1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产己二酸的重组菌、构建方法和应用。
背景技术：
2.己二酸又称肥酸，是一种重要的有机二元酸，能够发生成盐反应、酯化反应、酰胺化反应等，并能与二元胺或二元醇缩聚成高分子聚合物等。己二酸是工业上具有重要意义的二元羧酸，在化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造等方面都有重要作用，产量居所有二元羧酸中的第二位。己二酸主要用作尼龙66和工程塑料的原料，也用于生产各种酯类产品，还用作聚氨基甲酸酯弹性体的原料，各种食品和饮料的酸化剂，其作用有时胜过柠檬酸和酒石酸，也是医药、酵母提纯、杀虫剂、粘合剂、合成革、合成染料和香料的原料。
3.目前己二酸的生产方法主要为微生物法，具有无污染，成本低，产品特异型好等优势。如张熙等(酿酒酵母异源合成己二酸,食品与发酵工业,2020,46(7):1-9.doi:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023231)以酿酒酵母为底盘生物，将来源于嗜热菌thermobifidafusca b6中的己二酸逆降解途径基因搭配不同的酿酒酵母组成型启动子和终止子，构建在3个穿梭质粒上，并导入宿主细胞，成功实现了己二酸的异源合成；中国专利cn201710117371.1以大肠杆菌bl21(de3)或敲除了atob基因的大肠杆菌bl21(de3)为宿主，分模块表达来自褐色喜热裂孢菌的异源基因，摇瓶发酵产量为1.64g/l，5l发酵罐产量达4.34g/l。但以上生产己二酸的工程菌有构建过程复杂、安全性较低、生产成本高、己二酸产量低等问题。因此，现有技术当中己二酸的生产还有很大的改进空间。
技术实现要素：
4.为解决上述技术问题，本发明通过分子生物学手段，利用细胞不对称分裂基因，调节微生物群落，便于代谢分工。通过引入靶向细胞不对称分裂的调控线路，扩大了细胞的功能，实现己二酸积累。
5.本发明的第一个目的是提供一种生产己二酸的重组菌，该重组菌表达调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控己二酸生产的靶点基因；
6.调控细胞不对称分裂的靶点基因包括编码细胞骨架蛋白popz的基因popz；调控己二酸生产的靶点基因包括编码降解酶长链脂肪酸转运蛋白fadl的基因fadl、脂酰coa合成酶fadd的基因fadd、脂酰coa脱氢酶fade的基因fade、脂肪酸氧化酶复合体α亚基fadb的基因fadb、脂肪酸氧化酶复合体β亚基fada的基因fada、1,4-二羟基-2-萘甲酰coa水解酶ydii的基因ydii、烷烃-1-单加氧酶alkb的基因alkb、红素氧还蛋白-1alkg的基因alkg、红素氧还蛋白-nad
+
还原酶alkt的基因alkt、6-羟基己酸脱氢酶chnd的基因chnd和醛脱氢酶chne的基因chne。
7.进一步地，以大肠杆菌atcc 8739为宿主，该菌株敲除了脂肪酸代谢调控蛋白基因fadr。
8.进一步地，该重组菌可以通过rbs序列调控细胞不对称分裂的靶点基因或调控己
二酸生产的靶点基因的表达强度。其中，不同强度的rbs序列包括rbs34、rbs29、rbs32、rbs30或rbs64，优选为rbs34。本发明可通过不同rbs序列连接基因片段，从而调节该基因的表达强度，在实际应用时，可根据需要连接不同的rbs序列以调控合成途径中相关蛋白的产量从而影响下游蛋白的合成，实现微生物群落的定制化。
9.进一步地，以petac-popz、petac-fadl-fadd-fade-popz、pem-fadb-fada-ydii-popz和ptet-alkb-alkg-alkt-chnd-chne为表达载体。重组质粒petac-popz以petac为载体表达popz基因，重组质粒petac-fadl-fadd-fade-popz以petac为载体依次表达fadl、fadd、fade和popz基因，重组质粒pem-fadb-fada-ydii-popz以pem为载体依次表达fadb、fada、ydii和popz基因，重组质粒ptet-alkb-alkg-alkt-chnd-chne以ptet为载体依次表达alkb、alkg、alkt、chnd和chne基因。
10.petac-popz表达了popz基因，重组质粒petac-popz的构建方法为：以petac质粒为基础，采用bamh1和sal1双酶切，通过同源重组的方法连接细胞骨架蛋白popz的popz基因，获得重组质粒petac-popz。
