1.本发明涉及干细胞培养及冻存技术领域，具体为一种脐带间充质干细胞的培养及冻存方法。
背景技术：
2.脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell.uc.msc)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，体外可诱导分化为骨、软骨、成脂分化、心肌、肝细胞样细胞，可广泛用于各种损伤和退变性疾病治疗，因其具有材料来源丰富、适于标准化制备、临床应用免疫原性低等特点，将成为未来干细胞临床应用的理想选择。
3.细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术,细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用,细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化,并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化,因此,及时进行细胞冻存十分必要,细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久,细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的，利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。
4.通常对于脐带原代组织的培养方法主要有酶消化法、组织贴壁法以及两者结合的酶组织法，上述方法均能够分离得到脐带间充质干细胞，但是，酶消化法成本高，消化时间难于控制，消化液黏稠而不易分离，而且胶原酶对细胞有直接损伤作用；传统的组织贴壁法较为简单，成本低，但是细胞爬出时间过长，通常需要10d左右；两者结合的酶组织法为贴壁培养酶消化后的组织块，方法虽也简易，细胞易于爬出，但是操作步骤比较繁琐，细胞接触东西比较多，容易污染。上述3种方法各有利弊，且目前大部分脐带间充质干细胞制备体系采用胎牛血清，会存在引进外源病毒等风险。
技术实现要素：
5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的培养及冻存方法，解决了酶消化法、组织贴壁法以及两者结合的酶组织法各有利弊，且目前大部分脐带间充质干细胞制备体系采用胎牛血清，会存在引进外源病毒等风险的问题。
7.(二)技术方案
8.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种脐带间充质干细胞的培养及冻存方法，包括以下步骤：
9.s1.实验前准备
10.在实验前，提前打开洁净区的紫外灯照射30min以上，并且打开实验室风机，接收人员做好接收脐带的准备工作，将接收的脐带储存瓶传至间充质干细胞制备室，对其信息
进行核对，检查储存瓶是否在存在漏液现象，密封标签是否完好、准确，有无肉眼可见的微生物污染，脐带资料是否完整并符合制备要求。
11.s2.脐带消毒
12.将脐带储藏瓶的外表面用75％酒精擦拭消毒后，放入正常运行的生物安全柜中，将符合洁净要求的实验所需的物料用75％的酒精消毒后放入生物安全柜，打开脐带储存瓶，向脐带储存瓶内倒入75％的酒精100ml，浸泡2分钟进行消毒。
13.s3.脐带清洗
14.将脐带夹出用适量的生理盐水清洗脐带表面的酒精，将其转入新的装有生理盐水的培养皿中，清洗脐带表面及血管内部的血渍，将在新的培养皿中的脐带剪成适合长度的小段，用生理盐水清洗几遍，直至清洗液无色。
15.s4.脐带华通氏胶分离
16.用无菌手术镊取脐带小段放入100mm培养皿中，剥离出华通氏胶放入装有生理盐水的100mm培养皿中，用生理盐水清洗华通氏胶并转移至50ml离心管中，确保清洗液无色，将清洗干净的华通氏胶转入新的50ml离心管中，最后一次的清洗液留待无菌检验。
17.s5.脐带间充质干细胞的制备
