一种CXCR3激活剂在提高自然杀伤细胞杀伤活性中的应用的制作方法

一种cxcr3激活剂在提高自然杀伤细胞杀伤活性中的应用
技术领域
1.本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种cxcr3激活剂在提高自然杀伤细胞杀伤活性中的应用。


背景技术：

2.自然杀伤(nk)细胞是机体主要的天然免疫细胞，无需抗原致敏，不依赖抗体，即可直接识别并清除体内异常细胞，如肿瘤细胞、细菌或病毒等微生物感染细胞，故在机体早期抗肿瘤和抗感染的免疫应答中发挥极为重要的作用。除了可直接杀死肿瘤细胞外，nk细胞活化后还可通过分泌炎性细胞因子和趋化因子，与树突状细胞协同促进效应t细胞募集到肿瘤微环境中发挥抗肿瘤作用，从而有效地诱发后续的特异性抗肿瘤免疫应答。因此，提高nk细胞的杀伤活性对于细胞免疫治疗具有重要意义。
3.目前对趋化因子的研究普遍认为，趋化因子除了趋化免疫细胞外，在炎症、感染、肿瘤、应激、自身免疫、变态反应、移植排斥反应、aids、淋巴细胞归巢以及新生血管形成等众多病理生理的发生发展过程中均有趋化因子的参与。cxc型趋化因子受体3(cxcr3)更是成为了各个领域的研究热点。
4.目前cxcr3与nk细胞杀伤活性的相关性报道较少。


