一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶

一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶
1.技术领域
2.本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶。


背景技术：

3.植酸酶（phytase），即肌醇六磷酸磷酸水解酶（myo
‑
inositol hexakisphosphate phosphohydrolases）是一类能够催化植酸盐水解为肌醇、肌醇磷酸酯和无机磷酸盐的磷酸酶。用植酸酶对动物饲料进行预处理，可以提高无机磷的利用率，去除植酸的抗营养作用，从而改善食品/饲料的营养质量，减少磷污染。具有高热稳定性的植酸酶有着巨大的市场需求和商业价值。
4.spytag是一个多肽段，spycatcher是与之相对应的一个蛋白质，它们之间能够重组，并自发形成异肽键偶联，这就将蛋白质组装和化学反应结合在一起，产生稳定的分子自组装体。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种热稳定性提高的融合植酸酶。
6.本发明的再一目的是提供一种提高植酸酶的热稳定的方法。
7.本发明的再一目的是提供上述融合植酸酶的编码基因。
8.本发明的再一目的是提供包含上述融合植酸酶编码基因的重组载体。
9.本发明的再一目的是提供包含上述融合植酸酶编码基因的重组菌株。
10.本发明的再一目的是提供制备热稳定性提高的植酸酶的方法。
11.根据本发明的具体实施方式，对来源于yersinia intermedia的氨基酸序列如seq id no:1所示的野生型植酸酶y4与肽标签spytag/spycatcher进行融合表达，从而获得所述植酸酶融合蛋白。
12.根据本发明的具体实施方式，将氨基酸序列如seq id no:1所示的野生型植酸酶通过linker（gsggsg）与肽标签spytag/spycatcher进行融合表达，从而获得所述融合植酸酶。
13.根据本发明的具体实施方式，热稳定性提高的融合植酸酶具有如seq id no:2所示的氨基酸序列，由560个氨基酸组成。
14.根据本发明的具体实施方式，还提供了编码上述热稳定性提高的融合植酸酶的基因，核苷酸序列如seq id no:3所示，共为1683 bp（包含终止密码子）。
15.根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述融合植酸酶编码基因的重组载体，所述重组表达载体的出发载体具体为ppiczαa，所述重组表达载体具体为ppiczαa
‑
y4
‑
spy。
16.根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述融合植酸酶编码基因的重组菌株，所述重组菌的出发菌株具体为毕赤酵母gs115(ppiczαa
‑
y4)，所述重组菌株具体为gs115(ppiczαa
‑
y4
‑
spy)。
17.根据本发明的具体实施方式，制备热稳定性提高的植酸酶的方法，包括以下步骤：1）制备包含上述融合蛋白编码基因的重组载体；2）以所述重组载体转化宿主，获得重组菌株；3）发酵培养所述宿主，诱导表达并分离纯化植酸酶。
18.本发明的融合植酸酶与野生型植酸酶相比，融合植酸酶热稳定性增强，100℃处理5min仍保留42%左右的活性，而野生酶活性已基本消失。
19.本发明主要是通过将野生型植酸酶y4与肽标签spytag/spycatcher进行融合表达，从而获得所述环化融合蛋白y4
‑
spy，实现提高植酸酶热稳定性的目的。引入肽标签spytag/spycatcher后显著提高了植酸酶y4的热稳定性。本发明提供了一种热稳定性提高的适合于在能源、食品和饲料等领域中应用的融合植酸酶，有着非常广阔的应用前景。
附图说明
20.图1显示野生型与融合植酸酶的比活；图2显示野生型与融合植酸酶的最适温度；图3显示野生型与融合植酸酶在100℃下处理的热稳定性；图4显示木聚糖酶与融合木聚糖酶在60℃下处理10 min后的剩余酶活。
具体实施方式
21.试验材料和试剂1、菌株及载体：表达宿主为pichia pastoris gs115，表达质粒载体为ppiczαa。
22.2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶购自takara公司和new england biolabs (neb) 公司，t4 dna连接酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
23.3、大肠杆菌培养基lb（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% nacl，ph自然）。毕赤酵母培养基ypd（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，ph自然）；bmgy (1%酵母提取物，2%蛋白胨，1%甘油，1.34% ynb，0.00004%生物素，ph自然)；bmmy（1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.5%甲醇，1.34% ynb，0.00004%生物素，ph自然）。
24.说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
25.实施例1、重组菌株gs115(ppiczαa
‑
y4
‑
spy)的制备首先通过ncbi网站获得肽标签spytag/spycatcher的氨基酸序列，之后由北京六合华大基因科技有限公司进行基因合成。对合成的基因spy和质粒ppiczαa使用限制性内切酶eco ri和not i进行双酶切，通过t4 dna连接酶将两者连接，获得重组质粒ppiczαa
