基于EFNA1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用

本发明属于肿瘤免疫治疗生物医药，涉及特异性嵌合抗原受体免疫细胞，具体涉及一种特异性靶向efna1受体的一种car，其修饰的免疫应答细胞，及其制备方法和应用。

背景技术：

1、目前癌症被认为是世界上各个国家的主要死亡原因及延长人类寿命的主要障碍。根据世界卫生组织(who)2019年的统计，在183个国家中年龄为70岁之前的人群中，癌症是第一或第二大死亡原因，严重威胁着人类的健康。到2020年，全球估计有1930万新发病例和1000万例癌症患者死亡，根据目前癌症的发病率估计到2040年，全球将会出现2840万例癌症新发病例(包括基底细胞癌除外的非黑色素瘤皮肤癌)，比2020年增加47％，总体而言，世界范围内癌症的发病率和死亡率负担正在迅速增长。

2、根据2020全球肿瘤数据统计，预计2020年会有1900万新发结直肠癌患者，935，000例患者死于结直肠癌；总体来说，在发病率上结直肠癌占第三位，死亡率居第二位，居高的发病率和死亡率使结直肠癌严重威胁着人类的健康。目前结直肠癌的治疗手段主要包括局部治疗的手术，系统治疗的化疗，靶向治疗以及免疫治疗。随着医疗水平的提高，系统治疗结直肠癌方面已经取得了重大进展。引入了六种新的化疗药物，使转移性结直肠癌患者的中位总生存期从不到9个月(未经治疗)增加到大约24个月。对于iii期(淋巴结阳性)结肠癌患者，已经确立了以氟尿嘧啶为基础的化疗的总体生存获益，最新的数据表明，将奥沙利铂纳入此类辅助治疗方案具有更高的疗效，虽然治疗效果不断提高，但仍有部分患者出现恶性进展，因此需要探索新的方法治疗结直肠癌。

3、随着医学技术的发展，人类的寿命不断延长，在肿瘤的治疗上取得了很大的进展，手术、化疗、放疗和生物治疗等综合治疗手段的应用，使得癌症患者的生存期不断延长，生存质量也取得了很大的提升。除了常规治疗手段，免疫治疗也成为了治疗癌症的临床重要手段，越来越多的免疫治疗药物被批准用于临床治疗，如针对免疫检查点抑制剂的pd1,pdl1单克隆抗体以及car-t细胞治疗。

4、嵌合抗原抗体受体(chimeric antigen receptor-t cell,car-t)t细胞是指经基因修饰后，能以mhc非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的t细胞。其主要结构包括三类，即胞外的scfv识别结构域，此区域用于对肿瘤细胞上的靶点进行识别结合；铰链区和跨膜结构域，主要来源于cd8或cd28，将car锚定于细胞膜，且连接胞外识别域与胞内信号；胞内域，是激活域，其数量和长度差异会影响car-t的抗肿瘤效果，目前常用的是一个激活域加一个或多个共刺激结构域，cd3ζ是car胞内部分的常见特征，其能启动信号以驱动t细胞的杀伤作用，而共刺激域主要来源于cd28受体家族或者tnf受体家族如4-1bb,ox40或cd27，通过增强细胞因子分泌或者促进增殖及持久性也提高car-t的杀伤效果。

5、正常t细胞依赖于t细胞表面受体(t cell receptor,tcr)及肿瘤细胞表面的主要组织相容复合物(major histocompatibility complex.mhc)结合的方式识别肿瘤细胞,而car-t细胞以不依赖于mhc的方式只依赖于car这个结构来识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，taa)，具有car对抗原识别的特异性及t细胞的杀伤特性。

