一种具有多种甲型流感病毒免疫原性的融合蛋白及其制备与应用

1.本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种具有多种甲型流感病毒免疫原性的融合蛋白及其制备与应用。


背景技术：

2.甲型流感病毒属于正粘科，有包膜的rna病毒，广泛分布于人群及家禽、猪、马等动物体内。甲型流感病毒抗原易变异，容易引起流感大流行。一百多年来，一共发生了五次全球大爆发的流感疫情。截止目前，每年的季节性流感也会导致5％-10％的世界人口感染。
3.目前针对甲型流感病毒的疫苗主要有灭活疫苗、减毒活疫苗、重组ha蛋白疫苗。世界卫生组织每两年需要召开会议，定期更换甲型流感疫苗的疫苗病毒。然而，这些疫苗仍存在容易出现与流行株错配，抗原易变异，不适合老人和儿童，保护效果不好等缺点。经典流感疫苗通常诱导对病毒表面抗原血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)产生抗体，主要针对其免疫显性高变区。持续的抗原漂移使病毒容易逃避这些抗体的作用，降低了疫苗接种的有效性。而且，由于显著的抗原差异，这些疫苗将无法预防新出现的大流行性流感病毒。因此，人们对开发具有更长的和更广泛作用范围的新疫苗非常感兴趣。
4.甲型流感病毒共编码10种蛋白，其中包括8种结构蛋白：血凝素蛋白ha，神经氨酸酶蛋白na，基质蛋白m1和离子通道蛋白m2，核蛋白np，rna多聚酶pb2、pb1和pa；此外还有两个非结构蛋白ns1和ns2。在甲型流感病毒的众多抗原蛋白中，血凝素蛋白 ha抗原免疫原性强的头部和保守的茎杆部，基质蛋白m2(matrix protein 2)胞外部分m2e和位于病毒包膜内的m1(matrix protein 1)抗原，以及核蛋白np(nuclear protein)抗原是目前通用流感疫苗最关注的靶点。
5.其中，m2e蛋白在病毒表面体积小、丰度低，抗原不容易发生变异，有很好的保守性，是良好的通用疫苗候选蛋白。但其分子量小，免疫原性不足，有研究表明m2e本身是一种弱免疫原，只有大约一半感染甲型流感病毒的人能够产生抗m2e抗体。因此大多数研究方案都会采用不同的载体来提升m2e的免疫原性。常用的方案有：基于乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒(hbc)的3m2e-hbc疫苗；利用纳米技术将不同种属来源的m2e蛋白包装成颗粒增强其免疫原性；将hpv vlps、木瓜花叶病毒vlps、t7噬菌体vlps作为vlps平台来展示多拷贝m2e进而提高m2e特异性抗体水平。
6.综上所述，目前实验室或临床上的多抗原通用流感疫苗常以“多抗原混合”或“多抗原串联”的融合表达形式呈现在载体外部，虽然具有一定的广谱型，但是大多数疫苗需要联合佐剂或季节性流感疫苗才能发挥良好的效果。因此，研发一种免疫原性更好、制剂成分单一制备简便、副作用小、保护效果更佳的甲型流感病毒通用疫苗依然具有重要的意义和广阔的前景。


技术实现要素：

7.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种具有多种甲型流感病毒免疫原性的融合蛋白及其制备与应用，用于解决现有的甲型流感病毒疫苗保护效果不高、覆盖范围不够广泛等问题。
8.为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种融合蛋白，为 rm2e
‑△
a146ply蛋白，所述rm2e
‑△
a146ply蛋白从n端到c端依次包含rm2e蛋白和
△
a146ply蛋白，其中，
9.所述rm2e蛋白包含了四段来源于家禽、猪、人甲型流感病毒的公共序列，其氨基酸序列如seq id no.5所示；
10.所述
△
a146ply蛋白氨基酸序列为seq id no.8所示；
11.所述rm2e
‑△
a146ply蛋白氨基酸序列为seq id no：10所示，所述rm2e
‑△
a146ply 蛋白具有甲型流感病毒免疫原性。
12.肺炎链球菌溶血素(ply)是肺炎链球菌保守表达的一个53kda的表面溶血活性蛋白，减毒的ply蛋白(a146ply)是肺炎链球菌比较有效的蛋白疫苗候选蛋白，本发明研究发现，肺炎链球菌溶血素突变体(δa146ply)具有良好的佐剂功能，通过融合表达 rm2e-δa146ply蛋白能增强m2e蛋白的免疫原性和保护效果。
13.本发明第二方面提供如第一方面所述的融合蛋白在制备甲型流感病毒疫苗中的应用。