11.petac-fadl-fadd-fade-popz表达了fadl、fadd、fade和popz基因，重组质粒petac-fadl-fadd-fade-popz的构建方法为：以petac质粒为基础，采用bamh1和sal1双酶切，将fadl和fadd以rbs34为同源臂融合形成fadl-fadd片段，同样的方法获得带有rbs34的fade-popz片段。然后通过多片段同源重组将fadl-fadd和fade-popz连接到petac质粒，获得重组质粒petac-fadl-fadd-fade-popz。
12.pem-fadb-fada-ydii-popz表达了fadb、fada、ydii和popz基因，重组质粒pem-fadb-fada-ydii-popz的构建方法为：以pem质粒为基础，采用avr11和sal1双酶切，将fadb和fada以rbs34为同源臂融合形成fadb-fada片段，同样的方法获得带有rbs34的ydii-popz片段。然后通过多片段同源重组将fadb-fada和ydii-popz连接到pem质粒，获得重组质粒pem-fadb-fada-ydii-popz。
13.ptet-alkb-alkg-alkt-chnd-chne表达了alkb、alkg、alkt、chnd和chne基因，重组质粒ptet-alkb-alkg-alkt-chnd-chne的构建方法为：以ptet质粒为基础，采用bamh1和sal1双酶切，将alkb和alkg以rbs34为同源臂融合形成alkb-alkg片段，同样的方法获得带有rbs34的alkt-chnd-chne片段。然后通过多片段同源重组将alkb-alkg和alkt-chnd-chne连接到ptet质粒，获得重组质粒ptet-alkb-alkg-alkt-chnd-chne。
14.进一步地，编码降解酶长链脂肪酸转运蛋白fadl的基因fadl的核苷酸序列如seq id no.1所示。
15.进一步地，编码脂酰coa合成酶fadd的基因fadd的核苷酸序列如seq id no.2所示。
16.进一步地，编码脂酰coa脱氢酶fade的基因fade的核苷酸序列如seq id no.3所示。
17.进一步地，编码脂肪酸氧化酶复合体α亚基fadb的基因fadb的核苷酸序列如seq id no.4所示。
18.进一步地，编码脂肪酸氧化酶复合体β亚基fada的基因fada的核苷酸序列如seq id no.5所示。
19.进一步地，编码1,4-二羟基-2-萘甲酰coa水解酶ydii的基因ydii的核苷酸序列如
fadb-fada-ydii-popz和重组质粒ptet-alkb-alkg-alkt-chnd-chne转化入大肠杆菌atcc8739中构建得到生产己二酸的重组菌。
36.进一步地，不同基因片段连接时，以不同强度的rbs序列为同源臂融合基因片段。
37.本发明的第三个目的是提供一种生产己二酸的方法，采用上述重组菌发酵生产己二酸。
38.进一步地，以脂肪酸为底物。
39.进一步地，发酵的培养基包括m9无机盐培养基。
40.进一步地，发酵的条件为35-38℃，200-220rpm，菌株发酵初始od
600
为0.04-0.1，发酵70-160h；或发酵的条件为35-38℃，480-530rpm，接种量为5-10％，装液量为30-50％，ph为6.0-7.0，菌株发酵初始od
600
为0.04-0.1，通气量为1-2vvm，发酵80-160h。
41.进一步地，调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控己二酸生产的靶点基因的表达方式为游离表达。
42.本发明提供的生产己二酸的重组菌在生物、制药、食品或化工领域内的应用均有巨大潜力，如用于制备己二酸或含有己二酸的产品、制备重组质粒所含基因对应的蛋白或融合蛋白等。
43.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
44.本发明构建的重组菌表达调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控己二酸生产的靶点基因，能够实现以脂肪酸为底物从头合成己二酸，同时提供了一种定制化微生物群落的方法，该方法简单易操作，对细胞毒性小。通过构建己二酸生产工程菌株和引入定制化微生物群落，己二酸含量高达5.2g/l，具有较好的应用前景。
45.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
46.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
47.图1为定制化微生物群落的设计；
48.图2为己二酸的生产路径；
49.图3为摇瓶发酵中己二酸含量的变化；
50.图4为7.5l发酵罐中己二酸含量的变化。
具体实施方式
51.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
52.下述实施例中所涉及的材料与方法如下：
