，而人们的摄入量严重不足。目前主要的hufa来源为鱼油，海水鱼富含n-3hufa，但其hufa主要通过食物链的累积。淡水鱼具有一个完整的自身hufa合成能力，但合成量有限。若能调控淡水鱼n-3hufa自身合成能力，将大大增加hufa产量，提高淡水鱼的营养品质，从而满足人类对多不饱和脂肪酸的需求，增强人类健康。
3.crispr/cas9基因敲除系统是近两年发展起来的一种来源于细菌获得性免疫系统的基因编辑技术，经过人工的改造，目前已被广泛运用于多种模式生物的研究，成为一种强大的研究工具。
4.目前已有研究表明，淡水鱼hufa的生物合成需通过自身的长链脂肪酸延长酶2(elongase of very long chain fatty acids 2,elovl2)、长链脂肪酸延长酶5(elongase of very long chain fatty acids 5,elovl5)和长链脂肪酸去饱和酶2(desaturase of very long chain fatty acids 2,fads2)。liu等使用crispr/cas9基因敲除技术敲除斑马鱼elovl5基因发现，鱼体内elovl5表达量显著下降，elovl2表达量显著上升，鱼体epa与dha含量无显著差异。sun等使用crispr/cas9基因敲除技术敲除斑马鱼elovl5基因发现，elovl5表达量显著下降，elovl2表达量显著上升，鱼体epa含量下降，dha含量上升。本发明在台湾泥鳅中敲除elovl5基因后，鱼体dha与epa含量均显著上升。斑马鱼作为模式生物，并不能产生食用价值，不能达到满足人类hufa营养需求的目的。而台湾泥鳅作为养殖鱼类，生产含有高hufa含量的台湾泥鳅，可将其应用到生产中，满足人类对hufa的营养需求，将是一种具有重大意义的发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种台湾泥鳅elovl5基因，本发明的第二个目的在于提供所述elovl5基因在提高台湾泥鳅高度不饱和脂肪酸含量的分子育种中的应用，本发明的第三个目的在于提供一种利用crispr/cas9基因编辑技术提高台湾泥鳅高度不饱和脂
肪酸含量的分子育种方法。
6.本发明通过以下技术方案实现：
7.1、台湾泥鳅elovl5基因序列信息的确定
8.①
首先，使用rnaiso plus试剂(takara，日本)提取台湾泥鳅肝脏总rna，再使用逆转录试剂盒prime1st strand cdna synthesis kit(takara，日本)体外合成第一链cdna。
9.②
由ncbi数据库中获取斑马鱼，草鱼，团头鲂等鱼类elovl5基因全长cdna序列，后进行多重比对，读取这些鱼类保守区域氨基酸序列的保守区域设计合成1对简并引物，用于克隆台湾泥鳅elovl5基因核心片段，回收产物送公司测序，得到其序列信息。
10.③
使用smart race cdna amplification kit(clontech,usa)试剂盒，参照试剂盒推荐方法合成5’、3
’‑
race cdna第一链。再在
②
步骤中得到的核心片段序列上的设计race引物，分别以5’、3
’‑
race cdna第一链为模板，克隆台湾泥鳅elovl5基因5’和3’末端片段，回收产物送公司测序，得到其序列信息。
11.④
拼接得到台湾泥鳅elovl5基因全长序列信息。台湾泥鳅elovl5全长序列信息如seq id no：1所示。台湾泥鳅与斑马鱼基因相似度为90％，比对结果如图1所示。
12.2、crispr/cas9靶位点设计及确认：
13.根据台湾泥鳅elovl5基因序列信息，设计台湾泥鳅elovl5基因crispr/cas9靶位点，并确认elovl5-grna-cas9靶位点敲除特异性。
14.在台湾泥鳅elovl5基因的orf序列上，按照crispr/cas敲除原理，设计elovl5基因靶位点。台湾泥鳅靶位点为：5
’‑
tctgattgtgtggatgggac-3’，尽量在orf前端设计。同时在靶位点周围300-500bp大小范围内设计引物进行pcr扩增，扩增产物直接送测序。要求：
①
正反向引物距离靶位点处至少100bp。
②
pcr条带清晰，无杂带。
③
测序结果与设计的靶位点序列相同，且测序峰图显示为纯合子(即未出现叠峰)。台湾泥鳅elovl5基因靶位点序列信息如seq id no：2所示。
15.3、cas9mrna和grna的制备：
