一株高蛋白酿酒酵母及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高蛋白酿酒酵母及其应用。


背景技术：

2.酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是一种单细胞生物，安全无致病性，具有生长周期短、代谢旺盛、发酵能力强以及含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生活活性物质等丰富营养成分的优点，是传统和现代生物技术领域非常重要的工业微生物，并在医药、精细化工、生物能源、工业酶制剂、饲料添加剂以及发酵食品等生物质产品的生产中得到广泛应用。
3.不同酵母菌所含的营养成分存在一定的差异性，酵母菌株经水解后能产生丰富的蛋白资源，可作为畜禽、水产和反刍等养殖动物的有效饲用蛋白，从而促进畜禽健康养殖、提高畜禽生产力、改善畜禽的繁殖力、稳定饲料品质及改良畜禽产品活力质量等；可作为营养多功能鲜味剂和风味增强剂，赋予产品不同的感官特性；也可作为人体优质蛋白质的最佳来源，提高人体免疫力，减缓疲劳，为身体提供均衡的营养补充。因此，高蛋白酵母菌株是获得高品质蛋白源的关键因素，能够为酵母抽提物的工业化生产奠定基础，也能满足饲料、食品、保健行业全面均衡可持续发展的刚性需求。
4.现有技术cn106399135中提供了一株高产蛋白酿酒酵母菌株c20140911及其选育、培养方法和应用，用以制备更好的微生态制剂及饲料添加剂，以期增强其临床使用效果，为食品安全及畜牧业生产服务。
5.现有技术cn106399135中提供了一种高产蛋白酵母菌株的选育采用了适应性进化技术手段，具体实施方法是使用麦芽汁培养基进行传代培养，从低剂量1％的蛋白胨开始，对酵母菌株进行生长耐受驯化，逐步增加蛋白胨剂量至8％，再经过多次复筛和传代试验，从而筛选出高产蛋白酵母菌株，并对该酵母菌株发酵液进行蛋白质含量、种类及生物信息学分析，包括go分析、kegg代谢通路分析、共有蛋白分析、共有组蛋白wego功能注释聚类分析等；选择初始ph、培养温度、装液量等单因素进行响应面法分析，通过菌落数指标及方差分析模拟方程等确定最佳培养条件；再进行仔猪肠道微生物区系分析，检测其回肠、盲肠、结肠的微生物数量变化，包括大肠杆菌、沙门氏菌、需氧菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、厌氧菌，并通过仔猪日增重、日采食量、体重等指标进行生产性能分析。


技术实现要素：

6.现有技术中的酿酒酵母菌株不能同时具有高生物量、高蛋白质、高rna性能，针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有高生物量、高蛋白质、高rna的酿酒酵母菌株。通常，酵母细胞内蛋白质含量为40%以上，目前，已报道的文献或专利中酵母菌株蛋白质含量最高为62.4%，本发明中通过自然筛选获得一株蛋白质含量为68.13%的酵母菌株，其蛋白质含量高于已有文献或专利研究水平。
7.第一方面，本发明提供一种高蛋白酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株为：酿酒酵母
amcc 30743菌株（saccharomyces cerevisiae amcc 30743），所述酿酒酵母amcc 30743菌株（saccharomyces cerevisiae amcc 30743）于2021年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctcc no：m 2021941。
8.优选地，所述酿酒酵母amcc 30743菌株的26s rdna基因序列如seq id no.1所示。
9.第二方面，本发明提供所述的酿酒酵母菌株的发酵制备方法，所述方法包含如下步骤：培养所述的酿酒酵母amcc 30743菌株。