6、过去这些年来，随着基因编辑，免疫及其他学科的综合快速发展，car-t细胞治疗成为治疗血液病一个新的并取得不错疗效的治疗手段。car-t治疗恶性肿瘤仍然是目前的研究热点，自1986年首次用肿瘤浸润淋巴细胞(tils)治疗肿瘤，到1993年第一代car的研发，直至2017年fda首次批准car-t用于治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病，car-t治疗已经走过数年的历程。目前有三种car-t被用于治疗肿瘤，包括2017年8月和10月被fda批准的kymriah和yescarta被用于治疗复发/难治的急性淋巴细胞白血病及特定类型大b细胞淋巴瘤，及2020年7月批准的tecartus被用于治疗成人套细胞淋巴瘤(mental celllymphoma,mcl)。car-t治疗在血液病方面取得了很好的进展，实体瘤的治疗仍然存在一定的局限性，主要原因是有效靶点的选择以及car-t细胞对肿瘤的浸润。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种以efna1受体为靶点的嵌合抗原受体免疫细胞及其制备和应用方法。

2、在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)，其特征在于，所述的car含有一胞外结合域，所述的胞外结合域包括基于seq id no:1所示氨基酸序列的efna1或其片段的结构，并且所述的胞外结合域能够特异性地与efna1受体以配体受体方式结合。

3、在另一优选例中，所述的efna1受体选自下组：epha2。

4、在另一优选例中，所述的胞外结合域具有来源于efna1的氨基酸序列。

5、在另一优选例中，所述的胞外结合域包括efna1蛋白或其片段。

6、在另一优选例中，所述的efna1蛋白片段包括efna1蛋白的胞外区。

7、在另一优选例中，所述的胞外结合域包括efna1蛋白或其片段。

8、在另一优选例中，所述的胞外结合域段包括efna1蛋白的胞外区，所述胞外区的氨基酸序列为对应于seq id no:1所示序列的19-182位。

9、在另一优选例中，所述胞外结构域具有如seq id no:1的19-182位所示的氨基酸。

10、在另一优选例中，所述的efna1受体选自下组：epha2。

11、在另一优选例中，所述的car的胞外结合域除了含有针对efna1受体的第一胞外结构域之外，还包括针对额外靶点的第二胞外结构域。

12、在另一优选例中，所述的额外靶点为肿瘤特异性靶点。

13、在另一优选例中，所述的efna1蛋白或其片段与包括epha2在内的efna1受体具有特异性结合。

14、在另一优选例中，所述的结合分子选自下组：epha2。

15、在另一优选例中，所述的epha2是位于细胞膜上epha2。

16、在另一优选例中，所述的epha2来源于人或非人哺乳动物。

17、在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)；优选为灵长动物。

18、在另一优选例中，所述的epha2是人源的或猴源的。

19、在另一优选例中，所述的epha2是人源的。

20、在另一优选例中，所述的胞外结构域具有如seq id no:1所示的氨基酸序列，或具有如seq id no:1所示序列的第1至182位(较佳地为第19至182位)的氨基酸序列。

21、在另一优选例中，所述的efna1蛋白或其片段对应于seq id no:1所示序列的19-182位的氨基酸序列。

22、在另一优选例中，所述的efna1蛋白或其片段的氨基酸序列选自下组：

23、(i)如seq id no:1所示序列的第19至182位所示的序列；和

24、(ii)在如seq id no:1所示序列的第19至182位所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其n端或c端添加1至30个氨基酸残基，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如seq id no:1所示序列的第19至182位所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列与(i)所示的序列具有相同或相似的功能。

25、在另一优选例中，所述car的结构如下式i所示：

26、l-eb-h-tm-c-cd3ζ-rp (i)

27、式中，

28、各“-”独立地为连接肽或肽键；

29、l是无或信号肽序列；

30、eb是胞外结合域；

31、h是无或铰链区；

32、tm是跨膜结构域；

33、c是无或共刺激信号分子；

34、cd3ζ是源于cd3ζ的胞浆信号传导序列；

35、rp是无或报告蛋白。

36、在另一优选例中，所述的报告蛋白rp中还包括位于其n端的自剪切识别位点，优选地为t2a序列。

37、在另一优选例中，所述的报告蛋白rp为荧光蛋白。

38、在另一优选例中，所述的报告蛋白rp为mkate2红色荧光蛋白。

39、在另一优选例中，所述的mkate2红色荧光蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。

40、在另一优选例中，所述的l是选自下组的蛋白的信号肽：cd8、cd28、efna1、gm-csf、cd4、cd137、或其组合。

41、在另一优选例中，所述的l是cd8来源的信号肽。

42、在另一优选例中，所述l的氨基酸序列如seq id no:3所示。

43、在另一优选例中，所述的h是选自下组的蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、或其组合。