14.本发明第三方面提供如一种融合蛋白的制备方法，将rm2e蛋白串联表达于
△
ply蛋白的n端，构建得到rm2e
‑△
ply融合蛋白；
15.所述rm2e蛋白包含了四段来源于家禽、猪、人甲型流感病毒的公共序列，其氨基酸序列如seq id no.5所示；
16.所述
△
aply蛋白氨基酸序列为seq id no.8所示；
17.所述rm2e
‑△
aply蛋白氨基酸序列为seq id no：10所示，所述rm2e
‑△
aply蛋白具有甲型流感病毒免疫原性。
18.本发明第四方面提供一种预防和/或治疗甲型流感病毒疫苗，含有如seq id no：10所示的氨基酸序列。
19.本发明第五方面提供一种原核表达流感病毒蛋白的表达系统，含有第一方面所述的融合蛋白。
20.本发明第六方面提供一种蛋白质或多肽，含有第一方面所述的融合蛋白。
21.本发明第七方面提供一种预防和/或治疗甲型流感病毒的佐剂，含有如seq id no.8所示的氨基酸序列。
22.本发明第八方面提供一种增强m2e蛋白免疫原性的方法，以
△
a146ply蛋白作为佐剂，所述
△
a146ply蛋白氨基酸序列如seq id no.8所示。
23.如上所述，本发明的具有多种甲型流感病毒免疫原性的融合蛋白及其制备与应用，具有以下有益效果：
24.对于甲型流感病毒通用疫苗，本发明人对甲型流感病毒保守表位进行大量研究后发现， m2e蛋白在不同流感病毒亚型中有良好的保守性，由于其分子量小，将几段序列串联在一起并且使用载体后才能产生良好的保护效果，同时，本发明还发现δa146ply蛋白具有
良好的佐剂功能，将m2e蛋白多段串联起来表达与
△
a146ply蛋白的n端，可以显著增强m2e蛋白的免疫原性和保护效果。基于此，本发明开发了一种融合蛋白rm2e
‑△
a146ply，经实验验证，其对多种甲型流感病毒都具有免疫原性，具有开发为通用甲型流感病毒通用疫苗的潜力。进一步地，本发明还提供了一种原核表达流感病毒蛋白的表达系统，可用于低成本、大批量的表达纯化出流感病毒相关蛋白。
附图说明
25.图1显示为本发明实施例1中融合蛋白的构建流程示意图。
26.图2显示为本发明实施例2中蛋白的表达，其中1为rm2e蛋白，2为rm2e
‑△
ply蛋白，3为
△
ply蛋白，m为蛋白marker。
27.图3显示为本发明实施例3中蛋白的抗原性验证，其中1为rm2e蛋白，2为rm2e
‑△
ply蛋白，3为
△
ply蛋白，m为预染蛋白marker。
28.图4显示为本发明实施例4中肌肉免疫蛋白后小鼠血清中的抗体效价。
29.图5显示为本发明实施例4中细胞免疫相关因子的测定。
30.图6显示为本发明实施例4中小鼠感染甲型流感病毒后的生存率图。
31.图7显示为本发明实施例4中小鼠感染甲型流感病毒后的肺部感染情况图，其中图7a为肺部病毒载量测定，图7b为肺组织he染色图。
32.图8显示为本发明实施例4中抗血清对不同流感病毒毒株来源的m2e蛋白的交叉识别作用。
具体实施方式
33.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
34.实施例1
35.rm2e重组蛋白及rm2e
‑△
ply融合蛋白的构建
36.(1)rm2e蛋白由分别来源于人、家禽、猪流感病毒中公共的m2e蛋白序列串联而成，如图1所示，m2e蛋白由四段不同序列的柔性蛋白linker连接串联而成，其中linker1的氨基酸序列为：pggssggss(seqidno.1)，linker2的氨基酸序列为：pggssggss(seqidno.2)，linker3的氨基酸序列为：pgsgsgsgs(seqidno.3)，linker4的氨基酸序列为：eaaakeaaak(seqidno.4)。rm2e蛋白氨基酸序列如seqidno.5所示：
37.mgsshhhhhhssglvprgshmasmtggqqmgrgsslltevetptrngweckcsdssdpggssggssslltevetptrsewecrcsgssdpggssggssslltevetpirngweckcndssdpgsgsgsgsslltevetpirnewgcrcndssdeaaakeaaak。
38.(2)pet28a(+)-rm2e质粒由上海生工生物工程有限公司构建，其核苷酸序列如seqidno.6所示：
39.atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatcctctctgctgaccgaagttgaaaccccgacccgtaacggtt