10.优选地，所述制备方法包括如下步骤：（1）将所述的酿酒酵母amcc 30743菌株放大培养；（2）将步骤（1）得到的产物加入到液体培养基中，在26
‑
32℃条件下发酵培养。
11.第三方面，本发明提供一种菌剂，所述菌剂通过所述的酿酒酵母amcc 30743菌株得到。
12.第四方面，本发明提供所述的酿酒酵母amcc 30743菌株在酵母抽提物中的应用。
13.第五方面，本发明提供一种酵母抽提物，所述酵母抽提物通过包含所述的酿酒酵母amcc 30743菌株或所述的菌剂制备得到。
14.第六方面，本发明提供一种菌剂，所述菌剂通过所述的制备方法发酵得到。
15.优选地，在摇瓶中培养15
‑
20h，得到所述菌剂的生物量为48
‑
52g/l；或者，优选地，所述菌剂的细胞内蛋白质含量为大于菌体干重的65wt%；或者，优选地，所述菌剂的rna含量为大于菌体干重的15wt%；或者，优选地，所述菌剂的细胞内谷氨酸含量大于9%；或者，优选地，所述菌剂的细胞内琥珀酸含量，以酵母乳与去离子水质量体积比为1:10加入去离子水，破碎细胞后，测得上清液中琥珀酸含量大于460μg/ml。
16.第七方面，本发明提供所述的酿酒酵母amcc 30743菌株或所述的菌剂或所述的酵母抽提物在饲料、食品、保健品中的应用。
17.本发明还提供所述的酿酒酵母amcc 30743菌株或所述的菌剂或所述的酵母抽提物在调味品中的应用。
18.本发明提供的酿酒酵母菌株具有高生物量、高蛋白质、高rna的特点，可应用于饲料、食品、保健等行业，实现高蛋白水解物工业化的可持续发展。
19.菌种保藏信息本发明提供的酿酒酵母菌株分类命名为酿酒酵母amcc 30743 saccharomyces cerevisiae amcc 30743，于2021年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctcc no：m 2021941，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：027
‑
68754052。
附图说明
20.图1 实施例3中酵母菌株生物量测定结果；图2 实施例3中酵母菌株蛋白质含量测定结果；图3 实施例3中酵母菌株rna含量测定结果；图4 实施例4中酵母菌株氨基酸组分含量测定结果；图5 实施例5中琥珀酸含量测定结果。
具体实施方式
21.本发明中提供的酿酒酵母菌株具有高生物量、高蛋白质、高rna的特点。本发明提供的酿酒酵母菌株，首先，从西藏阿里地区的发酵酸奶样品中分离、纯化、鉴定得到6株比生长速率大于或等于0.3 h
‑1的酵母菌株；然后，摇瓶发酵收集酵母乳，评估其生理生化指标，包括生物量、蛋白质、rna。本发明以酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）fx
‑
2为对照菌株，筛选标准为生物量达到对照菌株的110
‑
120%，蛋白质含量达到对照菌株的100
‑
110%，rna含量达到对照菌株的110
‑
120%；最后，对优选菌株进行谷氨酸含量和琥珀酸含量分析，谷氨酸含量分析的筛选标准为谷氨酸含量至少达到对照菌株的125
‑
130%，琥珀酸含量分析的筛选标准为达到对照菌株的110
‑
120%。
22.本发明中所用的对照菌株酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）fx
‑
2于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏编号为cctcc no: m 2016418，并且已在cn108220175a中记载。
23.高蛋白酵母菌株是获得高品质蛋白源的关键因素，能够为酵母抽提物的工业化生产奠定基础，也能满足饲料、食品、保健行业全面均衡可持续发展的刚性需求。
24.实施例中涉及的培养基成分组成如下：ypd培养基：酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、琼脂20 g、水1000 ml，115℃ 灭菌20 min。
