一种用于制备ONECUT3抗体的多肽及其兔多克隆抗体、应用

一种用于制备onecut3抗体的多肽及其兔多克隆抗体、应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于制备onecut3抗体的多肽及其兔多克隆抗体、应用。


背景技术：

2.onecut3及onecut1(hnf6)、onecut2属于原始的同源盒(homeobox)转录因子超家族中的onecut家族。它们共同的结构含有n端cut结构域和c端的homeobox结构域。这3种转录因子在胚胎发育、组织形成和分化等生理过程中起重要作用。onecut1在胚胎发育中通过tgf-beta信号通路动态调控与细胞黏附和迁移有关的基因表达，其异常表达在一些恶性肿瘤的进展和转移中起重要作用，如在肝癌和胰腺癌细胞中，onecut1可结合afp、cyclind1、cdc25a、cdk2和e2f1等基因启动子区参与细胞增殖和细胞周期的调控，诱导s期细胞增多，激活tgf-beta信号通路。异常高表达onecut1还可促进大肠癌细胞的增殖和转移。在转移性去势抵抗性前列腺癌(mcrpc)中，onecut2通过雄激素依赖途径促进肿瘤细胞的增殖及存活。以上研究表明，onecut家族中的onecut1和onecut2异常表达参与了肿瘤的发病机制。onecut3是否参与了血液肿瘤的发生发展机制目前尚无报道。
3.目前在售onecut3存在效价比低、特异性差的问题，难以满足于细胞水平和组织水平onecut3蛋白检测的科研需求。如在实际应用中，如novus(nbp1-91528)的抗体仅对外源过表达onecut3有检出能力，而无法检测出细胞内源性表达的onecut3蛋白；abcam(ab181450)抗体由于诱导onecut3蛋白多克隆抗体的抗原多肽序列设计原因，特异性不佳，检测时存在多杂带的问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于制备onecut3抗体的多肽及其兔多克隆抗体、应用的技术方案。
5.本发明具体通过以下技术方案实现：
6.所述的一种用于制备onecut3抗体的多肽，该多肽的核苷酸序列为cmnrwaeepstapg，如seq id no.1所示。
7.所述的多肽在制备抗onecut3抗原蛋白的兔多克隆抗体中的应用。
8.利用所述的多肽制备抗onecut3抗原蛋白的兔多克隆抗体的方法，包括以下步骤：
9.1)将onecut3的抗原多肽分别与载体蛋白klh、bsa偶联，纯化后得到偶联产物；
10.2)取偶联产物免疫兔子，取多次免疫后的兔血清，用elisa法对效价进行检测，效价达理想值后加强免疫一次，收集免疫兔血清；
11.3)利用抗原亲和纯化以得到多克隆抗体。
12.上述制备得到的抗onecut3抗原蛋白的兔多克隆抗体在检测内源性和外源性onecut3中的应用。
13.利用本发明所得的抗onecut3抗原多肽的兔多克隆纯化抗体，具有对onecut3的特
异性识别功能，几乎无杂带，且可靠反映细胞水平和组织水平onecut3蛋白的表达水平，同时具备检测内源性和外源性表达outcut3蛋白的能力，检测能力优于在售的商品化抗体所得效果。
附图说明
14.图1为human onecut3的氨基酸序列；
15.图2为onecut蛋白结构分析图；
16.图3为实施例2中的抗体肽段封闭实验(western-blot图)；
17.图4为实施例3中的敲减验证抗体特异性实验(western-blot图)；
18.图5为实施例4中的骨髓增生异常综合征病人的骨髓原代样本内源性onecut3表达检测(western-blot图)；
19.图6为实施例5中的骨髓组织onecut3表达的免疫组化检测结果图。
具体实施方式
20.以下结合实施例来进一步说明本发明。
21.实施例1：onecut3多肽的设计及合成
22.1.onecut3抗体的抗原蛋白序列的设计
