一种DNA提取方法、试剂盒以及构建的DNA文库与流程

一种dna提取方法、试剂盒以及构建的dna文库
技术领域
1.本发明涉及一种dna提取方法、试剂盒以及构建的dna文库，特别涉及从骨骼中提取dna的技术，属于基因检测技术领域。


背景技术：

2.随着发病率和死亡率的不断增加，癌症已经成为中国人群死亡的首要原因和主要的公共健康问题。根据国家癌症中心统计，2015年中国约有429万例癌症新发病例，281万例癌症患者死亡。其中，骨肿瘤是来源于骨与软骨组织的恶性肿瘤，不同类型的死亡率不尽相同，尤以恶性骨肿瘤进展迅速，预后不佳，死亡率高。
3.随着各种治疗手段的不断兴起，如早期的放疗，近代的化疗到现在的靶向及免疫治疗等，癌症的治疗逐渐向精准化治疗模式发展，使患者的生存率和生活质量大大提高。但肿瘤本身具有异质性，即使是同一来源的肿瘤，对同样的治疗方案响应也有所差异。随着分子水平研究的不断深入，越来越多的肿瘤细胞信号通路被发现，通路中特定基因的扩增/突变/表达状态与靶向、化疗药物的有效性密切相关。据此，新版的世界卫生组织(who)软组织和骨肿瘤分类，也增加了很多在分子和基因改变、免疫组化标记和生物学机制等方面新的认识。因此，临床上检测这些通路中特定基因的扩增/突变/表达情况，可以针对性地为每位患者选择最适合的治疗方案，从而最大程度地提高治疗的有效率，减少药物的毒副作用，避免用药不当贻误治疗时机。
4.高通量测序技术又称为下一代测序技术，由于其高通量，灵敏度高等特性，可以同步检测点突变、缺失插入突变、拷贝数变化、融合等多种类型突变，更全面了解患者遗传变异，在癌症基因检测中得到广泛应用。作为高通量测序最为重要的一环，样本dna的提取和文库构建就显得尤为重要，目前临床中使用最普遍的样本是新鲜组织或福尔马林固定的石蜡包埋样本，而骨肿瘤由于其肿瘤细胞来源的特殊性，往往不具有普通的细胞组织结构，难以用常规方法进行处理。
5.骨和骨样组织的恶性增生是骨肿瘤的常见表现，导致患者常常伴有相应的疼痛、肿胀甚至是病理性骨折。骨和骨样组织由肿瘤细胞发育而来，携带有肿瘤细胞的突变特征，除了能够在病理层面明确诊断，还能够反映肿瘤的分子生物学特征。
6.但是，对于从骨骼样本中提取dna的过程而言，骨组织由于具有高度钙化的特点和不易受环境及理化因素的影响，使得其难以酶解消化，而dna中大量钙的存在会抑制pcr扩增。现有技术中，在对骨骼dna的提取过程中通常会采用硅胶吸附的方式对dna进行吸附和洗脱分离，但是由于硅胶表面带有大量羟基，其等电点约为ph2-3，在高于等电点的情况下会显负电荷，会与骨骼样本裂解液中的ca
2+
离子产生吸附作用，形成了si-o-ca
+
或者si-o-ca
+
oh-的结构，使得其表面的活性位点被占据，由于硅胶对dna的吸附是基于表面羟基与核酸上的磷酸基通过钠桥进行键合，当羟基被占据时也导致了硅胶对dna的吸附量下降；同时在进行dna洗脱的过程中也会存在着ca
2+
离子的同步洗脱使得最终获得的样本中仍然存在ca
2+
离子，导致了后续的pcr扩增效率受到影响；即使在样本的前处理的过程中使用了例如
edta络合等方法对骨骼中的ca
2+
离子进行了去除，但仍然存在着去除率不高的问题影响到了pcr过程以及制备得到的文库质量。


