S蛋白基因及其在猪δ冠状病毒疫苗中的应用的制作方法

s蛋白基因及其在猪
δ
冠状病毒疫苗中的应用
技术领域
1.本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及一种s蛋白基因及其在猪δ冠状病毒疫苗中的应用。


背景技术：

2.猪丁型冠状病毒又称猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,pdcov)，是一种新出现的可导致猪发生严重腹泻甚至死亡的冠状病毒。pdcov可以感染各个阶段的猪群，但主要感染哺乳仔猪，引起严重的萎缩性肠炎，临床症状表现为仔猪腹泻、呕吐、脱水，引起小猪的死亡率30％～40％，给养猪业带来了较重的经济损失。因此，研制有效的疫苗进行该病的防控是急需解决的问题。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是提出一种s蛋白基因及其在猪δ冠状病毒疫苗中的应用，该猪δ冠状病毒疫苗能够有效防治pdcov，且在使用时安全性良好。
4.为实现上述目的，本发明提出一种s蛋白基因，所述s蛋白基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
5.本发明还提出一种s蛋白，由如上文所述的s蛋白基因编码得到，其特征在于，所述s蛋白具有如seq id no：2所示的氨基酸序列。
6.本发明还提出一种重组质粒，所述重组质粒包括如上文所述的s蛋白基因。
7.可选地，包含乳酸菌表达载体pve5523。
8.本发明还提出一种重组菌株，所述重组菌株包含如上文所述的s蛋白基因。
9.可选地，所述重组菌株由携带所述s蛋白基因的重组质粒转化干酪乳杆菌标准菌株atcc393获得。
10.本发明还提出一种猪δ冠状病毒疫苗，所述猪δ冠状病毒疫苗包括如上文所述的s蛋白，或如上文所述的重组菌株的菌液。
11.可选地，包括所述重组菌株菌液和冻干保护剂；和/或，
12.所述重组菌株菌液的od600为1.0～1.2。
13.可选地，所述猪δ冠状病毒疫苗为口服疫苗。
14.本发明还提出一种猪δ冠状病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
15.培养如上文所述的重组菌株得到菌液，将菌液冻干处理，得到猪δ冠状病毒疫苗。
16.本发明提供的猪δ冠状病毒疫苗包含由s蛋白基因编码出的s蛋白，或装有s蛋白基因的重组质粒转化得到的重组菌菌液，该疫苗不仅能够在病毒主要靶器官小肠肠道黏膜上定居，能够有效防治pdcov，且在使用时没有活毒传播风险，安全性良好，对动物健康和生态环境无潜在的影响和威胁；此外，由重组菌菌液直接制备得到的疫苗不需要经过纯化工序，生产工艺简单易实现，生产效率高、成本低。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
18.图1为实施例1中合成的puc57-pdcovs质粒双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
19.图2为实施例1中重组质粒pve5523-pdcovs质粒双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。
20.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
21.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
22.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。涉及到基因合成、重组质粒和重组菌株制备、以及重组菌株发酵培养获得重组蛋白等实施方式中，未说明具体实验方式、实验原材料者，均按照基因工程及基于基因工程进行微生物发酵培养制备蛋白质的常规方法进行。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.猪丁型冠状病毒又称猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,pdcov)，是一种新出现的可导致猪发生严重腹泻甚至死亡的冠状病毒。pdcov可以感染各个阶段的猪群，但主要感染哺乳仔猪，引起严重的萎缩性肠炎，临床症状表现为仔猪腹泻、呕吐、脱水，引起小猪的死亡率30％～40％，给养猪业带来了较重的经济损失。因此，研制有效的疫苗进行该病的防控是急需解决的问题。
24.鉴于此，本发明提出一种s蛋白基因，所述s蛋白基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，具有该核苷酸序列的s蛋白基因中含有主要中和抗原表位的s1区域基因序列。由其编码出的s蛋白感染宿主时能够诱导产生中和性抗体，且其能在肠道黏膜定居，对pdcov的感染能够起到较好的预防作用。