16.以纯化后的线性化cas9质粒(psp6-2snls-spcas9 vector)为模版，进行体外转录得到cas9mrna，将其纯化后于-80℃保存。保存浓度为830ng/μl。设计含有elovl5基因靶位点序列的上游引物及与其匹配的下游引物，以grna骨架质粒为模版进行pcr扩增，再以纯化后的产物为模版，进行体外转录得到grna，将其纯化后于-80℃保存，保存浓度为1210ng/μl。含有台湾泥鳅elovl5基因靶位点序列的上游引物如seq id no：3所示，与其匹配的下游引物如seq id no：4所示。
17.4、体外显微注射：
18.注射前一天晚上，挑选2对发育较好的台湾泥鳅进行人工催产，人工催产药物的剂量为每千克雌亲鱼注射lrh-a
2 40ug、dom 4mg，雄鱼减半。然后将亲本置于水温为27℃的黑暗环境中静养。第二天早上即可进行人工授精，获得受精卵后将其置于显微注射专用培养皿上，用显微注射仪对到达1细胞期的受精卵进行显微注射。之后将注射完毕的受精卵置于28℃恒温箱进行孵化培育。cas9mrna的终浓度为500ng/μl，grna的终浓度为30ng/μl，每次注射的量为2nl，注射部位为动物极。
19.5、elovl5基因敲除鱼的筛选：
20.利用f0代台湾泥鳅的elovl5基因突变体与野生型台湾泥鳅进行繁殖获得f1代，挑选出同一突变类型的f1代进行自交获得f2代，再将f2代的纯合突变体进行自交便可获得elovl5基因敲除的台湾泥鳅泥鳅纯合子。
21.6、鱼体脂肪酸含量的测定
22.将同一批次繁殖的野生型和敲除型纯合子养至2月龄，提取脂肪酸，通过气相色谱法检测脂肪酸含量。实验结果显示，敲除型与野生型相比，体内epa与dha含量均有显著差异，与野生型相比敲除型epa、dha含量显著上升，dpa、epa与dha总量显著升高。
23.本发明的有益效果是:
24.1、首次在台湾泥鳅中利用crispr/cas9技术获得elovl5基因敲除的纯合突变体。
25.2、通过敲除elovl5基因调控台湾泥鳅体内pufa合成能力，提高鱼体pufa含量。
26.3、本方法区别于转基因方法，不引入外源基因，不用担心转基因食品对人类健康的影响，易于在生产上推广。
附图说明
27.图1台湾泥鳅与斑马鱼elovl5蛋白质序列比对。
28.图2台湾泥鳅-2bp敲除模型的序列比对。
29.图3台湾泥鳅-4bp敲除模型的序列比对。
30.图4台湾泥鳅野生型与elovl5基因敲除型的epa+dpa+dha含量比较。
31.图5台湾泥鳅野生型与elovl5基因敲除型的脂肪酸含量变化。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
33.实施例1台湾泥鳅elovl5基因序列信息的确定
34.1、总rna的提取
35.使用takara公司rnaiso plus试剂进行台湾泥鳅总rna的提取，具体步骤如下：
36.1)提取rna：所用器皿、手术剪、镊子均要用depc处理过夜；所用到的水为takara公司购买的rnase-free water；离心ep管，各型号枪头为提rna专用的或者用depc水浸泡过夜并高压灭菌处理。注意：提取总rna过程中要及时佩戴口罩，更换手套，避免说话。实验前将取样器械置于冰上预冷；
37.2)处死台湾泥鳅，快速分离肝脏组织，并取30mg-50mg组织样品于2ml离心管中，离心管置于冰浴，事先加入1.5ml rnaiso plus试剂，3颗经depc水浸泡过夜并高压灭菌处理的玻璃珠。加好后使用组织破碎仪破碎至呈无颗粒透明状即可；
38.3)取出离心管，室温静置5min；
39.4)将离心管移至低温高速离心机，12000r/min、4℃离心5min；
40.5)离心后取出，吸取上清液转移到新的1.5ml离心管中；
41.6)向上述匀浆裂解液中加入氯仿，用量为rnaiso plus试剂体积的1/5，盖上离心盖，用手剧烈震荡15s，待充分乳化后，再室温静置5min；
42.7)将离心管移至低温高速离心机，12000r/min、4℃离心15min；
43.8)由离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，无色上清液，中间白色蛋白
质层及带有鲜红颜色的下层有机层，吸取上清液到另一新离心管中；
44.9)向上清液中加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温条件下静置10min；
45.10)于低温离心机中，12000r/min离心，试管底部会出现沉淀；