18.用弯头手术剪将离心管中的华通氏胶剪碎成1-3mm3大小的组织块，然后将其接种至t75的培养瓶中，加入提前配置好的培养基，轻轻晃动，尽量使组织均匀平铺在瓶底，标注编码、日期及代次，操作结束后放入37℃，5％co2培养箱中培养。
19.s6.脐带间充质干细胞的培养
20.根据脐带间充质干细胞状态进行3次换液，每次换液结束后将装有间充质干细胞的t75培养瓶重新放入37℃，5％co2培养箱中培养。
21.s7.脐带间充质干细胞的传代
22.p0传代p1代，置于倒置显微镜下观察，t75培养瓶中70％的组织块周围长满80％的细胞时，进行传代操作；
23.p1代传p2代，置于倒置显微镜下观察，t175培养瓶中细胞融合度达到80％，进行传代操作；
24.p2代传p3代，置于倒置显微镜下观察，t175培养瓶中细胞融合度达到80％，进行传代操作。
25.s8.脐带间充质干细胞冻存
26.将p3代的干细胞进行冻存操作，然后将冻存的干细胞进行系列检测，在各项检测合格后，完成干细胞的冻存。
27.优选的，所述步骤s3中脐带被剪成的小段长2～3cm。
28.优选的，所述步骤s4中的脐带华通氏胶分离具体操作为：用无菌手术镊取脐带小段放入100mm培养皿中，剥离出华通氏胶放入装有生理盐水的100mm培养皿中，用生理盐水清洗华通氏胶并转移至50ml离心管中。
29.优选的，所述步骤s5中脐带间充质干细胞的具体制备过程为：
30.1)在lonza的无血清培养基中加入一定量的血清替代物和谷氨酰胺，配置后的培养基中血清替代物和谷氨酰胺的终浓度分别为2％和2mmol/l；
31.2)用弯头无菌手术剪将华通氏胶剪成约1～3mm3大小的组织块，将华通氏胶组织
块转移至含有培养基的t75培养瓶中，在t75培养瓶上标注编码、日期及代次，最后将培养瓶放入37℃，5％co2培养箱中培养。
32.优选的，所述步骤s7中脐带间充质干细胞的传代过程具体为：
33.1)传代前确认
34.p0传代p1，置于倒置显微镜下观察，t75培养瓶中70％的组织块周围长满80％的细胞时，进行传代操作，p1代后传代，置于倒置显微镜下观察，t175培养瓶中细胞融合度达到80％，进行传代操作；
35.2)脐带间充质干细胞传代操作
36.将培养瓶中细胞表面用生理盐水清洗后，用胰蛋白酶进行消化，轻轻晃动并拍打培养瓶侧壁，使贴壁组织块和细胞与培养瓶底分离，随后终止消化；
37.3)细胞收集
38.将培养瓶中的混合液收集到50ml离心管中，再向培养瓶中加入适量生理盐水，轻轻晃动后用上述50ml离心管收集清洗液；
39.4)细胞清洗
40.p0组织块过滤：将离心后的50ml离心管中的上清液缓慢废弃，加入适量生理盐水轻轻吹悬沉淀，过输血器，用新的50ml离心管离心收集细胞悬液；
41.p1代以后：将离心后50ml离心管中的上清液缓慢废弃，分别向离心管中加入适量生理盐水轻轻吹悬沉淀；
42.5)脐带间充质干细胞接种
43.按细胞密度2
×
106/t175接种脐带间充质干细胞，标注编码日期及代次，将培养基轻轻摇晃均匀，使细胞悬液平铺瓶底，放入37℃，5％co2培养箱中培养。
44.优选的，所述步骤s8中脐带间充质干细胞冻存过程为：
45.1)冻存前样本确认
46.将冻存的脐带间充质干细胞置于倒置显微镜下观察，当t175培养瓶中的细胞融合度达到80％时，进行冻存操作；
47.2)冻存保护剂配制
48.根据用量按用无血清培养基：dmso＝4:1配制冻存保护剂，混合均匀，标注名称、日期，放入4℃预冷；
49.3)胰蛋白酶消化
50.将培养瓶中细胞表面用生理盐水清洗两遍后，用胰蛋白酶进行消化，轻轻晃动并拍打培养瓶侧壁，使贴壁组织块和细胞与培养瓶底分离，随后终止消化；
51.4)细胞收集及清洗
52.将培养瓶中的混合液及培养瓶的生理盐水清洗液收集到新的离心管中进行离心收集；
53.5)检测取样
54.根据脐带间充质干细胞质量控制表取样送检；
55.6)细胞冻存
56.用移液管吸取适量4℃预冷的冻存保护剂缓慢滴加至含有等量细胞悬液50ml离心管中，重悬细胞，按6*107/5ml冻存管3