25.本发明中所述的酵母乳是指将发酵获得的发酵液经离心去除上清液后，再洗涤、抽滤、压滤，分离收集得到菌体即得所述酵母乳。
26.下表1和表2所示为本发明实施例中所使用的试剂及仪器来源信息。
27.表1 试剂信息表表2 仪器信息表
实施例1酵母菌株分离纯化与鉴定将采集于西藏山南市的发酵奶制品样品溶于无菌水中混匀，吸取菌悬液以10倍系列稀释制备10
‑5、10
‑6菌悬液，涂布于ypd培养基，30℃培养24
‑
48h，制片于显微镜下观察酵母形态，同时观察平板上单菌落特性，将具有典型酵母菌落特征的菌株分离、划线纯化2次，接种于ypd斜面培养基，4℃保存。共计得到30株酵母菌株。
28.得到的酵母菌株菌落质地为奶酪状，颜色为乳白色，表面有褶皱，边缘呈波浪形；显微形态呈椭圆形，出芽生殖。
29.实施例2生长曲线初筛将实施例1中分离纯化后得到的30株酵母菌株接种至装有5mlypd液体培养基的试管中，30℃、180rpm，培养20h，再按3%接种量接种至装有300ulypd液体培养基的100孔培养板中，准备bioscreen仪器上机测定，设置参数：温度30℃、时间24h，波长600nm，每隔30min测量一次数据，分析比生长速率，具体公式如下：比生长速率（μ）=（lnod2－lnod1）
÷
（t2－t1）式中：od1：t1时对应的od
600
值；od2：t2时对应的od
600
值；t2：对数生长期结束时间；t1：对数生长期起始时间。
30.筛选标准为比生长速率大于或等于0.3h
‑1。在30株酵母菌株中优选得到6株具有生长优势的酵母菌株，依次命名为菌株1、菌株2、菌株3、菌株4、菌株5、菌株6，根据实施例一中的结果表明该6株酵母菌株的种属信息都为酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）。6株具有生长优势酵母菌株的比生长速率如下表3中所示。
31.表36株具有生长优势酵母菌株的比生长速率
实施例3摇瓶发酵筛选测定实施例2中的6株具有生长优势的酵母菌株的生物量、蛋白质、rna等指标，以现有酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）fx
‑
2为对照。将7株酵母菌株分别接种至装有5 ml ypd液体培养基的试管中，30℃、180 rpm，培养20 h，再按0.6%接种量接种至装有300 ml ypd液体培养基的三角瓶中，30℃、180 rpm，培养18 h，离心，去上清，收集酵母乳，测定生物量、蛋白质、rna等指标。
32.酵母乳生理指标筛选标准为：生物量达到对照菌株110
‑
120%；蛋白质含量达到对照菌株的100
‑
110%；rna含量达到对照菌株110
‑
120%。相对增益计算公式如下：相对增益(%)=(筛选菌株的生理指标含量
÷
对照菌株的生理指标含量)
×
1001、生物量测定对酵母乳进行称重即为生物量测定。
33.生物量指标测定结果如图1和表4所示，对照菌株生物量为42 g/l，该指标优于对照菌株的有菌株3（48 g/l）和菌株4（52 g/l），分别超过对照14.3%和23.8%，菌株5和菌株6的生物量水平与对照菌株一致。
34.2、干物质检测方法样品于103
±
2 ℃烘箱内直接干燥，失去水分后，所得质量的百分数即为干物质百分含量。
35.3、酵母乳蛋白质检测方法精确称取1 g酵母乳（称准至0.0002 g）于消化管中，加入2.5 g消化粉，沿管壁缓缓加入10 ml浓硫酸，然后置消化装置上，消化约3小时至无烟，溶液变清，呈淡黄色后，继续加热10 min。取出消化管，放冷，用约30 ml蒸馏水冲洗管壁，再冷却，然后移入100 ml容量瓶中，用少量水冲洗消化管3次，全部倒入容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得消化液，待用。准确吸取消化液25 ml于消化管中，置蒸馏装置上。取25 ml硼酸溶液于三角瓶中，加4
