本发明涉及一种内切菊粉酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该内切菊粉酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在菊粉降解方面的应用。本发明提供的内切菊粉酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及蔗果寡糖制备等领域。
背景技术：
1、菊粉(inulin)，又名菊糖，是一种来源丰富的可再生原料。菊粉主要来源于植物，包括双子叶植物中的菊科、桔梗科、龙胆科等共11科，以及单子叶植物中的百合科、禾本科。菊粉大量存在于菊芋、菊苣、大丽花这些植物的块根、块茎中，其中菊芋是最为典型的菊粉来源植物，块茎中含有超过70％的菊粉。菊粉是由果糖经β-2,1糖苷键连接而成的直链多糖，在其还原端有一个α-2,1糖苷键连接的葡萄糖残基，聚合度为2-60，分子量在3500-5500之间。目前我国菊粉产业在食品工业中多停留在初加工层面，亟需高值化加工技术，而将菊粉转化为蔗果寡糖是菊粉深加工产业的重要前提。
2、菊粉酶(inulinase)是一类能水解β-2,1-d-果聚糖果糖苷键的水解酶，根据作用底物方式的不同，分为外切菊粉酶和内切菊粉酶。外切菊粉酶可以从菊粉分子的非还原末端催化水解下β-d-呋喃果糖残基,其底物可为菊粉、蔗糖、果聚糖；内切菊粉酶可以用来生产低聚果糖。聚合度为2～7的低聚果糖是一种功能性多糖，有多种生理功能，如改善肠道内微生物区系，使肠道菌群中双歧杆菌等有益菌数量增加。
3、菊粉酶的来源十分广泛，许多植物、动物的消化道以及微生物中均能产生菊粉酶。然而，植物和动物消化道产生的菊粉酶含量较低，无法到达工业生产的要求。相较而言，微生物来源的菊粉酶以生产成本低、产酶周期短、产酶量高等优点成为国内外研究的热点。根据报道，酵母菌约有10个属20余种、丝状真菌约有17个属40余种、细菌约有12个属10余种都能够产生菊粉酶。其中，酵母菌相较于丝状真菌和细菌可以产生更多、更高活性的菊粉酶。但是酵母菌来源的菊粉酶均为外切型菊粉酶，尚未发现内切型菊粉酶。丝状真菌中的曲霉菌属(aspergillus sp.)和青霉菌属(penicillium sp.)也是很好的生产菊粉酶的来源，既能产生内切酶，也能产生外切酶。其中，曲霉菌属是研究最多的真菌微生物。尽管细菌来源的菊粉酶产量及活性远不及酵母菌和丝状真菌，并不是生产菊粉酶的首选微生物，但某些菌株能在较苛刻的环境下生长，产生的菊粉酶具有更宽泛的活性范围，如嗜热脂肪芽孢杆菌g.stearothermophilus菌株生长温度在41-69℃之间，所产菊粉酶具有酶活力的温度范围为30-75℃之间，最适温度为60℃。因此，细菌来源的菊粉酶在工业生产中具有一定的应用价值。然而，细菌来源的菊粉酶大部分为外切型，仅有少数为内切型。相对于内切菊粉酶对菊粉降解所产生的一系列不同聚合度的蔗果寡糖，外切菊粉酶对菊粉的降解产物相对单一，对菊粉的高值化利用产生不便。因此，细菌来源的内切菊粉酶具有一定的研究价值。
技术实现思路
1、本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于黄杆菌属(flavobacterium sp.)的内切菊粉酶fsinua及其编码基因。
2、本发明的第二个目的是提供一种制备新型内切菊粉酶fsinua的方法。
3、本发明的第三个目的是提供含有所述的内切菊粉酶fsinua基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。
4、本发明的第四个目的是提供一种新型内切菊粉酶fsinua在菊粉降解中的应用。
5、本发明所提供的内切菊粉酶fsinua，来源于黄杆菌属(flavobacterium sp.s20),保藏地址：中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmcc no.5026，保藏日期2011年07月05日，从中扩增出的内切菊粉酶fsinua编码基因(命名为fsinua)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：
6、1)序列表中seq id no.1的脱氧核糖核酸(dna)序列；
7、2)编码序列表中seq id no.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；
8、3)与seq id no.1限定的脱氧核糖核酸(dna)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解菊粉的蛋白质的脱氧核糖核酸(dna)序列；
9、4)对序列表中seq id no.1的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切菊粉酶活性的核苷酸序列。
10、本发明还提供了内切菊粉酶fsinua的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：
11、1)序列表中的seq id no.2从氨基端开始的第1-829位氨基酸残基序列；
12、2)将序列表中的seq id no.2从氨基端开始的第1-829位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有内切菊粉酶活性不变的氨基酸序列。
13、本发明的内切菊粉酶fsinua的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的内切菊粉酶fsinua的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。
14、制备重组酶fsinua的方法，是将内切菊粉酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切菊粉酶。
15、上述内切菊粉酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：
16、1)具有序列表中seq id no.1的脱氧核糖核酸(dna)序列；
17、2)编码seq id no.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；
18、3)对序列表中seq id no.1的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切菊粉酶活性的核苷酸序列；
19、所述的重组表达内切菊粉酶fsinua的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体等。
20、用于重组表达内切菊粉酶fsinua的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。
21、本发明的内切菊粉酶fsinua的基因序列是通过pcr技术从黄杆菌属(flavobacterium sp.s20)中克隆得到。该基因编码区长2490bp，包含多个结构域。
22、本发明提供的内切菊粉酶在降解菊粉中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：
23、1)在断裂菊粉的糖苷键，获得单糖、果寡糖或蔗果寡糖中的应用；
24、2)在断裂果聚糖的糖苷键，获得单糖或果寡糖中的应用；
25、3)与其他菊粉酶或果聚糖酶混合后，在协同断裂果聚糖糖苷键方面应用。
26、本发明从大肠杆菌重组表达获得的内切菊粉酶fsinua，可以高效降解菊粉，以菊粉为底物时，在37℃、ph7.4的条件下具有较好活性，比活为60u/mg。
27、本发明的内切菊粉酶fsinua可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及蔗果寡糖的制备等领域。
28、本发明公开一种来源于黄杆菌属(flavobacterium sp.)的内切菊粉酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因组挖掘及基因工程的技术方法，将该内切菊粉酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的内切菊粉酶，能有效降解菊粉。