gggaatgtaaatgctctgatagctctgatccg ggcggtagctctggtggttctagctctcttttaaccgaagtggaaaccccgactcgtag cgaatgggaatgccgttgctctggtagctctgatccgggtggttcttctggcggttcttc ttctctgctgaccgaagttgaaaccccgattcgtaacggttgggaatgtaaatgcaatg attcttctgatccgggttctggttctggtagcggttcttctttactgactgaagttgaaa ctccgatccgtaacgaatggggttgtcgttgtaatgattcttctgatgaagctgcagcta aagaagcggcggctaaataa。
40.(3)pet28a(+)
‑△
ply质粒由发明人所在实验室保存，其核苷酸序列如seq id no.7 所示，
△
ply蛋白氨基酸序列如seq id no.8所示。
41.seq id no.7：
42.atgggacaccatcaccatcaccatatgggatccgaattcgagctccgtcgacaagct tgcggccgcatggcaaataaagcagtaaatgactttatactagctatgaattacgataaa aagaaactcttgacccatcagggagaaagtattgaaaatcgtttcatcaaagagggtaa tcagctacccgatgagtttgttgttatcgaaagaaagaagcggagcttgtcgacaaata caagtgatatttctgtaacagctaccaacgacagtcgcctctatcctggagcacttctcg tagtggatgagaccttgttagagaataatcccactcttcttgcggttgatcgtgctccga tgacttatagtattgatttgcctggtttggcaagtagcgatagctttctccaagtggaag accccagcaattcaagtgttcgcggagcggtaaacgatttgttggctaagtggcatcaa gattatggtcaggtcaataatgtcccaagaatgcagtatgaaaaaataacggctcacag catggaacaactcaaggtcaagtttggttctgactttgaaaagacagggaattctcttg atattgattttaactctgtccattcaggtgaaaagcagattcagattgttaattttaagca gatttattatacagtcagcgtagacgctgttaaaaatccaggagatgtgtttcaagatac tgtaacggtagaggatttaaaacagagaggaatttctgcagagcgtcctttggtctatat ttcgagtgttgcttatgggcgccaagtctatctcaagttggaaaccacgagtaagagtg atgaagtagaggctgcttttgaagctttgataaaaggagtcaaggtagctcctcagaca gagtggaagcagattttggacaatacagaagtgaaggcggttattttagggggcgaccc aagttcgggtgcccgagttgtaacaggcaaggtggatatggtagaggacttgattcaag aaggcagtcgctttacagcagatcatccaggcttgccgatttcctatacaacttctttttt acgtgacaatgtagttgcgacctttcaaaacagtacagactatgttgagactaaggtta cagcttacagaaacggagatttactgctggatcatagtggtgcctatgttgcccaatatta tattacttgggatgaattatcctatgatcatcaaggtaaggaagtcttgactcctaaggct tgggacagaaatgggcaggatttgacggctcactttaccactagtattcctttaaaagg gaatgttcgtaatctctctgtcaaaattagagagtgtaccgggcttgcctgggaatggtg gcgtacggtttatgaaaaaaccgatttgccactagtgcgtaagcggacgatttctatttg gggaacaactctctatcctcaggtagaggataaggtagaaaatgactag。