×
107/2ml冻存管转移至冻存管中，封口膜密封冻存
管口放于4℃预冷的程序降温盒中，及时传出放置于程序降温间-80℃冰箱中；
57.7)细胞储存
58.程序降温人员穿戴液氮防护装备，佩戴便携式氧含量测试仪，将在-80℃条件下完成程序降温的冻存管转移至thermo fisher scientific cryoextra 20高效液氮储存系统-196℃的气相中。
59.优选的，所述脐带间充质干细胞在冻存时需要在程序降温盒的盒盖上标明样本编号、代次、数量、日期及时间。
60.优选的，所述冻存的干细胞进行的检测包括微生物检验、支原体检验、细胞活率检验、细胞密度检验以及流式细胞仪的检测。
61.(三)有益效果
62.本发明提供了一种脐带间充质干细胞的培养及冻存方法。具备以下有益效果：
63.1、本发明提供的脐带间充质干细胞的培养及冻存方法，该方法在对干细胞进行培养时采用的培养基为lonza无血清培养基，并添加了一定量的血清替代物和谷氨酰胺，采用血清替代物替代胎牛血清可消除胎牛血清带来的血红蛋白、内毒素、疯牛病等潜在的不稳定因素，并且谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，培养液中缺少谷氨酰胺时，会导致细胞生长不良而死亡，且谷氨酰胺在溶液中很不稳定，因此，在培养基中添加适量的谷氨酰胺有利于细胞的生长。
64.2、本发明提供的脐带间充质干细胞的培养及冻存方法，该方法的各项操作均能够保证在无菌条件下进行，有效的防止细胞在培养的过程中造成影响，对制备的脐带间充质干细胞的细胞活率、密度、微生物检测结果进行分析，可知制备的脐带间充质干细胞符合各项规定。
65.3、本发明提供的脐带间充质干细胞的培养及冻存方法，该方法培养获得的干细胞具有间充质干细胞的免疫学表型，即不表达cd34、cd45、cd14、cd19和hla-dr，而cd73、cd90、cd105呈阳性，且它们的表达率均能够达到95％以上，纯度较高，便于后期进行使用。
具体实施方式
66.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
67.实施例：
68.本发明实施例提供一种脐带间充质干细胞的培养及冻存方法，包括以下步骤：
69.s1.实验前准备
70.在实验前，提前打开洁净区的紫外灯照射30min以上，并且打开实验室风机，接收人员做好接收脐带的准备工作，将接收的脐带储存瓶传至间充质干细胞制备室，对其信息进行核对，检查储存瓶是否在存在漏液现象，密封标签是否完好、准确，有无肉眼可见的微生物污染，脐带资料是否完整并符合制备要求。
71.s2.脐带消毒
72.将脐带储藏瓶的外表面用75％酒精擦拭消毒后，放入正常运行的生物安全柜中，
将符合洁净要求的实验所需的物料用75％的酒精消毒后放入生物安全柜，打开脐带储存瓶，向脐带储存瓶内倒入75％的酒精100ml，浸泡2分钟进行消毒。
73.s3.脐带清洗
74.将脐带夹出用适量的生理盐水清洗脐带表面的酒精，将其转入新的装有生理盐水的培养皿中，清洗脐带表面及血管内部的血渍，将在新的培养皿中的脐带剪成适合长度的小段，用生理盐水清洗几遍，直至清洗液无色。
75.s4.脐带华通氏胶分离
76.用无菌手术镊取脐带小段放入100mm培养皿中，剥离出华通氏胶放入装有生理盐水的100mm培养皿中，用生理盐水清洗华通氏胶并转移至50ml离心管中，确保清洗液无色，将清洗干净的华通氏胶转入新的50ml离心管中，最后一次的清洗液留待无菌检验。
77.s5.脐带间充质干细胞的制备
78.用弯头手术剪将离心管中的华通氏胶剪碎成1-3mm3大小的组织块，然后将其接种至t75的培养瓶中，加入提前配置好的培养基，轻轻晃动，尽量使组织均匀平铺在瓶底，标注编码、日期及代次，操作结束后放入37℃，5％co2培养箱中培养。
79.s6.脐带间充质干细胞的培养
80.根据脐带间充质干细胞状态进行3次换液，每次换液结束后将装有间充质干细胞的t75培养瓶重新放入37℃，5％co2培养箱中培养。
81.s7.脐带间充质干细胞的传代
