枇杷原浆啤酒酵母发酵方法与流程

1.本发明涉及酵母发酵工艺，特别是涉及枇杷原浆啤酒酵母发酵方法。


背景技术：

2.枇杷，别名：芦橘、金丸、芦枝，枇杷与大部分果树不同，在秋天或初冬开花，果子在春天至初夏成熟，比其它水果都早，因此被称是“果木中独备四时之气者”，成熟的枇杷味道甜美，营养颇丰，富含各种果糖、葡萄糖、钾、磷、铁、钙以及维生素a、b、c等，中医认为枇杷不论是叶、果和核都含有扁桃苷，且有润肺、止咳、止渴的功效，枇杷做原浆可生产果味啤酒，啤酒的生产需要使用到酵母。
3.现有技术存在以下不足：现有酵母发酵时仅仅选用单一的培养基进行培养，这样在酵母菌筛选时自由一道工序，容易导致选出的酵母菌出现发酵性能差以及活性差的问题，不能适用于枇杷啤酒的发酵。


技术实现要素：

4.本发明提供枇杷原浆啤酒酵母发酵方法，以解决背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：枇杷原浆啤酒酵母发酵方法，所述方法包括以下步骤：
6.s1：培养基选择
7.s1.1、富集培养基：麦芽浸粉加入4倍水后以60℃温度保温糖化，用碘液检验至糖结束，用蔗糖调糖至10bx；
8.s1.2、斜面保藏培养基：含葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l、酵母膏10g/l、琼脂20g/l，121℃灭菌15min；
9.s1.3、杜氏管发酵培养基：含葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l、酵母膏10g/l，121℃灭菌15min；
10.s1.4、ttc显色培养基：含葡萄糖6g/l、琼脂15g/l、ttc0.4g/l、蛋白胨20g/l、酵母膏10g/l，121℃灭菌15min。
11.s2：酵母菌富集培养
12.选择成熟干净的枇杷果肉打浆，添加二氧化硫100mg/l，果胶酶100mg/l30℃处理3h，用蔗糖调糖度为21brix，自然ph，在500ml无菌三角瓶中添加打浆液300ml，28℃发酵直到无气泡产生，取10ml枇杷果浆自然发酵液用无菌水稀释至10-1
，再逐步稀释到10-6
，振荡5min后，吸取0.1ml上清液涂布麦芽汁琼脂固体培养基上，28℃恒温48h，待菌株长出菌落后，挑取表面光滑奶油状，有酒香的单菌落划线分离2-3次，最后将单个典型菌落移植于斜面保藏培养基中保存；
13.优选的，分离的酵母菌菌落的颜色是白色或乳白色的，中间的颜色与边缘的颜色相同，散发出愉悦的酒香味，显微镜下观察到酵母菌有正圆形、椭圆形、短杆状等，繁殖方式为一端出芽。
14.s3：酵母菌筛选
15.s3.1、一级筛选：在斜面保藏培养基中接入分离的各菌株，24h在长出的菌落上覆盖一层含0.5％ttc显色剂的斜面保藏培养基，形成双层培养基，酒精浓度不一的酵母菌落会显示各种颜色，深红色是高浓度酒精的菌落，从中挑选具有良好性状和深色的酵母菌株；
16.优选的，经过24h培养和3h显色剂显色后，有12株酵母菌呈红色，有48株酵母菌呈深红色，使用60株产酒能力较强的酵母菌进行二次筛选；
17.s3.2、二级筛选：在含有杜氏小管的杜氏管发酵培养基中接入一级筛选的菌株，分别在24h、48h杜氏管中出现气体的情况，根据产气时间和产气量的多少筛选出耐高温和发酵性能好、发酵快的酵母菌株；
18.优选的，培养48h后有30株酵母菌产生气体，其中产气充满杜氏管体积的有13株，25株酵母菌的试管会出现气泡，且底部均有沉淀，证明这部分酵母菌的生长和发酵速率较强，对这25株菌进行三级筛选；
19.s3.3、三级筛选：在枇杷果浆中接入菌种，28℃培养7d，完成酵母菌的发酵；
20.优选的，在枇杷果浆中接种活化的25株酵母菌，发酵7d后，25瓶发酵液中，发出酒味和枇杷香味。
21.优选的，温度耐受性试验：酵母菌在25-40℃的选定范围内，发酵酒精度先升高，31℃后又逐渐下降，由于低温抑制酶的活性，影响细胞的代谢活性并抑制酵母菌的繁殖，因此在温度低于28℃酒精的产率较低，而超过31℃时，酶活性降低甚至失去活性，导致酵母菌的发酵能力降低，所以此酵母菌最佳的生长温度为28-31℃；