43.seq id no.8：
44.mghhhhhhmgsefelrrqacgrmankavndfilamnydkkkllthqgesienrfik egnqlpdefvvierkkrslstntsdisvtatndsrlypgallvvdetllennptllavdrap mtysidlpglassdsflqvedpsnssvrgavndllakwhqdygqvnnvprmqyekitahs meqlkvkfgsdfektgnsldidfnsvhsgekqiqivnfkqiyytvsvdavknpgdvfqdtv tvedlkqrgisaerplvyissvaygrqvylklettsksdeveaafealikgvkvapqtewkq ildntevkavilggdpssgarvvtgkvdmvedliqegsrftadhpglpisyttsflrdnvva tfqnstdyvetkvtayrngdllldhsgayvaqyyitwdelsydhqgkevltpkawdrng qdltahfttsiplkgnvrnlsvkirectglawewwrtvyektdlplvrkrtisiwgttlypq vedkvend。
45.(4)rm2e
‑△
ply融合蛋白构建：将rm2e蛋白串联表达于
△
ply蛋白的n端，如图1 所示，pet28a(+)-rm2e
‑△
ply质粒由上海生工生物有限公司构建，其氨基酸序列如seq idno.9所示，rm2e
‑△
ply蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示。
46.seq id no.9：
47.atgggacaccatcaccatcaccatatgggatcctctctgctgaccgaagttgaaacc ccgacccgtaacggttgggaatgtaaatgctctgatagctctgatccgggcggtagctct ggtggttctagctctcttttaaccgaagtggaaaccccgactcgtagcgaatgggaatg ccgttgctctggtagctctgatccgggtggttcttctggcggttcttcttctctgctgac cgaagttgaaaccccgattcgtaacggttgggaatgtaaatgcaatgattcttctgatcc gggttctggttctggtagcggttcttctttactgactgaagttgaaactccgatccgtaa cgaatggggttgtcgttgtaatgattcttctgatgaagctgcagctaaagaagcggcgg ctaaagagctccgtcgacaagcttgcggccgcatggcaaataaagcagtaaatgacttt atactagctatgaattacgataaaaagaaactcttgacccatcagggagaaagtattgaa aatcgtttcatcaaagagggtaatcagctacccgatgagtttgttgttatcgaaagaaag aagcggagcttgtcgacaaatacaagtgatatttctgtaacagctaccaacgacagtcg cctctatcctggagcacttctcgtagtggatgagaccttgttagagaataatcccactct tcttgcggttgatcgtgctccgatgacttatagtattgatttgcctggtttggcaagtagc gatagctttctccaagtggaagaccccagcaattcaagtgttcgcggagcggtaaacga tttgttggctaagtggcatcaagattatggtcaggtcaataatgtcccaagaatgcagta tgaaaaaataacggctcacagcatggaacaactcaaggtcaagtttggttctgactttg aaaagacagggaattctcttgatattgattttaactctgtccattcaggtgaaaagcaga ttcagattgttaattttaagcagatttattatacagtcagcgtagacgctgttaaaaatcc aggagatgtgtttcaagatactgtaacggtagaggatttaaaacagagaggaatttctg