82.p0传代p1代，置于倒置显微镜下观察，t75培养瓶中70％的组织块周围长满80％的细胞时，进行传代操作；
83.p1代传p2代，置于倒置显微镜下观察，t175培养瓶中细胞融合度达到80％，进行传代操作；
84.p2代传p3代，置于倒置显微镜下观察，t175培养瓶中细胞融合度达到80％，进行传代操作。
85.s8.脐带间充质干细胞冻存
86.将p3代的干细胞进行冻存操作，然后将冻存的干细胞进行系列检测，在各项检测合格后，完成干细胞的冻存。
87.步骤s4中的脐带华通氏胶分离具体操作为：用无菌手术镊取脐带小段放入100mm培养皿中，剥离出华通氏胶放入装有生理盐水的100mm培养皿中，用生理盐水清洗华通氏胶并转移至50ml离心管中。
88.步骤s5中脐带间充质干细胞的具体制备过程为：
89.1)在lonza的无血清培养基中加入一定量的血清替代物和谷氨酰胺，配置后的培养基中血清替代物和谷氨酰胺的终浓度分别为2％和2mmol/l；
90.2)用弯头无菌手术剪将华通氏胶剪成约1～3mm3大小的组织块，将华通氏胶组织块转移至含有培养基的t75培养瓶中，在t75培养瓶上标注编码、日期及代次，最后将培养瓶放入37℃，5％co2培养箱中培养。
91.步骤s7中脐带间充质干细胞的传代过程具体为：
92.1)传代前确认
93.p0传代p1，置于倒置显微镜下观察，t75培养瓶中70％的组织块周围长满80％的细
胞时，进行传代操作，p1代后传代，置于倒置显微镜下观察，t175培养瓶中细胞融合度达到80％，进行传代操作；
94.2)脐带间充质干细胞传代操作
95.将培养瓶中细胞表面用生理盐水清洗后，用胰蛋白酶进行消化，轻轻晃动并拍打培养瓶侧壁，使贴壁组织块和细胞与培养瓶底分离，随后终止消化；
96.3)细胞收集
97.将培养瓶中的混合液收集到50ml离心管中，再向培养瓶中加入适量生理盐水，轻轻晃动后用上述50ml离心管收集清洗液；
98.4)细胞清洗
99.p0组织块过滤：将离心后的50ml离心管中的上清液缓慢废弃，加入适量生理盐水轻轻吹悬沉淀，过输血器，用新的50ml离心管离心收集细胞悬液；
100.p1代以后：将离心后50ml离心管中的上清液缓慢废弃，分别向离心管中加入适量生理盐水轻轻吹悬沉淀；
101.5)脐带间充质干细胞接种
102.按细胞密度2
×
106/t175接种脐带间充质干细胞，标注编码日期及代次，将培养基轻轻摇晃均匀，使细胞悬液平铺瓶底，放入37℃，5％co2培养箱中培养。
103.步骤s8中脐带间充质干细胞冻存过程为：
104.1)冻存前样本确认
105.将冻存的脐带间充质干细胞置于倒置显微镜下观察，当t175培养瓶中的细胞融合度达到80％时，进行冻存操作；
106.2)冻存保护剂配制
107.根据用量按用无血清培养基：dmso＝4:1配制冻存保护剂，混合均匀，标注名称、日期，放入4℃预冷；
108.3)胰蛋白酶消化
109.将培养瓶中细胞表面用生理盐水清洗两遍后，用胰蛋白酶进行消化，轻轻晃动并拍打培养瓶侧壁，使贴壁组织块和细胞与培养瓶底分离，随后终止消化；
110.4)细胞收集及清洗
111.将培养瓶中的混合液及培养瓶的生理盐水清洗液收集到新的离心管中进行离心收集；
112.5)检测取样
113.根据脐带间充质干细胞质量控制表取样送检；
114.6)细胞冻存
115.用移液管吸取适量4℃预冷的冻存保护剂缓慢滴加至含有等量细胞悬液50ml离心管中，重悬细胞，按6*107/5ml冻存管3
×
107/2ml冻存管转移至冻存管中，封口膜密封冻存管口放于4℃预冷的程序降温盒中，及时传出放置于程序降温间-80℃冰箱中；
116.7)细胞储存
117.程序降温人员穿戴液氮防护装备，佩戴便携式氧含量测试仪，将在-80℃条件下完成程序降温的冻存管转移至thermo fisher scientific cryoextra 20高效液氮储存系统-196℃的气相中。
118.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。