22.优选的，ph对酵母菌的影响：在ph为4.5-5.5时，随着ph的升高，该酵母菌产酒精能力逐渐增强，在ph为5.5时，产酒精能力最强，在ph大于5.5时，酵母菌产酒精能力逐渐减弱，由此可见，该酵母菌在较低的ph条件下，酵母菌发生应急反应，细胞内产生大量的活性氧，这些活性氧气会攻击细胞中膜脂、dna等，损伤细胞，因此酵母菌最佳发酵ph为5.5；
23.优选的，初始糖度对酵母菌的影响：在初始糖含量为17-33bx时，该酵母菌产酒能力随着糖度的增加而提高，在糖度为29bx时，产酒精能力最高，当糖度大于29bx时，外部环境的渗透压也随之增加，从而抑制酵母菌细胞代谢酶的活性，所以产酒能力开始下降，因此酵母菌最佳发酵初始糖度为29bx；
24.优选的，二氧化硫耐受性：添加so2不仅能抑菌杀菌，还能抗氧化和澄清果汁，当so2浓度小于80mg/l时，发酵酒精度随so2浓度的升高而升高，当so2浓度为80mg/l时，该酵母菌酒产酒精能力最高，当so2浓度大于80mg/l时，随着so2浓度的增加而逐渐降低，因此最适so2添加量为80mg/l；
25.优选的，酒精度耐受性：同一初始酒精度的酵母菌随着时间的增长，酵母菌吸光度均增大，说明酵母菌在生长繁殖，培养基中酵母菌浓度增大，对于不同的初始酒精浓度，随着初始酒精含量的增加，在560nm可见光下的吸光度值随着时间的增加幅度下降，说明初始酒精度对酵母菌的生长产生了抑制，在初始酒精度达到7％的时候，酵母菌48h吸光度增加量明显下降，此时酵母菌的生长被抑制，在初始酒精度为11％时，酵母菌吸光度增长很小，已接近酵母菌酒精度耐受性极限。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.本发明通过枇杷汁自然发酵、富集培养、三级筛选，得到酵母菌，对酵母菌进行性
能测试结果表明，该酵母菌在25-35℃能正常生长，适发酵温度在28-31℃，当初始糖度为29bx时，产酒精能力最高，ph5.5时，酒精能力最强，so2添加量为80mg/l时，产酒精能力达到最高，初始酒精度为11％时，接近酵母菌酒精度耐受性的酵母菌的传代稳定性良好，产酒精能力稳定，酒精度稳定在10-11％，可用枇杷汁啤酒发酵。
附图说明
28.图1为本发明的整体工艺流程图。
29.图2为本发明步骤1的工艺流程图。
30.图3为本发明步骤2的工艺流程图。
31.图4为本发明酵母菌的个体形态图。
具体实施方式
32.下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
33.请参阅附图1，枇杷原浆啤酒酵母发酵方法，所述方法包括以下步骤：
34.实施例1
35.请参阅附图2，s1：培养基选择
36.s1.1、富集培养基：麦芽浸粉加入4倍水后以60℃温度保温糖化，用碘液检验至糖结束，用蔗糖调糖至10bx；
37.s1.2、斜面保藏培养基：含葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l、酵母膏10g/l、琼脂20g/l，121℃灭菌15min；
38.s1.3、杜氏管发酵培养基：含葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l、酵母膏10g/l，121℃灭菌15min；
39.s1.4、ttc显色培养基：含葡萄糖6g/l、琼脂15g/l、ttc0.4g/l、蛋白胨20g/l、酵母膏10g/l，121℃灭菌15min。
40.实施例2
41.s2：酵母菌富集培养
42.选择成熟干净的枇杷果肉打浆，添加二氧化硫100mg/l，果胶酶100mg/l30℃处理3h，用蔗糖调糖度为21brix，自然ph，在500ml无菌三角瓶中添加打浆液300ml，28℃发酵直到无气泡产生，取10ml枇杷果浆自然发酵液用无菌水稀释至10-1
，再逐步稀释到10-6