cagagcgtcctttggtctatatttcgagtgttgcttatgggcgccaagtctatctcaagtt ggaaaccacgagtaagagtgatgaagtagaggctgcttttgaagctttgataaaagga gtcaaggtagctcctcagacagagtggaagcagattttggacaatacagaagtgaagg cggttattttagggggcgacccaagttcgggtgcccgagttgtaacaggcaaggtggat atggtagaggacttgattcaagaaggcagtcgctttacagcagatcatccaggcttgcc gatttcctatacaacttcttttttacgtgacaatgtagttgcgacctttcaaaacagtac agactatgttgagactaaggttacagcttacagaaacggagatttactgctggatcatag tggtgcctatgttgcccaatattatattacttgggatgaattatcctatgatcatcaaggta aggaagtcttgactcctaaggcttgggacagaaatgggcaggatttgacggctcacttt accactagtattcctttaaaagggaatgttcgtaatctctctgtcaaaattagagagtgt accgggcttgcctgggaatggtggcgtacggtttatgaaaaaaccgatttgccactagt gcgtaagcggacgatttctatttggggaacaactctctatcctcaggtagaggataaggt agaaaatgactag。
48.seq id no.10：
49.mghhhhhhmgsslltevetptrngweckcsdssdpggssggssslltevetptrsewe crcsgssdpggssggssslltevetpirngweckcndssdpgsgsgsgsslltevetpirnew gcrcndssdeaaakeaaakelrrqacgrmankavndfilamnydkkkllthqgesienr fikegnqlpdefvvierkkrslstntsdisvtatndsrlypgallvvdetllennptllavdr apmtysidlpglassdsflqvedpsnssvrgavndllakwhqdygqvnnvprmqyekita hsmeqlkvkfgsdfektgnsldidfnsvhsgekqiqivnfkqiyytvsvdavknpgdvfqd tvtvedlkqrgisaerplvyissvaygrqvylklettsksdeveaafealikgvkvapqtew kqildntevkavilggdpssgarvvtgkvdmvedliqegsrftadhpglpisyttsflrdnv vatfqnstdyvetkvtayrngdllldhsgayvaqyyitwdelsydhqgkevltpkawdrn gqdltahfttsiplkgnvrnlsvkirectglawewwrtvyektdlplvrkrtisiwgttlyp qvedkvend。
50.实施例2
51.rm2e、
△
ply、rm2e
‑△
ply蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
52.(一)重组质粒pet28a(+)-rm2e、pet28a(+)
‑△
ply、pet28a(+)-rm2e
‑△
ply(均由
上海生工生物工程有限公司构建)转化至宿主菌bl21(de3)(购买于上海生工生物工程有限公司)中，过程如下：
53.将1μl重组质粒加入到100μl感受态细菌bl21(de3)中，混匀后冰浴30min，42℃热击 90s后冰水浴2min；加入800μl lb培养基，37℃
×
180rpm摇床培养60min复苏；3000rpm
ꢀ×
5min离心，留下200μl上清混匀菌液，涂布于lk平板；37℃孵育13h后挑取单克隆菌落。
54.(二)iptg诱导pet28a(+)-rm2e、pet28a(+)
‑△
ply、pet28a(+)-rm2e
‑△
ply的大量表达：