44、在另一优选例中，所述的h是cd8来源的铰链区。

45、在另一优选例中，所述h的氨基酸序列如seq id no:4所示。

46、在另一优选例中，所述的tm是为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。

47、在另一优选例中，所述的tm是cd8来源的跨膜区。

48、在另一优选例中，所述tm的氨基酸序列如seq id no:5所示。

49、在另一优选例中，所述的c是选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2，或其组合。

50、在另一优选例中，所述的c是4-1bb来源的共刺激信号分子。

51、在另一优选例中，所述c的氨基酸序列如seq id no:6所示。

52、在另一优选例中，所述的源于cd3ζ的胞浆信号传导序列的氨基酸序列如seq idno:7所示。

53、在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体car的氨基酸序列如seq id no:8所示。

54、在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。

55、在本发明的第三方面，提供了一种载体，其特征在于，所述的载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子。

56、在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

57、在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

58、在另一优选例中，所述载体选自下组：ptomo慢病毒载体、plenti、plvth、pljm1、phcmv、plbs.cag、phr、plv等。

59、在另一优选例中，所述的载体是ptomo慢病毒载体。

60、在另一优选例中，所述载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件wpre、长末端重复序列ltr等。

61、在另一优选例中，所述载体包含如seq id no:9所示的核苷酸序列。

62、在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子或表达如本发明第一方面所述的car。

63、在本发明的第五方面，提供了一种工程化免疫细胞，所述的免疫细胞含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子或表达如本发明第一方面所述的car。

64、在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞选自下组：t细胞、nk细胞、nkt细胞，或巨噬细胞。

65、在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞是嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)或嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)。

66、在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞是car-t细胞。

67、在本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：将如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第三方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

68、在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

69、在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如本发明第一方面所述的car、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

70、在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

71、在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

72、在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。

73、在本发明的第八方面，提供了一种如本发明第一方面所述的car、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗efna1受体异常表达相关的疾病的药物或制剂。

74、在另一优选例中，所述的efna1受体包括但不限于epha2。

75、在另一优选例中，所述的efna1受体异常表达是指所述efna1受体过度表达。

76、在另一优选例中，所述efna1受体过度表达是指所述efna1受体表达量为正常生理状况下表达量的≥1.5倍，较佳地≥2倍，更佳地≥2.5倍。

77、在另一优选例中，所述的efna1受体异常表达相关的疾病包括但不限于肿瘤、衰老、肥胖、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、感染性疾病等。

78、在另一优选例中，所述的efna1受体异常表达相关的疾病包括epha2异常表达相关的疾病。

79、在另一优选例中，所述的epha2异常表达相关的疾病包括：肿瘤、衰老、心血管疾病、肥胖等。

80、在另一优选例中，所述的疾病是epha2高表达的恶性肿瘤。

81、在另一优选例中，所述肿瘤包括血液肿瘤和实体瘤。

82、在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、淋巴瘤，或其组合。

83、在另一优选例中，所述的实体瘤选自下组：乳腺癌、胃癌、肝胆癌、结直肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和食道癌、胶质细胞瘤、肺癌、胰腺癌、前列腺癌，或其组合。

84、在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：结直肠癌、脑肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌。

85、在本发明的第九方面，提供了一种如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

86、在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用有效量的如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第七方面所述的药物组合物。

87、在另一优选例中，所述疾病为efna1受体异常表达相关的疾病。

88、在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

89、在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的car免疫细胞是来源于所述对象的细胞(自体细胞)。

90、在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的car免疫细胞是来源于健康个体的细胞(异体细胞)。

91、在另一优选例中，所述的方法可与其他治疗方法联合使用。

92、在另一优选例中，所述的其他治疗方法包括化疗、放疗、靶向治疗等方法。

93、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。