技术实现要素：

5.本发明是为了提供一种cxcr3激活剂在提高自然杀伤细胞杀伤活性中的应用，具体地，该应用可以为制备成药物，也可以为制备成培养基。
6.技术方案如下：
7.一种cxcr3激活剂在提高自然杀伤细胞杀伤活性中的应用，cxcr3激活剂为水麦冬酸。
8.一种cxcr3激活剂在制备提高自然杀伤细胞杀伤活性的药物中的应用，所述cxcr3激活剂为水麦冬酸。
9.一种cxcr3激活剂在制备提高自然杀伤细胞杀伤活性的培养基中的应用，所述cxcr3激活剂为水麦冬酸。
10.进一步地，所述培养基通过在常规培养基基础上添加所述cxcr3激活剂制备而成。
11.有益效果：
12.本发明发现水麦冬酸可以通过激活cxcr3提高nk细胞的杀伤活性，因此，可以用于提高自然杀伤细胞杀伤活性；具体地，可以用于制备提高nk细胞杀伤活性的药物，也可以用于制备提高nk细胞杀伤活性的培养基。
附图说明
13.图1为western blot图。
14.图2为各组小鼠移植瘤剥离后拍照。
具体实施方式
15.一、试验材料
16.淋巴细胞分离液购自solarbio。nk细胞培养基购自cellgro scgm，高糖dmem培养基购自gibco，人ab血清购自sigma，胎牛血清购自gibco。水麦冬酸购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％。cd3-percp-cy5.5和cd56-fitc购自bd。spf级雌性balb/c-nu裸鼠(约8周龄)购自北京维通利华。
17.二、试验方法
18.1、nk细胞的培养和鉴定
19.取健康献血者外周抗凝血100ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，再用含500u/ml rhil-2的nk细胞培养基对单个核细胞重悬制成细胞密度为2
×
105/ml的细胞悬浮液，接种于培养瓶中，在37℃、5％co2条件下培养，每2～3d半量换液1次，并且在每次换液时调整细胞数量至5
×
104/ml，培养14d后，收集细胞。
20.流式鉴定：收集培养14d的细胞，pbs洗涤，按照常规的流式细胞检测法加入percp-cy5.5标记的cd3和fitc标记的cd56抗体对细胞表面标志物进行检测。
21.2、western blot检测granzyme b、perforin、cxcr3蛋白的表达水平
22.收集培养14d的nk细胞，pbs洗涤，用含有5％人ab血清的nk细胞培养基重悬制成细胞密度为5
×
104/ml的细胞悬浮液，接种于24孔板中，每孔1ml，24h后，药物组更换为含有10μg/ml或20μg/ml水麦冬酸的完全培养基，对照组更换为不含水麦冬酸的完全培养基，在37℃、5％co2条件继续培养，48h后，收集细胞，pbs洗涤，裂解，bca法测定蛋白浓度，各组取等量蛋白进行sds-page电泳，将凝胶湿转到pvdf膜，5％脱脂牛奶常温封闭2h，4℃下加入granzyme b、perforin、cxcr3、gapdh一抗孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，显色，拍照分析。
23.3、移植瘤检测nk细胞体内杀伤活性
24.3.1肿瘤细胞株的培养
25.取冻存的hela细胞，复苏后用含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基在37℃、5％co2条件下培养，每2～3d更换培养基、传代。取对数生长期的hela细胞用于移植瘤模型构建。
26.3.2nk细胞的制备
27.收集培养14d的细胞，pbs洗涤，用含有5％人ab血清的nk细胞培养基重悬制成细胞密度为5
×
104/ml的细胞悬浮液，接种于6孔板中，每孔2.5ml，24h后，药物组更换为含有10μg/ml或20μg/ml水麦冬酸的完全培养基，对照组更换为不含水麦冬酸的完全培养基，在37℃、5％co2条件继续培养，48h后，收集细胞，pbs洗涤。
28.3.3移植瘤模型的构建和治疗
29.取对数生长期hela细胞，胰酶消化，收集细胞，生理盐水洗涤重悬制备成细胞浓度为5
×
106/ml的细胞悬液，以0.1ml/只注入裸鼠右前腋皮下。接种后每天观察裸鼠状态，并记录成瘤情况。待裸鼠皮下移植瘤体积达到约100mm3时，筛选40只瘤体大小和体重相近的裸鼠，随机分为4组(模型对照组、空白对照组、低剂量组、高剂量组)，每组10只。空白对照组、低剂量组、高剂量组分别给予0.1ml细胞浓度为1
×
107/ml的nk细胞(媒介为生理盐水)，模型对照组对照组给予等量生理盐水，其中：空白对照组注射的nk细胞为“3.2nk细胞的制
备”中对照组制备的nk细胞，低剂量组、高剂量组注射的nk细胞分别为“3.2nk细胞的制备”中10μg/ml、20μg/ml药物组制备的nk细胞。每天治疗1次，3天为一个周期，共治疗3个周期，每个周期之间暂停注射治疗2天。
30.3.4剥离肿瘤和称重
31.最后一次注射nk细胞后，继续喂养3d，脱颈处死，剥离完整的肿瘤，称重并根据如下公式计算nk细胞治疗组相对于模型对照组的抑瘤率。抑瘤率(％)＝(模型对照组瘤重—nk细胞治疗组瘤重)
÷
模型对照组瘤重
×
100％。
32.4、统计学处理
33.采用spss 17.0统计软件包处理数据，用均数
±
标准差表示，组间比较采用t检验，p《0.05代表差异具有统计学意义。
34.三、试验结果
35.1、nk细胞的培养和鉴定
36.流式鉴定结果显示，cd3-cd56+表型细胞的比例从培养前的5.95％上升到培养14d的78.83％，说明成功从单个核细胞诱导产生了nk细胞。
37.2、western blot测定结果
38.western blot如图1所示，药物组granzyme b、perforin蛋白表达水平明显高于对照组。granzyme b即为颗粒酶b，perforin即为穿孔素，二者均是nk细胞发挥杀伤活性过程中的关键因子，二者含量高低直接决定了nk细胞的杀伤活性。由此可见，水麦冬酸干预培养的nk细胞显然具有更强的杀伤活性。同时，根据western blot结果，药物组cxcr3蛋白表达水平也明显高于对照组，而已经发现cxcr3是调控nk细胞杀伤活性的一个靶点，所以水麦冬酸有可能是通过激活cxcr3提高nk细胞的杀伤活性。
39.3、体内杀伤活性结果
40.各组剥离下来的肿瘤如图2所示，nk细胞治疗组的抑瘤率如表1所示，水麦冬酸干预培养的nk细胞在体内明显比常规的nk细胞具有更强的抑瘤能力。
41.表1nk细胞治疗组的抑瘤率
42.组别空白对照组低剂量组高剂量组抑瘤率(％)21.8
±
4.352.5
±
4.887.1
±
5.1
43.上述实验结果可以看出，水麦冬酸具有提高nk细胞杀伤活性的作用，体内、体外试验都可以证明这种作用，且水麦冬酸有可能是通过激活cxcr3发挥该作用。故而，水麦冬酸可以用于制备提高nk细胞杀伤活性的药物，也可用于制备提高nk细胞杀伤活性的培养基。
44.以上实施例旨在具体介绍本发明的实质性内容，但不应将本发明的保护范围局限于以上具体的实施例。