53.质粒构建采用经典分子生物手段进行。
54.细胞形态学参数检测使用荧光显微镜(nikon microscop,80i)进行测定，控制环境温度30度。
55.种子培养基：lb培养基，成分包含蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。
56.发酵培养基：m9无机盐培养基，成分包含葡萄糖50g/l、cacl2·
2h2o 15mg/l、微量元素液0.667ml/l、灭菌后补加mgso4·
7h2o 0.25g/l，v
b1 0.5mg/l，盐酸甜菜碱1mm。微量元素液的配置方法为fecl3·
6h2o 2.4g/l、cocl2·
6h2o 0.3g/l、cucl
2 0.15g/l、zncl2·
4h2o 0.3g/l、namno
4 0.3g/l、h3bo
3 0.075g/l、mncl2·
4h2o 0.5g/l，溶于0.1m hcl中配制。
57.发酵样品制备：取发酵液样品，12000rpm离心5min，取上清液稀释后，过0.22μm水系膜过滤，滤液作为用来液相色谱分析。
58.己二酸含量的测定正己酸和己二酸均采用气相色谱质谱联用仪(gc-ms)，检测条件：初始温度为50℃，保持1min；按照8℃
·
min-1
的速度升高至180℃；按照10℃
·
min-1
的速度升高至240℃，保持5min。载气为氦气，流速为1m l
·
min-1
，进样量为1μl。
59.实施例1定制化微生物群落的设计
60.将获得的重组质粒petac-popz分别通过全质粒pcr扩增，添加rbs34、rbs29、rbs32、rbs30和rbs64，进而获得petac-rbs34-popz、petac-rbs29-popz、petac-rbs32-popz、petac-rbs30-popz和petac-rbs64-popz质粒，分别导入感受态细胞e.coli jm109中，获得含有不同rbs强度的petac-popz质粒。
61.在lb培养基中，使用酶标仪对上述菌株进行荧光强度的评估。结果如图1所示。由图1a、1b可知，petac-gfp-popz质粒含有不同强度rbs，可以有效调控基因表达情况，即调控不同比例的gfp菌株。其中，含有petac-rbs34-popz、petac-rbs29-gfp-popz、petac-rbs32-gfp-popz、petac-rbs30-gfp-popz和petac-rbs64-gfp-popz质粒的e.coli jm109，gfp荧光菌株的占比分别达到53.1％、47.2％、36.9％、29.6％和34.1％。研究结果表明，调节rbs强度能够调控gfp荧光菌株的占比，进而完成定制化微生物群落的设计。
62.实施例2摇瓶发酵生产己二酸
63.将已经构建好的表达己二酸合成路径(图2)质粒petac-fadl-fadd-fade-popz、pem-fadb-fada-ydii-popz和ptet-alkb-alkg-alkt-chnd-chne导入大肠杆菌8739感受态细胞中，获得带有petac-fadl-fadd-fade-popz、pem-fadb-fada-ydii-popz和ptet-alkb-alkg-alkt-chnd-chne质粒的己二酸生产菌株g1s1，利用脂肪酸为底物生产己二酸。
64.己二酸摇瓶发酵条件。将前培养的e.coliaa0306菌液转接至30ml种子培养基中培养12h，取2ml种子液转接至50ml发酵培养基中，培养8h后，温度转变至30℃。通过碳酸钙调控ph。每12h取一次样，分别测定发酵液中的脂肪酸、己二酸含量。
65.将上述己二酸生产菌株置于m9培养基中培养，发酵的条件为37℃，200-rpm，菌株发酵初始od
600
为0.5，发酵120h，对含量进行鉴定。结果如图3所示，随着细菌培养时间的延长，对照菌株ct的己二酸产量达到1.21g/l，其中g1s1菌株的己二酸产量达到1.82g/l，比对照菌株ct提高49.59％。
66.实施例3发酵罐发酵生产己二酸
67.在7.5l发酵罐中检测g1s1菌株的发酵性能。装液量为3.5l，ph为7.0，压力为1mpa温度恒定37℃，450rpm，初始接种od
600
为0.5，通气量1vvm，发酵周期为140h。
68.己二酸的放大生产在7.5-l发酵罐中进行。将前培养的e.coliaa0306菌液转接至50ml种子培养基中培养8h，取300ml种子液转接至2l发酵培养基中，培养6h后，温度转变至30℃，通过级联搅拌将溶氧控制在35％饱和度以上，氨水调控ph。每12h取一次样，分别测定发酵液中的脂肪酸、己二酸含量。
69.如图4所示，发酵结束时，己二酸的浓度达到5.2g/l。
70.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
71.72.73.74.75.76.77.