55.将e.coli bl21-rm2e、e.coli bl21-rm2e-δa146ply、e.coli bl21-δa146ply菌株活化于5ml含50ng/ml卡那霉素(kana)的lb液体培养基，置于摇床， 37℃，180rpm。a600≈0.5(约7h)时将活化菌液按1:100比例加入500ml至终浓度为50ng/ml 卡那霉素的lb培养基中，置于摇床，37℃，180rpm。约4h后加入iptg诱导表达。其中 rm2e蛋白的诱导条件为0.1mm iptg，37℃，120rpm，4h；δa146ply和rm2e-δa146ply 蛋白的诱导条件为0.5mm iptg，20℃，120rpm，10h。
56.(三)重组蛋白的纯化：
57.超声破菌后，取细菌破碎液上清用于纯化；4℃12000rpm
×
30min，上清用0.22μm滤膜过滤，收集滤液待用。吸2ml 50％的ni
2+-nta树脂混悬液于层析柱内，以20ml超声破碎缓冲液平衡；吸出平衡后的ni
2+-nta树脂混悬液与上述滤液充分混匀，冰浴1h，其间每间隔5min轻轻混匀一次；将悬液转入层析柱内，让液体自然流出，平衡柱床；不同咪唑浓度进行梯度洗脱，分别收集洗脱液后进行sds-page鉴定。
58.(四)超滤法浓缩蛋白用pbs去除咪唑：
59.清洗超滤装置后加入待浓缩的溶液，通过氮气加压的方式，将蛋白溶液浓缩至5ml；再加入30ml pbs继续超滤至5ml左右，重复两次，收集蛋白溶液。
60.(五)重组蛋白的定量(bradford检测法)：
61.1、吸20mg/ml的标准品牛血清白蛋白溶液6μl，以0.15mm nacl稀释40倍至 0.5mg/ml，分别在两组各4支试管中加入10μl、20μl、30μl、40μl bsa溶液，然后以 0.15mm nacl补足总体积为200μl，同时取一支试管仅加200μl 0.15mm nacl作为调零用；
62.2、取纯化产物20μl，也以0.15mm nacl补足至总体积200μl；
63.3、每管加入考马斯亮蓝g-250染液2ml，振荡混匀后室温静置30min；
64.4、于-series600全波长分光光度计中读取a590值，由仪器自动绘制标准曲线及计算样品蛋白含量。
65.(五)结果显示及分析：
66.如图2所示，经sds-page和图像分析表明，重组蛋白纯度可达90％以上。
67.经bradford法测得纯化透析后蛋白浓度结果，其中rm2e蛋白浓度为0.8mg/ml、
△
ply 蛋白浓度为3mg/ml、rm2e
‑△
ply蛋白浓度为2.4mg/ml。
68.实施例3
69.rm2e、rm2e
‑△
ply抗原性验证
70.采用western blot的方法验证构建的蛋白包含m2e蛋白的表位。其中使用的抗体为 influenza a m2(14c2)，购买于santa cruz biotechnology。具体过程如下：
71.1、page电泳：每孔蛋白上样量为40ng，12％的分离胶+5％的浓缩胶，80v，30分钟，
然后120v，90分钟；
72.2、湿转法转膜：恒流210ma，80min；
73.3、封闭：5％脱脂奶粉，37℃封闭1h；
74.4、一抗孵育：用一抗稀释液将influenza a m2(14c2)抗体按照1:1000的配比进行稀释，然后于4℃孵育过夜；
75.5、洗膜：用0.05％的tbst缓冲液洗四次，15min/次；
76.6、二抗孵育：用5％脱脂奶粉将hrp标记的羊抗鼠igg二抗(购买于美国kpl公司) 按照1:5000的配比稀释，然后于37℃孵育1h；
77.7、洗膜：用0.05％的tbst缓冲液洗四次，15min/次；
78.8、显色：在pvdf膜上加入现配的ecl反应液(购买于millipore，将a液和b液1:1 混合使用)，在化学发光成像仪上扫描分析结果，结果如图3所示，rm2e和rm2e
‑△
ply蛋白在目的大小位置可见到清晰的条带，这表明rm2e、rm2e
‑△
ply蛋白构建成功。
79.实施例4
80.rm2e
‑△
ply的保护效果及
△
ply的佐剂功能评估
81.(一)免疫方案和抗体效价检测
82.将6-8周龄的balb/c小鼠(购买于重庆腾鑫生物技术有限公司)随机分成5组，每组11 只小鼠，各组分别按照如下剂量肌肉注射为免疫小鼠：
83.pbs，100μl/只；
84.rm2e，100μl/只，8μg/只；
85.△
ply，100μl/只，20μg/只；
86.rm2e
‑△
ply，100μl/只，28μg/只；
87.rm2e+
△
ply，100μl/只，包含20μg
△
ply蛋白和8μg rm2e蛋白。