技术实现要素：

7.通过大量试验探索，本发明意外地发现了一种能够从骨骼中提取得到较高纯度的dna的方法和专用试剂盒，利用该技术可以优化现有技术中从骨骼中提取dna检出率不足的问题；并且通过对样本进行处理之后，能够有效地实现dna文库的构建，这种方法提取得到的dna可以通过高通量测序，能够有效检出患者携带的突变。
8.一种骨骼提取dna方法，包括如下步骤：
9.步骤1，骨骼样本粉碎；
10.步骤2，步骤1中样品加入至裂解液、蛋白酶进行孵育处理，再加入dna析出液；
11.步骤3，对步骤2中获得的样品采用硅胶膜柱吸附方式进行吸附、洗涤和解吸后，获得dna；所述的硅胶膜上中还混合有对ca
2+
进行吸附的材料。
12.在一个实施例中，所述的裂解液中包含有50-300mmol tris-hcl、1-10m异硫氰酸胍、10-100mmol edta、200-800mmol nacl、0.2-0.5％二甲基亚砜、0.5-5％表面活性剂。
13.在一个实施例中，所述的表面活性剂是十六烷基三甲基溴化铵。
14.在一个实施例中，所述的dna析出液中包含有0.05-0.4mol/l nacl、0.01～0.1m po
43-。
15.在一个实施例中，对ca
2+
进行吸附的材料是指海藻酸。
16.在一个实施例中，硅胶膜的制备方法包括如下步骤：配制含有海藻酸钠的水溶液，滴加于负载于衬底上的硅胶膜表面，烘干处理后，置于盐酸中对ca
2+
进行置换。
17.在一个实施例中，海藻酸钠在水溶液中的浓度0.5-1wt％，硅胶膜表面的海藻酸的滴加量是5
×
10-4
～1
×
10-3g·
cm-2
，盐酸ph值为1.0-3.0。
18.在一个实施例中，在进行解吸之前，采用盐溶液和/或醇溶液对硅胶柱进行洗涤。
19.在一个实施例中，所述的盐溶液洗涤溶液和醇洗涤溶液对吸附柱进行冲洗。
20.在一个实施例中，所述的盐溶液的ph酸性。
21.在一个实施例中，所述的盐溶液中包含0.5～10m盐酸胍、5～50mm edta-2na、5-10％乙醇、0.1～1％hcl。
22.在一个实施例中，所述的醇洗涤溶液是体积比50-90％的醇水溶液，所述的醇是乙醇。
23.在一个实施例中，解吸过程采用的解吸剂是无酶水。
24.有益效果
25.骨骼提取的dna特有突变检出率较传统方法高，能够从骨骼中提取到满足建库需求dna，本提取方法克服了骨骼提取dna中残留的ca
2+
对dna提取量和文库质量的影响。
附图说明
26.图1是骨骼dna片段经过磁珠富集纯化后的电泳图；
27.图2是实施例2中得到的dna构建文库的质控图；
具体实施方式
28.本发明提供的从骨骼中获得dna的方法，可以较好地从骨骼中获得适合于文库构建的dna，这种提取方法主要是通过离心、蛋白酶k处理、柱吸附的方法获得了骨骼中的dna。
29.1.dna的提取
30.1.1样本破碎：
31.在样本破碎中，主要目的是使骨骼破碎成较小样本快，并进一步研磨成粉末，骨骼中含有dna，经过提取后适合于文库构建。
32.1.2蛋白分解处理：
33.样品中需要加入裂解液，这里采用的裂解液的成分可以是包含50-300mmol tris-hcl、1-10m异硫氰酸胍、10-100mmol edta、200-800mmol nacl、0.2-0.5％二甲基亚砜、0.5-5％十六烷基三甲基溴化铵；处理结束后，采用蛋白酶k对样品孵育处理，蛋白酶k可以分解掉细胞中的蛋白质，孵育过程的温度可以控制在45℃水浴10min；孵育结束后，还需要再加入dna析出液以维持样本体系，可以提供一个低盐环境，有利于dna的析出，此外，通过低盐促进残留蛋白质的盐溶，并除去残留蛋白质，减少后续蛋白质的污染，所述的dna析出液中包含有0.05-0.4mol/l nacl、0.01～0.1m po
43-溶液。
34.1.3柱吸附：
35.在得到蛋白酶k处理后的样品后，准备进行柱吸附操作，这里所采用的吸附柱可以是硅胶柱，由于在骨骼的处理中会产生ca
2+
离子，会影响到pcr扩增反应，本专利中的硅胶柱中采用的是负载有吸附ca
2+
离子的海藻酸，由于dna析出液中残留的ca
2+
离子会与硅胶表面的羟基进行结合，也影响到了硅胶表面的活性吸附位点，抑制了dna分子上的磷酸根与硅胶表面的羟基的键合；通过海藻酸在硅胶表面的沉积，与硅胶形成竞争性吸附，抑制了ca
2+
离子与硅胶表面羟基的结合；吸附过程结束后，采用洗涤液进行冲洗，本专利中应该采用酸性溶液进行预洗涤，由于在酸性条件下，可以使ca
2+
从海藻酸表面被置换，同时又由于核酸在硅胶表面的结合在酸性条件下不易被分离，因此，恰好可以利用这个手段实现ca
2+
与dna的分离，使得在进行对dna的洗脱处理时，吸附柱的表面的ca
2+
已经被去除，也避免了洗脱过程中ca
2+
与dna同时被洗脱，进而影响到pcr反应过程，并且预洗涤的过程可以有效地去除掉样品中的杂质，可以采用两种洗涤缓冲液进行依次冲洗，盐洗涤溶液的组成是：0.5～10m盐酸胍、5～50mm edta-2na、5-10％乙醇、0.1～1％hcl，醇洗涤溶液的组成是：50-90％的醇水溶液；这里的硅胶的制备原理是首先将硅胶模的表面滴加海藻酸水溶液进行浸润，烘干(可重复多次)，用盐酸水溶液对ca