‑
spy。
26.之后采用pcr的方式扩增植酸酶基因y4和ppiczαa
‑
spy，pcr所用引物如表1所示。
27.表1
其中，y4
‑
f及y4
‑
r用于扩增植酸酶野生型y4的基因编码序列；y4
‑
spycat
‑
f和spytag
‑
y4
‑
r用于扩增质粒ppiczαa
‑
spy。
28.扩增结束后，将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，y4与ppiczαa
‑
spy条带的理论大小分别为1254 bp、4020 bp，对大小正确的条带进行回收。
29.回收产物y4与ppiczαa
‑
spy使用clonexpress ultra one step cloning kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行重组以获得重组质粒ppiczαa
‑
y4
‑
spy，具体操作按说明书进行，重组产物转化大肠杆菌trans1
‑
t1感受态细胞并测序验证。
30.待测序正确后，提取重组质粒ppiczαa
‑
y4
‑
spy，利用限制性内切酶pme i进行线性化，产物纯化回收并电击转化毕赤酵母gs115感受态细胞，获得重组菌株毕赤酵母gs115(ppiczαa
‑
y4
‑
spy)。
31.实施例2、野生型植酸酶y4及融合蛋白y4
‑
spy的制备1.蛋白的诱导表达将得到的重组表达菌株接种至ypd培养基中进行种子培养，200 rpm，30℃培养48 h后，以1%接种量转接至bmgy培养基中，200 rpm，30℃培养48 h。之后4500 rpm离心5 min，弃上清，收集菌体并加入含有0.5%甲醇的bmmy培养基进行诱导表达，每12 h补加0.5%甲醇，共诱导48 h。
32.2.蛋白的纯化将诱导表达后的菌液12000 rpm离心10 min，收集上清进行浓缩，再用20 mm ph 8.0 tris
‑
hcl进行透析。然后将透析后的酶液进行阴离子交换层析，a液为20 mm ph 8.0 tris
‑
hcl，b液为a液加1 m nacl，纯化蛋白，收集洗脱液，进行sds
‑
page分析。
33.实施例3、野生型植酸酶y4及融合蛋白y4
‑
spy的性质测定1. 植酸酶活性测定将酶液用0.1 mol/l含有0.05% bsa和0.05% triton x
‑
100的ph 5.5 hac
‑
naac缓冲液进行稀释，将100
ꢀµ
l稀释后的酶液加入到900
ꢀµ
l植酸钠底物(用0.1 mol/l的ph 5.5 的hac
‑
naac缓冲液配制)中，在37度反应10 min，加入1 ml 10%(w/v)tca终止反应，最后加入1 ml显色液[1%(w/v)四水合钼酸铵，3.2%(v/v)浓硫酸，7.32%(w/v)硫酸亚铁]进行显色。对照则是在加酶液之前先加入tca混匀使酶变性，其他相同。显色后，在700 nm光吸收下测定od值，计算酶活。
[0034]
将纯化后的野生型和融合蛋白在ph 5.5、37℃下进行酶促反应以测定其酶活性。如图1所示，野生型的酶比活为2077 u/mg，融合酶的酶比活为2045 u/mg，与野生型相当，表明对植酸酶y4的改造并未影响其活性。
[0035]
2. 最适温度测定
在0.1mol/l ph 5.5 hac
‑
naac缓冲液条件下，分别在不同温度（20、25、30、37、40、45、50、55、60、65和70℃）下对野生型和融合蛋白的酶活性进行测定来确定最适温度，最适温度对应活性定义为100%，依次计算其余温度下的剩余酶活。如图2所示，野生型和融合蛋白的最适温度都为55℃，肽标签spytag/spycatcher与植酸酶的融合表达并未影响植酸酶y4的最适温度。
[0036]
3. 热稳定性测定将纯化所得蛋白用0.1 mol/l含有0.05% bsa和0.05% triton x
‑
100的ph 5.5 hac
‑
naac缓冲液稀释至合适倍数后，取100 μl于1.5 ml ep管中，分别在100度下保温0、2、5、10、15和30 min，之后测定对应酶活，以保温0 min的活性为100%，计算不同保温时间下的剩余酶活。如图3所示，野生型在100℃下处理2 min后，酶活基本消失；而融合酶在100℃下处理2 min之后，剩余酶活相当于处理前的47%，处理5 min后，剩余酶活约为42%。
[0037]
实施例4、木聚糖酶xyna及融合蛋白xyna
‑
spy的性质测定根据本发明的具体实施方式，对从绵羊瘤胃中分离得到的氨基酸序列如seq id no:4所示的木聚糖酶xyna与肽标签spytag/spycatcher进行融合表达，从而获得所述融合木聚糖酶，氨基酸序列如seq id no:5所示。
[0038]
1. 木聚糖酶活性测定在0.9 ml ph 6.0的 1%（w/v）榉木木聚糖底物中加入100 μl适当稀释的酶液，50℃反应10 min后加入1.5 ml dns，煮5 min终止反应，冰上放置10 min后，室温下测定od
540
的吸光值，每个反应重复测定三次。酶活单位（u）的定义：在最适条件下每分钟释放1 μmol还原糖所需要的酶量。
[0039]
2. 热稳定性测定将纯化后的酶用最适ph缓冲液稀释后，在60℃处理下处理10 min，然后在最适温度和ph条件下测定剩余酶活。如图4所示，木聚糖酶xyna和xyna
‑
spy在60℃处理10 min后，剩余酶活分别为39.8%和41.2%，酶活损失情况基本一致，表明肽标签spytag/spycatcher与木聚糖酶的融合表达并未提高木聚糖酶xyna的热稳定性。
[0040]
以上实施例仅用于解释本技术的技术方案，不限定本技术的保护范围。