‑
6滴甲基红
‑
溴甲酚绿混合指示剂，作为接收液，放在接收台上。打开循环水阀门，加入25 ml氢氧化钠溶液于消化管中，打开蒸汽开关，将接收台提起，使接收管浸入接收液中，蒸馏至接收液为150
‑
200 ml时停止蒸馏，放下接收台，关掉蒸汽及循环水，用蒸馏水冲洗接收管口，取出接收瓶。用0.05 mol/l的硫酸标准溶液滴定接收液，颜色由绿色至微红色即为终点，按照上法同时做空白试验，蛋白质含量按公式计算：x=[c
×
(v1
‑
v2)
×
0.01401]
÷
(w
×
ds
×
25
÷
100)
×
100
×
6.25式中：x
‑‑‑‑
试样中蛋白质的百分含量，%
ꢀ
c
‑‑‑‑
硫酸标准溶液的浓度，mol/l； v1
‑‑‑‑
滴定试样消耗硫酸标准溶液的体积，ml； v2
‑‑‑‑
滴定空白消耗硫酸标准溶液的体积，ml；0.01401
‑‑‑‑
与1.00 ml硫酸[c(1/2h2so4)=1.000 mol/l]标准溶液相当的以克表示的氮的质量； w
‑‑‑‑
试样的质量，g； ds
‑‑‑‑
试样干物质百分含量，%； 25
‑‑‑‑
样品消化液的体积，ml； 6.25
‑‑‑‑
氮与粗蛋白换算系数。
[0036]
蛋白质含量测定结果如图2和表4所示，对照菌株蛋白质含量为60.91%，蛋白质含量大于60%的菌株有菌株1、菌株3、菌株4、菌株6，其中超过对照的菌株有菌株3和菌株4，菌株3的蛋白质含量为68.13%，菌株4的蛋白质含量为65.25%。
[0037]
4、 rna检测方法称取0.4
‑
0.8 g酵母乳样品至离心管并称其重量，加入8 ml冷的0.25 mol/l hclo4，振荡混匀后立即放入4℃冷水中，静置15 min；4000 rpm离心10min，弃上清，在沉淀中加入5 ml的0.5 mol/l hclo4，振荡混匀将该离心管放入70℃水浴锅中，保温15 min，每隔5 min振荡一次；4000 rpm离心10 min，吸取1 ml上清液，用蒸馏水定容至100 ml，混匀。用待测样品冲洗比色皿，装满比色皿后放入分光光度计。擦净表面，在260 nm测光吸收值，用蒸馏水作为空白，记录吸光度，公式如下：rna(%)= (a
×
100
×
0.03365
×5×
100)
ꢀ÷
(m
×
ds)式中：a
‑‑‑‑
样品溶液的吸光度；m
‑‑‑‑
称取样品的质量，mg；ds
‑‑‑‑
样品的干物质；5
‑‑‑‑
再加入0.5 mol/l hclo4后溶液的体积；0.03365
‑‑‑‑
对应于吸光度为1时，待测溶液中rna的含量，mg/100ml。
[0038]
rna指标测定结果如图3和表4所示，对照菌株rna含量为13.9%，超过对照的菌株有菌株2、菌株3、菌株4。
[0039]
表4 酵母乳生理指标数据及相对增益（%） 生物量（g/l）相对增益（%）蛋白质（%）相对增益（%）rna（%）相对增益（%）对照42100%60.91100%13.9100%菌株13583%60.71100%12.4389%菌株23890%59.5798%14.13102%菌株348114%68.13112%15.99115%菌株452124%65.25107%15.29110%菌株542100%58.8597%13.2495%菌株642100%60.5399%13.7599%
如上表4所示，生物量指标方面，菌株3和菌株4达到优选标准110
‑
120%；蛋白质指标方面，菌株1、菌株3、菌株4达到优选标准100
‑
110%；rna指标方面，菌株3和菌株4达到优选标准110
‑
120%。综上所述菌株3和菌株4的生物量、蛋白质、rna含量指标都优于对照菌株，可
进行后续指标测定。
[0040]
实施例4谷氨酸含量分析酵母菌株的氨基酸组分差异导致了菌株代谢物具有丰富的呈味特性，其中谷氨酸是鲜味的代表氨基酸。
[0041]