46.11)rna沉淀的清洗：小心弃去上清液，缓慢地沿管壁加入75％乙醇溶液1ml，轻轻颠倒混匀洗涤管壁，12000r/min、4℃离心5min后小心弃去乙醇；
47.12)于超净工作台中室温干燥沉淀2-5min，加入10-20μl rnase-free water溶解沉淀；
48.13)将充分溶解的rna样品取1-2μl，用1-2％琼脂糖凝胶电泳检测rna的提取结果；
49.14)将充分溶解的rna样品取1-2μl，用紫外分光光度计检测rna浓度与纯度。
50.2、cdna第一链的合成
51.1)台湾泥鳅肝脏cdna第一链的合成使用逆转录试剂盒primescript
tmⅱ1st strand cdna synthesis kit(takara，日本)；记录由紫外分光光度计测定的rna样品浓度。
52.2)在提取rna专用离心管中配制如下反应体系：
[0053][0054]
3)将该反应体系置于pcr仪上42℃2min后，冰上急冷。
[0055]
4)另取提取rna专用离心管中配制10μl如下反应体系：
[0056][0057]
5)混合均匀，置于pcr仪运行程序：37℃15min；85℃15s结束反应。反应液置于冰上继续后续操作或-20℃保存备用。
[0058]
3、cdna基因核心区序列引物设计
[0059]
由ncbi数据库中获取斑马鱼等鱼类elovl5基因全长cdna序列，后进行多重比对，读取这些鱼类保守区域氨基酸序列的保守区域设计合成1对简并引物：
[0060]
f:ctgtggtggtattacttctcc
[0061]
r:actttttccaccacagatatg
[0062]
预期pcr产物片段大小为150bp左右。经合成的引物12000r充分离心，后用去离子双蒸水(ddh2o)将引物溶解至浓度为20μmol/l,置于-20℃条件下保存备用。
[0063]
4、elovl5基因核心片段的pcr扩增
[0064]
1)配制如下60μl pcr反应体系：
[0065][0066]
2)将反应体系混匀，离心后置于pcr仪上，进行pcr反应。台湾泥鳅elovl5基因核心片段pcr扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。注意：配制反应体系时必须在冰上进行。
[0067]
3)pcr纯化产物与pmd-19t载体的连接，小型离心管中5μl反应体系如下：
[0068]
纯化pcr产物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.2μl
[0069]
pmd19-t载体
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.3μl
[0070]
solution
ⅰꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.5μl
[0071]
4)将该5μl体系混合均匀，置于pcr仪上，设置程序16℃40min反应，取全部反应产物转化入dh5α(50μl)感受态细胞中，冰上静置20min，42℃水域90s,冰上冷却2-3min，加入890ul lb培养基，37℃恒温摇床上培养1h，在含有amp的琼脂平板上培养，37℃倒置培养过夜；挑取单菌进行pcr检测。菌落置于5ml lb/amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊；取500μl菌液送往武汉擎科生物公司测序，测序要求为双向测序，并进行校对与拼接，得到台湾泥鳅elovl5基因核心序列。
[0072]
5、elovl5基因5’、3
’‑
race cdna的合成
[0073]
1)5
’‑
race引物的设计
[0074]
根据步骤4中克隆得到的台湾泥鳅elovl5基因cdna核心序列，使用smart race cdna amplification kit(clontech,usa)试剂盒，按照试剂盒说明设计5
’‑
race上游引物如下：
[0075]
扩5’端：
[0076]
outer1：ggcggatccctgcactgaagacat
[0077]
iner1：ctcatactctgtcagtctgagcaccga
[0078]
下游引物upm(通用混合引物universal primer mix)、nup(upm的嵌套引物nesteduniversal primer)由试剂盒提供。