25.具体来说，本发明提出的s蛋白基因是在对冠状病毒结构蛋白中的纤突蛋白进行全基因组分析，并在以其dna为模板，通过特定的引物扩增获得的，具有如seq id no：1所示的核苷酸序列，全长1659bp，该基因片段覆盖含有主要中和抗原表位的s1区域。
26.本发明进一步提出一种s蛋白，所述s蛋白由上述所述s蛋白基因编码得到，具有如seq id no：2所示的氨基酸序列，共552个氨基酸。s蛋白感染宿主时能够诱导产生中和性抗体，且其能在肠道黏膜定居，对pdcov的感染能够起到较好的预防作用。
27.得到s蛋白的方法具体如下：利用限制性内切酶，将得到的s蛋白基因插入到表达载体中，即可得到重组质粒；然后将重组质粒转化到宿主细胞中，即可获得重组菌株；培养
重组菌株，然后纯化处理，即可从发酵物中获得s蛋白。
28.本发明进一步提出一种重组质粒，所述重组质粒包括上述s蛋白基因。本发明提出的重组质粒插入有如seq id no：1所示的核苷酸序列。
29.其中，本发明提出的重组质粒还包含表达载体，且所述表达载体为乳酸菌表达载体pve5523。本发明使用常见可食用菌作为载体，价廉易得且安全性更好，且对动物健康和生态环境影响小。
30.本发明进一步提出一种重组菌株，所述重组菌株包括上述s蛋白基因。本发明提出的重组菌株能够表达s蛋白，且在构建重组菌株时，采用的宿主细胞为干酪乳杆菌标准菌株atcc393。干酪乳杆菌是一种常见易得的益生菌，本发明通过使用可食用菌作为宿主细胞，使得由重组菌株发酵得到的菌液可以直接制成口服疫苗使用，一方面使得生产工艺减少了纯化步骤，变得简单易实现，提高了生产效率，降低了生产成本，另一方面，免疫方法为口服，对兽类用药时刺激更小，且避免了常规注射疫苗容易引起的应激及疫苗吸收问题，能够刺激机体的黏膜免疫，有效抵抗猪δ冠状病毒攻毒引起的腹泻症状。
31.需要说明的是，上述构建重组质粒和重组菌株、以及培养重组菌株的技术均可参考本领域常规方法，具体操作在此不做赘述。
32.基于上述实施例，本发明进一步提出一种猪δ冠状病毒疫苗，所述猪δ冠状病毒疫苗包括如上文所述的s蛋白，或如上文所述的重组菌株的菌液。具体来说，在一些实施例中，可以直接将重组菌株发酵得到的菌液作为组分制成猪δ冠状病毒疫苗，也可以对菌液进行纯化处理，提取出s蛋白后，将s蛋白作为组分制成猪δ冠状病毒疫苗。
33.本发明提供的猪δ冠状病毒疫苗包含由s蛋白基因编码出的s蛋白，或装有s蛋白基因的重组质粒转化得到的重组菌菌液，该疫苗不仅能够在病毒主要靶器官小肠肠道黏膜上定居，能够有效防治pdcov，且在使用时没有活毒传播风险，安全性良好，对动物健康和生态环境无潜在的影响和威胁；此外，由重组菌菌液直接制备得到的疫苗不需要经过纯化工序，生产工艺简单易实现，生产效率高、成本低。
34.进一步地，所述猪δ冠状病毒疫苗包括重组菌株的菌液时，所述重组菌株菌液的od600为1.0～1.2，如此能够确保s蛋白浓度，保证疫苗的有效性。
35.此外，当所述猪δ冠状病毒疫苗包括重组菌株的菌液时，所述猪δ冠状病毒疫苗还包括冻干保护剂，本实施例中，猪δ冠状病毒疫苗为冻干制品，具有易于运输、保藏和产业化的优点，在制备冻干制品时，通过添加冻干保护剂有助于在加工过程中保护s蛋白，避免其失活。在添加冻干保护剂时，其添加量为：所述重组重组菌株菌液和所述冻干保护剂的体积比为1～3:1，优选为1:1，如此能够有效维持s蛋白的稳定性，避免其失活。
36.具体地，本实施例中，所述冻干保护剂包括以下重量份数的组分：明胶、海藻糖以及水，本发明采用上述冻干保护剂，具有成品外观在均一疏松团块、加水易溶、有效保护菌种活性等优点。
37.此外，本发明提出的所述猪δ冠状病毒疫苗为口服疫苗，服用方便、刺激小，且无注射疫苗存在的应激和疫苗吸收缺陷。
38.进一步地，本发明还提出一种猪δ冠状病毒疫苗的制备方法，所述猪δ冠状病毒疫苗的制备方法包括以下步骤：
39.培养如上文所述的重组菌株得到菌液，将菌液冻干处理，得到猪δ冠状病毒疫苗。
40.进一步地，具体实施时，所述猪δ冠状病毒疫苗的制备方法可以按照如下步骤实施：
41.接种重组菌株至液体培养基，培养至od600为1.0～1.2时，收集菌液，然后将菌液和冻干保护剂按照体积比1～3:1混合均匀，分装后，冻干制成口服疫苗。
42.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
43.实施例1重组质粒的构建
44.合成s蛋白基因(核苷酸序列如seq id no：1所示)，并在5’端加上salⅰ限制性内切酶位点，在3’端加上ecorv限制性内切酶位点，合成的基因克隆在puc57载体上，命名为puc57-pdcovs。对其进行sal i和ecorv双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，其中，泳道1为puc57-pdcovs双酶切结果，1659bp对应的片段为pdcovs，上面的片段为puc57载体片段；泳道m为dnamarker。从图中可以看出泳道1出现了1659bp左右的条带，其大小与s蛋白基因大小相吻合。可以说明已成功将合成的基因克隆到puc57载体。