88.首次免疫时用pbs调整蛋白浓度，按照每个蛋白的分子量的比例调整蛋白浓度，保证各蛋白组之间摩尔浓度相同。
89.首次免疫2周后，进行第二次免疫，方法及剂量同上，同时留小鼠尾静脉血。
90.首次免疫4周后，进行第三次免疫，方法及剂量同上，同时留小鼠尾静脉血。
91.末次免疫后2周，取小鼠血液，37℃放置2h后800g离心10min分离得血清，用于检测抗体效价：
92.1、包被抗原：制备抗原包被液。称取na2co
3 1.7g、nahco
3 2.86g溶于1l ddh2o中，调节ph到9.6；用抗原包被液将蛋白rm2e、δply稀释至5μg/ml，加入96孔板，100μl/孔， 4℃过夜；
93.2、封闭：配制洗液(0.05％pbst)：吸取1ml吐温20加入到2l pbs缓冲液中，混匀备用；配制封闭液(2％bsa)：称取2g bsa溶于100ml pbs中，混匀后4℃保存备用；洗板3 次后，封闭液按照200μl/孔加入96孔板，37℃封闭2h；
94.3、加入一抗：洗板3次后加血清，用2％bsa进行连续倍比稀释(即 1:1000、1:2000、
……
、1:1024000)100μl/孔，最后一孔为阴性对照(只加入100μl的 2％bsa)，37℃孵育1h；
95.4、加入二抗：洗板6次后加hrp标记的羊抗鼠igg二抗，100μl/孔，37℃孵育 45min；
96.5、显色：洗板6次后分别加入tmb底物a、tmb底物b各50μl，37℃孵育15min； 100μl/
孔；
97.6、终止反应、比色：2m硫酸终止反应；450nm测定吸光度值；以a空白
×
2.1为临界值，计算各小鼠的抗体效价滴度。
98.结果如图4所示，免疫rm2e重组蛋白后能够诱导小鼠产生一定的抗体；免疫 rm2e
‑△
ply相比于rm2e组抗体效价更高；将两种蛋白混合组rm2e+
△
ply免疫小鼠后产生的抗体效价和rm2e组相当，没有显著的增强抗体效价。上述结果说明，
△
ply蛋白具有佐剂功能，能增强rm2e蛋白的免疫原性，但是需要与rm2e蛋白融合表达。
99.(二)免疫小鼠后相应脾细胞因子
100.1、小鼠分组和免疫方案与步骤(一)相同。
101.2、末次免疫两周后取pbs、rm2e、
△
ply、rm2e+
△
ply、rm2e
‑△
ply组小鼠的脾脏，每组三只。用无菌不锈钢筛网分离脾细胞，以rpmi 1640培养基洗涤两次后，重悬于含 10％fbs的rpmi 1640培养基中，调整浓度为2
×
106细胞/ml。将调整好的细胞悬液培养于 24孔板，每孔1ml，以5μg rm2e蛋白刺激，在5％co2、37℃环境中孵育 72h。4℃，3000rpm,离心10min吸取上清，-70℃冻存备用。以pbs为空白对照，刀豆蛋白 a(购买于sigma公司)为阳性对照，按相同条件刺激脾细胞，收集上清，-70℃冻存备用。
102.3、使用biolegend细胞因子检测试剂盒(购买于biolegengd公司)，检测上清中il-4、 il-10、ifn-γ、il-17a的表达水平。
103.结果如图5所示，其中il-4水平均低于试剂盒检测值下限，rm2e
‑△
ply组与rm2e组相比，rm2e
‑△
ply组脾细胞培养上清中ifn-γ水平显著升高。上述结果说明，
△
ply作为一种佐剂，与rm2e蛋白融合表达时可以刺激更强的th1细胞反应。
104.(三)免疫蛋白后对小鼠生存率的影响
105.1、小鼠分组和免疫方案与步骤(一)相同。
106.2、末次免疫后两周进行攻毒实验，滴鼻的方式给与每只小鼠5ld50的甲型流感病毒 a/puerto rico/8/1934h1n1(a/pr/8，pr8)(购买自美国模式菌种收集中心，american typeculture collection，atcc)，体积为30μl。攻毒后，连续14天监测小鼠的存活率和体重变化。如果体重减轻≥25％，对小鼠进行安乐死。
107.结果如图6所示，免疫rm2e组和
△
ply组与pbs组相比小鼠生存率无显著差异， rm2e+
△
ply组相比于pbs组有一定的保护效果，rm2e
‑△
ply组相比于pbs组生存率有显著的差异。上述结果说明，rm2e
‑△
ply对甲型流感病毒pr8具有较好的保护效果，
△
ply也具有良好的佐剂功能。
108.(四)免疫蛋白后小鼠肺部病毒载量和组织切片
109.1、小鼠分组和免疫方案与步骤(一)相同。
110.2、末次免疫后两周进行攻毒实验，滴鼻的方式给与每只小鼠3ld50的甲型流感病毒pr8。感染第六天后取小鼠肺组织用于qt-pcr提取和组织切片制备。