，振荡5min后，吸取0.1ml上清液涂布麦芽汁琼脂固体培养基上，28℃恒温48h，待菌株长出菌落后，挑取表面光滑奶油状，有酒香的单菌落划线分离2-3次，最后将单个典型菌落移植于斜面保藏培养基中保存；
43.分离的酵母菌菌落的颜色是白色或乳白色的，中间的颜色与边缘的颜色相同，散发出愉悦的酒香味，显微镜下观察到酵母菌有正圆形、椭圆形、短杆状等，繁殖方式为一端出芽。
44.实施例3
45.请参阅附图3，s3：酵母菌筛选
46.s3.1、一级筛选：在斜面保藏培养基中接入分离的各菌株，24h在长出的菌落上覆
盖一层含0.5％ttc显色剂的斜面保藏培养基，形成双层培养基，酒精浓度不一的酵母菌落会显示各种颜色，深红色是高浓度酒精的菌落，从中挑选具有良好性状和深色的酵母菌株；
47.经过24h培养和3h显色剂显色后，有12株酵母菌呈红色，有48株酵母菌呈深红色，使用60株产酒能力较强的酵母菌进行二次筛选；
48.s3.2、二级筛选：在含有杜氏小管的杜氏管发酵培养基中接入一级筛选的菌株，分别在24h、48h杜氏管中出现气体的情况，根据产气时间和产气量的多少筛选出耐高温和发酵性能好、发酵快的酵母菌株；
49.培养48h后有30株酵母菌产生气体，其中产气充满杜氏管体积的有13株，25株酵母菌的试管会出现气泡，且底部均有沉淀，证明这部分酵母菌的生长和发酵速率较强，对这25株菌进行三级筛选；
50.请参阅附图4，s3.3、三级筛选：在枇杷果浆中接入菌种，28℃培养7d，完成酵母菌的发酵；在枇杷果浆中接种活化的25株酵母菌，发酵7d后，25瓶发酵液中，发出酒味和枇杷香味。
51.实施例4
52.温度耐受性试验：酵母菌在25-40℃的选定范围内，发酵酒精度先升高，31℃后又逐渐下降，由于低温抑制酶的活性，影响细胞的代谢活性并抑制酵母菌的繁殖，因此在温度低于28℃酒精的产率较低，而超过31℃时，酶活性降低甚至失去活性，导致酵母菌的发酵能力降低，所以此酵母菌最佳的生长温度为28-31℃；
53.ph对酵母菌的影响：在ph为4.5-5.5时，随着ph的升高，该酵母菌产酒精能力逐渐增强，在ph为5.5时，产酒精能力最强，在ph大于5.5时，酵母菌产酒精能力逐渐减弱，由此可见，该酵母菌在较低的ph条件下，酵母菌发生应急反应，细胞内产生大量的活性氧，这些活性氧气会攻击细胞中膜脂、dna等，损伤细胞，因此酵母菌最佳发酵ph为5.5；
54.初始糖度对酵母菌的影响：在初始糖含量为17-33bx时，该酵母菌产酒能力随着糖度的增加而提高，在糖度为29bx时，产酒精能力最高，当糖度大于29bx时，外部环境的渗透压也随之增加，从而抑制酵母菌细胞代谢酶的活性，所以产酒能力开始下降，因此酵母菌最佳发酵初始糖度为29bx；
55.二氧化硫耐受性：添加so2不仅能抑菌杀菌，还能抗氧化和澄清果汁，当so2浓度小于80mg/l时，发酵酒精度随so2浓度的升高而升高，当so2浓度为80mg/l时，该酵母菌酒产酒精能力最高，当so2浓度大于80mg/l时，随着so2浓度的增加而逐渐降低，因此最适so2添加量为80mg/l；
56.酒精度耐受性：同一初始酒精度的酵母菌随着时间的增长，酵母菌吸光度均增大，说明酵母菌在生长繁殖，培养基中酵母菌浓度增大，对于不同的初始酒精浓度，随着初始酒精含量的增加，在560nm可见光下的吸光度值随着时间的增加幅度下降，说明初始酒精度对酵母菌的生长产生了抑制，在初始酒精度达到7％的时候，酵母菌48h吸光度增加量明显下降，此时酵母菌的生长被抑制，在初始酒精度为11％时，酵母菌吸光度增长很小，已接近酵母菌酒精度耐受性极限。
57.实施例5
58.通过枇杷汁自然发酵、富集培养、三级筛选，得到酵母菌，对酵母菌进行性能测试结果表明，该酵母菌在25-35℃能正常生长，适发酵温度在28-31℃，当初始糖度为29bx时，
产酒精能力最高，ph5.5时，酒精能力最强，so2添加量为80mg/l时，产酒精能力达到最高，初始酒精度为11％时，接近酵母菌酒精度耐受性的酵母菌的传代稳定性良好，产酒精能力稳定，酒精度稳定在10-11％，可用枇杷汁啤酒发酵。
59.上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。