45.将puc57-pdcovs质粒以及pve5523表达载体质粒进行sal i和ecorv双酶切，胶回收目的片段和pve5523载体片段，用t4ligase(t4dna连接酶)进行连接，连接产物转化dh5α大肠杆菌。之后挑取阳性克隆，摇菌后提取质粒进行双酶切鉴定(如图2)和序列测定分析，图2中，泳道1为pve5523-pdcovs双酶切结果，1659bp对应的片段为pdcovs，上面的片段为pve5523载体片段；泳道m为dnamarker，显然，s蛋白基因成功克隆到了pve5523表达载体上，将正确的克隆命名为pve5523-pdcovs质粒(即重组质粒)。
46.实施例2重组菌株的构建
47.将实施例1获得的pve5523-pdcovs质粒和atcc393乳酸乳杆菌感受态(实验室保存)轻柔混匀后，冰上放置5min，将其转入直径1mm的预冷电转化杯中，迅速电击，电击参数为电压2.5kv，电击时间5ms，电击后加入800μl冰预冷的sgm17培养基，混匀，将菌液转移至1.5ml离心管中，冰上放置10min，28℃厌氧培养2h，取适量菌液涂布于含有5μg/ml红霉素的gm17琼脂培养基上，28℃厌氧培养至平板长出多个单菌落时进行挑菌。从平板上挑取单个菌落，分别接种于含有5μg/ml红霉素的gm17液体培养基中，28℃厌氧培养48h后提取质粒，对重组质粒进行酶切鉴定和序列测定分析。将正确的克隆命名为重组pdcovs/atcc393乳酸乳杆菌(重组菌株)。
48.实施例3猪δ冠状病毒冻干疫苗的制备
49.将实施例2获得的重组pdcovs/atcc393乳酸乳杆菌以0.1％～0.5％的比例接种含有5μg/ml红霉素的gm17液体培养基中。28℃厌氧培养3～5天，od600为1.0～1.2时收获，作为pdcovs/atcc393乳酸乳杆菌种子。
50.将pdcovs/atcc393乳酸乳杆菌种子以0.1％～0.5％的比例接种gm17液体培养基，28℃厌氧培养3～5天，od600为1.0～1.2时收获。
51.将pdcovs/atcc393乳酸乳杆菌液，按1:1的体积比与冻干保护剂混合均匀，分装成2ml/支，进行冻干制成口服疫苗。冻干条件为降温1h到-45℃，然后抽真空2.5h，温度达到-40℃；自然升温1h，到-10℃；在此温度下保温8h，升温1h到0℃，保温1h；升温1h到30℃保温6h。
52.其中，冻干保护剂的配方为：2.5g明胶和10g海藻糖加入100ml纯化水中，搅拌均
匀，116℃灭菌40分钟，冷却至37℃备用。
53.1、口服疫苗的保存期试验
54.冻干疫苗分别置于4℃、-15℃和-70℃环境中，经过保存1、2、3、4、5、6个月后进行菌体复苏并计数，结果活菌数均大于108cfu/ml，保存试验的结果见表1。
55.表1冻干疫苗保存试验结果
[0056][0057]
冻干疫苗保存试验结果表明，所述口服疫苗即使在4℃的条件下，6个月内活力的下降幅度也是很小的，说明本发明提出的猪δ冠状病毒疫苗具有良好的保藏性能。
[0058]
2、猪δ冠状病毒疫苗的应用
[0059]
(1)实验方法
[0060]
健康易感的新生仔猪(要求母猪无猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病母源抗体，新生仔猪无相应病原体)9头，随机分为3组，每组3头。
[0061]
预防攻毒组：1日龄出生仔猪口服重组乳杆菌冻干疫苗，疫苗使用生理盐水进行复融到冻干前体积，使用注射器灌服，剂量为2ml/头；2日龄、3日龄时分别口服重组乳杆菌冻干疫苗。5日龄时口服猪δ冠状病毒，10id/ml，1ml/头。
[0062]
攻毒对照组：5日龄时口服猪δ冠状病病毒，10id/ml，1ml/头。
[0063]
空白对照组：不口服疫苗、不口服猪δ冠状病毒。与预防攻毒组和攻毒对照组隔离饲养。
[0064]
(2)实验结果
[0065]
预防攻毒组：0/3发病。
[0066]
攻毒对照组：3/3发病。
[0067]
空白对照组：0/3发病。
[0068]
结果如下表2所示。
[0069]
表2实验结果
[0070]
组别预防攻毒发病/总数预防攻毒组口服疫苗口服猪δ冠状病毒0/3攻毒对照组/口服猪δ冠状病毒3/3空白对照组//0/3
[0071]
实验结果显示，攻毒对照组3/3发病，表现为，仔猪出现食欲不振，排黄色或黄绿色
水样粪便，1/3出现呕吐，2/3出现体重下降。预防攻毒组与空白对照组，仔猪精神、食欲良好。
[0072]
(3)结论
[0073]
本发明提出的猪δ冠状病毒疫苗可以口服，且能够有效抵抗猪δ冠状病毒攻毒引起的腹泻症状。
[0074]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。