[0079]
2)elovl5基因cdna 5’末端
[0080]
使用smart race cdna amplification kit(clontech,usa)试剂盒，进行5
’‑
racepcr扩增(使用巢式引物扩增)，1st pcr反应体系(10μl体系)如下:
[0081]
ddh2o
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6.3μl
[0082]
10x la pcr buffer(mg
2+
plus)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl
[0083]
dntps
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1μl
[0084]
upm(20μmol/l)
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0.8μl
[0085]
台湾泥鳅皮肤5
’‑
race cdna第一链0.5μl
[0086]
outer1
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0.3μl
[0087]
la taq酶
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0.1μl
[0088]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0089]
嵌套pcr反应(60μl)体系：
[0090][0091]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0092]
3)5
’‑
race pcr产物的pmd-19t载体克隆
[0093]
将5
’‑
race pcr产物按照步骤4中的操作步骤进行pmd-19t载体克隆，最后将阳性克隆送往公司测序，得到台湾泥鳅elovl5基因cdna5’末端序列信息。
[0094]
4)再按照上述方法得到elovl5基因cdna3’末端序列信息。其中，3
’‑
race上游引物如下：
[0095]
扩3’端：
[0096]
outer2：cttcaccatcccgtactgggactggc
[0097]
iner2：tcagtccatcctctgtattctcctcgt
[0098]
1st pcr反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。嵌套pcr94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0099]
6、台湾泥鳅elovl5基因序列信息的确定
[0100]
将步骤4和步骤5中得到的序列拼接，得到台湾泥鳅elovl5基因全长序列信息。该基因全长序列如seq id no：1所示。
[0101]
实施例2elovl5基因的敲除及台湾泥鳅的育种
[0102]
1、crispr/cas9靶位点设计及确认
[0103]
根据靶位点通式：5
’‑
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-ngg-3’(n为任意碱基)及靶位点基本设计原则，在台湾泥鳅elovl5基因的orf序列上，设计elovl5基因靶位点。设计靶位点序列信息如seq id no：2所示。同时在靶位点周围设计如下正反引物进行pcr扩增，
[0104]
f:cttagggttcaaggatggc
[0105]
r:ataaccttggactgacgctt
[0106]
体系如下：
[0107][0108]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0109]
根据实施例1步骤4所述方法得到扩增产物序列信息，然后和靶位点序列比较，发现结果相同，说明靶位点可用，可以进行下一步。
[0110]
2、grna的制备
[0111]
首先，设计含有elovl5基因靶位点序列的grna上游引物(seq id no.3)及与其匹配的下游引物(seq id no.4)：
[0112]
在灭菌pcr管中配制如下反应体系，其中模板dna：p-t7-grna质粒(购自http://www.biovector.net/product/99362.html)：