将菌株3、菌株4和对照菌株分别接种至装有5 ml ypd液体培养基的试管中，30℃、180 rpm，培养20 h，再按0.6%接种量接种至装有300 ml ypd液体培养基的三角瓶中，30℃、180 rpm，培养18 h，离心，去上清，收集酵母乳，称取0.5
‑
1 g，置于50 ml容量瓶中，加入20 ml磺基水杨酸超声至充分溶解后，定容至50 ml刻度，充分混匀，静置1 h后准确吸取上清1 ml于25 ml容量瓶中，加入柠檬酸钠缓冲液定容至刻度，混匀后经0.45 μm微孔滤膜过滤至进样瓶，选择混合氨基酸标准溶液作为外标，利用氨基酸自动分析仪检测各类氨基酸组分含量，公式如下：样品测定液氨基酸的含量：ci= cs
÷
as
×
ai式中：ci
‑‑‑‑
样品测定液氨基酸i的含量，nmol/l；ai
‑‑‑‑
样品测定液氨基酸i的面积，mg；as
‑‑‑‑
氨基酸标准工作液氨基酸s的峰面积；cs
‑‑‑‑
氨基酸标准工作液氨基酸s的含量，nmol/l；样品中各氨基酸的含量：xi= (ci
×
f
×
v
×
m)
÷
(m
×
10
9 )
×
100式中：xi
‑‑‑‑
样品中氨基酸i的含量，g/100g；ci
‑‑‑‑
样品测定液氨基酸i的含量，nmol/ml；f
‑‑‑‑
稀释倍数；v
‑‑‑‑
样品定容的体积，ml;m
‑‑‑‑
氨基酸i的摩尔质量，g/mol；m
‑‑‑‑
称样量，g；109‑‑‑‑
将样品含量由ng折算成g的系数；100
‑‑‑‑
换算系数。
[0042]
cs
‑‑‑‑
氨基酸标准工作液氨基酸s的含量，nmol/l；图4所示为菌株3、菌株4和对照菌株氨基酸组分含量，结果表明谷氨酸在17种游离氨基酸中含量占比最高。表5所示为菌株3、菌株4和对照菌株谷氨酸组分含量，其中，菌株3的谷氨酸含量相对对照为130%，菌株4的谷氨酸含量相对对照为123%，即菌株3达到了优选标准125—130%。
[0043]
表5 酵母菌株谷氨酸组分含量（%） 谷氨酸（%）相对增益对照7.45/菌株39.69130%菌株49.18123%实施例5琥珀酸含量分析将菌株3、菌株4和对照菌株活化后依次经过250 ml培养瓶培养、以ypd液体为培养
基，20 l发酵罐培养，再洗涤、抽滤、压滤，分离收集菌体，得酵母乳，按照质量体积比为1:10加入去离子水，ph 6.5，高压均质2次。45℃搅拌，使酵母自溶36 h，9000 rpm离心，取上清，0.22μm针式滤器过滤，注入液相色谱仪进行测定，同时，选择琥珀酸标品进行液相分析。图5和表6所示为菌株3、菌株4和对照菌株琥珀酸含量。
[0044]
表6 琥珀酸含量 琥珀酸（μg/ml）相对增益对照371.4/菌株3463.6125%菌株4406109%图5和表6结果表明，菌株3的琥珀酸含量为463.6 μg/ml，相对增益为125%，达到优选标准110
‑
120%。
[0045]
实施例6菌株鉴定提取菌株3基因组，以nl1（5
’‑
gcatatcaataagcggaggaaaag
‑3’
）、nl4（5
’‑
ggtccgtgtttcaagacgg
ꢀ‑3’
）为引物扩增酵母26s rdna序列，经1%凝胶电泳检测及测序后，得到菌株3的26s rdna基因序列如seq id no.1所示。seq id no.1的基因序列如下所示：acggggatgcttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaacccccggacca将菌株3命名为酿酒酵母amcc 30743菌株（saccharomyces cerevisiae amcc 30743），并将酿酒酵母amcc 30743菌株（saccharomyces cerevisiae amcc 30743）进行保藏。所述酿酒酵母amcc 30743菌株（saccharomyces cerevisiae amcc 30743）于2021年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctcc no：m 2021941。