2+
置换后，得到海藻酸处理的硅胶膜。
36.纳米级多孔吸附硅胶和海藻酸钠分散于水中，使得海藻酸钠在硅胶表面进行沉积，然后将产物通过盐酸置换出ca
2+
离子后，实现海藻酸在硅胶表面的形成。
37.在将杂质洗涤之后，使用解吸液对吸附的dna进行洗脱，得到含有dna的洗脱液，这里的洗脱液优选采用无酶水。
38.2.文库构建：
39.获得了dna后，将其构建文库后，可以表现出更高的突变检出率。这里的构建文库的方法，可以包括有对提取得到的dna进行超声破碎，并富集纯化；对dna片断依次进行末端修复、3'末端加上碱基a、两端加上接头、纯化等步骤。
40.上述方法得到的dna文库可以应用于非治疗与诊断目的的基因测序中，特别是适
用于ngs方法测序。上述的dna提取试剂盒可以应用在文库构建试剂盒中，也同样适用于基因测序中。
41.实施例1
42.1骨骼样本的破碎
43.取骨骼样本用刀将其破碎成小块，然后使用自动研磨机将小块样本磨成粉末状；取出预处理好的粉末状骨骼样本，加入220μl裂解液，裂解液中包含有200mmol tris-hcl、3m异硫氰酸胍、40mmol edta、400mmol nacl、0.3％二甲基亚砜、1％十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，加入20μl蛋白酶k，充分消化；样本放置于恒温金属浴上，600rpm振荡，54℃消化1-2h直至样本完全消化；
44.再加入2ml dna析出液(包含有0.2mol/l nacl、0.05m po
43-)，颠倒混匀；再通过硅胶柱进行吸附；硅胶柱中填充的是负载海藻酸的硅胶，其制备过程是：配制含有0.5-1wt％海藻酸钠的水溶液，滴加于负载于衬底上的硅胶膜表面，滴加量是5
×
10-4g·
cm-2
，烘干处理后，置于ph值为1.0盐酸中对ca
2+
进行置换。
45.向吸附柱中加入400μl盐溶液(由1.5m盐酸胍、20mm edta-2na、5％乙醇、0.5％hcl配制)进行洗涤，再使用200μl 85％乙醇溶液洗涤；再向硅胶模柱中加入10μl无酶水离心处理，将洗脱后的dna转移到新的1.5ml吸附管中，加入40μl无酶水，静置后离心处理，获得提取得到的dna样本。
46.对照例1
47.与实施例1的区别在于：硅胶膜柱未经过海藻酸钠溶液处理。
48.对照例2
49.与实施例1的区别在于：盐溶液洗涤时洗涤液中未通过hcl调节ph，为ph中性。
50.对照例3
51.本实施例采用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取dna，首先取骨骼样本用刀将其破碎成小块，然后使用自动研磨机将小块样本磨成粉末状；将粉末中加入1％sds溶液350ml、20mg/ml蛋白酶k溶液20μl，漩涡震荡混匀，58℃水浴75min，加入酚-氯仿-异戊醇混合液700μl，漩涡震荡混匀，4℃下12000rpm离心10min，将上清移至新的离心管中，加入异丙醇800μl，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心10min，倾弃上清，加入75％乙醇1ml，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心10min，倾弃上清，65℃金属浴直至残余液体完全干燥，加入去离子水10μl，65℃溶解10min，-20℃保存。
52.采用上述实施例1和对照例1～2中得到的dna样本，取1μl进行qubit定量。
53.表1 dna样本定量结果
[0054][0055][0056]
可以看出，进行上述的提取过程中，硅胶膜柱表面的海藻酸对ca
2+
进行了竞争性吸附，避免了硅胶表面的-oh位点被占据，能够有效地与核酸分子上的磷酸基产生钠桥连接，提高了提取量；同时，在进行洗涤时，利用了ca
2+
能够被h
+
置换而核酸不易在酸性条件下洗脱的特点，使ca
2+
与dna产生了分离，并提高了提取质量。
[0057]
提取得到的dna进行超声破碎，并富集纯化；对dna片断依次进行末端修复、3'末端加上碱基a、两端加上接头、纯化等步骤，构建测序文库，实施例1中得到的文库的质控图如图2所示。可以看出，采用本发明提取方法得到的dna构建文库具有更好的碱基质量。
[0058]
突变检出率试验
[0059]
为了探究骨骼样本是否可以作为ngs检测样本，随机选取了8例骨肿瘤患者，对其骨骼样本进行检测。
[0060]
骨骼样本采用实施例1和实施例2中的提取和文库构建方法。检测结果如下表。
[0061]
肿瘤特有突变检出率比较
[0062][0063]
综上可以看出，骨骼提取的dna特有突变检出率较传统方法高，能够从骨骼中提取到满足建库需求dna，本提取方法克服了骨骼提取dna中残留的ca
2+
对dna提取量和文库质量的影响。