111.3、rna的提取和逆转录，具体步骤如下：
112.1)在研钵中用液氮研磨组织直至成细粉状。
113.2)加1ml rnaiso plus(购买于takara公司)继续研磨至组织变成液体，将匀浆液移入ep管中，加0.2ml氯仿，震荡混匀15s，室温静置5min。
114.3)4℃下13000rpm离心15min，将约0.4ml上层水相移至新的ep管，加等体积异丙
醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。配制75％depc酒精预冷。
115.4)4℃下13000rpm离心10min，弃上清，加1ml75％depc酒精，轻轻颠倒。
116.5)4℃下13000rpm离心5min，彻底弃上清，打开ep管盖，室温干燥后加20-200μldepc水溶解rna沉淀。
117.6)rna纯度、浓度测定：使用nanodrop1000分光光度计测定核酸浓度及吸光度值，od260/od280＝1.8～2.2。
118.7)rna质量鉴定：用tae溶液(由三羟甲基氨基甲烷(trisbase)、乙酸(aceticacid)和乙二胺四乙酸(edta)组成的缓冲液)配制1％琼脂糖凝胶，加入goodview染料(购买于上海赛百盛基因技术有限公司)，待电泳后经northern凝胶成像仪显影，确定rna条带是否正常。
119.8)按照表1配制逆转录体系：
120.表1.逆转录体系组成
121.depc水11μl5
×
buffer4μloligo dt primer1μlrandom primer1μlenzymermis1μlrna模板2μltotal20μl/管
122.9)逆转录程序：37℃15min——85℃5s——4℃。逆转录后所得cdna(约为1300ng/μl)低温保存或直接进行qt-pcr。
123.4、qt-pcr测肺组织中pr8病毒拷贝数，具体步骤如下：
124.1)pr8m1基因引物合成：
125.m1引物f：5
’‑
tgagtcttctaaccgaggtc-3’(seqidno.11)；
126.m1引物r：5
’‑
ggtcttgtctttagccattcc-3’(seqidno.12)。
127.2)按照表2配制荧光定量pcr反应体系：
128.表2.荧光定量pcr反应体系组成
129.试剂25μl体系10μl体系sybr ii12.5μl5.0μlf0.5μl0.4μlr0.5μl0.4μlddh2o9.5μl3.2μlcdna2.0μl1.0μl
130.3)将待测管置于避光板转移，定量pcr程序：95℃，5min——95℃，30s——60℃，10s——72℃，25s——共35个循环。
131.4)根据已知浓度的包含m1基因的质粒为做标准曲线，计算出待测标本中m1基因的拷贝数。
132.结果如图7a所示，rm2e
‑△
ply组相比于其他组，小鼠肺部pr8病毒的拷贝数较低。小鼠肺组织其切片he染色如图7b所示，rm2e
‑△
ply组相比于其他组，肺部炎症细胞浸润少，
肺泡结构较正常。
133.(五)抗血清在不同流感病毒毒株间的交叉识别作用
134.1、小鼠分组和免疫方案与步骤(一)相同。
135.2、末次免疫两周后取小鼠尾静脉血，用不同亚型甲型流感病毒的m2e蛋白检测免疫血清中的抗体效价。本实施例中使用三种病毒的m2e蛋白如下所示，均由上海金斯瑞公司合成，其氨基酸序列如下：
136.slltevetptrsewecrcsdssd a/california/7/2009(h1n1)(seq id no.13)；
137.slltevetpirnewgcrcndssd a/philippines/2/1982(h3n2)(seq id no.14)；
138.slltevetpirnewgcrcngssd a/vietnam/1203/2004(h5n1)(seq id no.15)。
139.结果如图8所示，免疫rm2e
‑△
ply蛋白后的血清可以识别以上三种病毒的m2e蛋白序列位点，这说明该蛋白具有开发通用甲型流感病毒疫苗的潜力。
140.综上所述，本发明提供了一种多段流感病毒m2e蛋白串联的方式，并证明了
△
ply蛋白作为佐剂可以增强m2e蛋白的免疫原性。本发明提供的rm2e
‑△
ply蛋白可作为一种新型的甲型流感病毒通用疫苗。
141.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。