[0113][0114]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0115]
再利用axygen公司的axyprep pcr清洁试剂盒对产物进行清洗回收，主要步骤如下：
[0116]
1)在pcr产物中加150μl的buffer pcr-a；
[0117]
2)混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，12000
×
g离心1min，弃滤液；
[0118]
3)将制备管置回2ml离心管，加700μl buffer w2，12，000
×
g离心1min，弃滤液；
[0119]
4)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加25μl eluent，室温静置1min。12，000
×
g离心1min洗脱回收dna。
[0120]
然后利用ambion公司的t7 kit试剂盒对洗脱回收dna进行体外转录，主要步骤如下：
[0121][0122]
将上述试剂加入灭菌ep管中，37℃水浴1h，然后加入turbo dnase，37℃水浴15min以去除dna模板，最后用ambion公司的mirvanatmmirna isolation kit进行回收，步骤如下：
[0123]
用rnase-free water将grna转录体系稀释到300μl，加入330μl无水乙醇；
[0124]
2)将溶液加到回收柱中，10000g离心15s；
[0125]
3)加入700μl的mirna wash solution i，离心10s；
[0126]
4)加入500μl的wash solution ii，离心10s；重复一次；
[0127]
5)弃去收集管中的液体，离心1min，去除残余的液体；
[0128]
6)加入适量95℃预热的rnase-free water，最大转速离心30s，收集得到grna溶液，测得浓度为1210ng/μl，零下80℃保存。
[0129]
3、cas9mrna的制备
[0130]
通过xbai单酶切线性化psp6-2snls-spcas9载体(37℃水浴，4h以上)，取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物。以纯化后的线性化cas9质粒为模版，进行体外转录得到cas9mrna，将其纯化后于-80℃保存。保存浓度为830ng/μl。
[0131]
4、体外显微注射
[0132]
注射前一天晚上，挑选2对发育较好的台湾泥鳅，进行人工催产，人工催产药物的剂量为每千克雌亲鱼注射lrh-a
2 40ug、dom 4mg，雄鱼减半。然后将亲本置于水温为27℃的黑暗环境中静养。第二天早上即可进行人工授精，获得受精卵后将其置于显微注射专用培养皿上，用显微注射仪对到达1细胞期的受精卵进行显微注射。之后将注射完毕的受精卵置于28℃恒温箱进行孵化培育。cas9mrna的终浓度为500ng/μl，grna的终浓度为30ng/μl，台湾泥鳅注射的量为2nl，注射部位为动物极。
[0133]
5、elovl5基因敲除鱼的筛选：
[0134]
利用f0代台湾泥鳅的elovl5基因突变体与野生型台湾泥鳅进行繁殖获得f1代，挑选出同一突变类型的f1代进行自交获得f2代，再将f2代的纯合突变体进行自交便可获得elovl5基因敲除的台湾泥鳅泥鳅纯合子(图2、图3)。
[0135]
6、鱼体脂肪酸含量的测定
[0136]
将同一批次繁殖的野生型和敲除型纯合子养至2月龄，将不同基因型的台湾泥鳅捞出，擦干体表水分，记录体重，取组织称重，后期计算体脂率，和组织总脂质含量。然后放置在2ml离心管中，加入1ml脂质抽提试剂，一大两小灭菌后干净的钢珠，与震荡破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)下破碎1min，将破碎后的样品转移至10ml的玻璃管中，再加入1.5ml的甲酯化试剂进行甲酯化，提取脂肪酸，通过气相色谱法检测脂肪酸含量，每组设置3个平行。
[0137]
实验结果显示，敲除型与野生型相比，体内epa与dha含量均有显著差异，与野生型相比敲除型epa、dha含量显著上升，dpa、epa与dha总量显著升高。详细数据见图4、图5。
[0138]
综上所述，本发明是一种简单，高效，周期短，易实施的分子育种技术，且该技术只是破坏本身基因功能，不涉及外来基因，不存在转基因问题，便于推广运用。