23.human onecut3的氨基酸序列(uniprotkb-o60422)如图1所示。
24.onecut3蛋白结构分析如图2所示。
25.根据以上对onecut3蛋白中每个氨基酸的表面可接触性、亲水性和弹性等可以推算出onecut3蛋白抗原决定簇区域，故设计的肽段序列为cmnrwaeepstapg(human onecut3 469-482aa)。
26.2.人工合成多肽
27.人工合成多肽采用多肽固相合成法，具体步骤如下：
28.(1)树脂的称取：选取wang树脂，如：要做0.2mmol选用树脂魏0.5mmol/g，即称取树脂的量为0.2mmol除以0.5mmol/g＝0.4g溶胀。把称取好的树脂放入反应柱里面，然后用dcm溶胀半个小时。dcm加的量为树脂高度的2～3倍，也就是把树脂充分溶胀完全。可以微量鼓气。
29.(2)去保护。(cl-树脂第一步不要去保护，不过以后偶联上氨基酸后就要去保护)其余两种树脂都要去保护(fmoc)，先把dcm抽干，然后用dmf洗涤3遍，去除dcm，然后用20％六氢吡啶去保护，5+10即共两遍，第一遍5分钟，第二遍10分钟，中间用dmf洗涤一遍。
30.(3)去保护后洗涤。用dmf洗涤6遍。
31.(4)偶联。我们现在按照3倍量投氨基酸，即0,2mmol的树脂，我们投氨基酸的量为0.2mmol*3＝0.6mmol乘以其分子量就是要称取的质量。此外加入称取激活剂dic和diea等。
32.(5)偶联时检测。用滴管取树脂(少许，约15粒左右，只要检测可以辨认即可)与小试管中，分别滴加2滴a液(5g茚三酮溶解至100ml乙醇中)、2滴b液(80g苯酚溶解至20ml乙醇中)、2滴c液(2ml 0.001m kcn加入至98ml重蒸吡啶中)，放到加热3分钟。然后取出来看树脂是否透明，如溶液颜色深影响观察，可以倒掉溶液，加少许dmf洗净，再观察。若树脂检测透明，即可以偶联下一个氨基酸。若树脂不透明，延长反应时间，若还不透明，可以进行复投。
一定要保证每一步都反应完全再偶联下一个氨基酸。
33.(6)偶联后洗涤。偶联完毕后，dmf洗涤3遍。
34.(7)以上是偶联一个氨基酸的步骤，重复第3-6步，直到最后一个氨基酸偶联完毕。
35.(8)最后一个氨基酸偶联好后，再去保护，去保护完后收缩，dmf洗涤3遍，dcm3遍，甲醇3遍，抽干肽树脂。
36.(9)称取完成的干肽树脂，装入50ml的离心管中，加入裂解液(每克10倍ml)如：1g肽树脂加10ml的裂解液。加入裂解液d液(tfa：tis:water＝95：2.5：2.5)，反应2个小时，每10-15分钟摇荡一下，让其充分反应，可放入摇床中(25℃)。反应好后，抽滤，溶液倒入冰乙醚中沉淀，然后离心，离心3-4遍。
37.(10)把离心好后的肽先放通风橱中吹一会，然后放入真空干燥器中抽干。
38.(11)取少量到样品管中，填检测单送质检部门打质谱，判断质谱是否正确，若正确，把剩余的肽填单送纯化。
39.3.多肽偶联
40.1)将20mg klh溶于2ml,5mm的edta水溶液中。
41.2)称取8mg sulfo-smcc完全溶于50μl dmso中，之后加入150μl 1
×
pbs,混合均匀。
42.3)将sulfo-smcc溶液逐滴加入到klh中，边加边轻轻摇晃(剧烈摇晃会产生沉淀)，室温放置1h。
43.4)将上述活化好的klh溶液放入透析袋中，透析夹夹好，于2l的1
×
pbs中，4℃冰箱磁力搅拌下透析1h。
44.5)更换新的1
×
pbs透析2h，重复一次。将活化透析好的klh置于15ml进口离心管中，并在管上标记上试剂名称、时间和浓度，4℃冰箱保存。
45.6)称取4mg多肽(肽段序列为cmnrwaeepstapg)，溶于50μl的dmso中，再加入200μl的1
×
pbs，快速混匀，随后按照多肽：klh＝1mg：680μg的比例立即加入klh，4℃冰箱过夜或者室温下反应2h。
46.7)将上述交联好的klh-peptide交联复合物放入透析袋中，透析夹夹好，于4l的1
×
pbs中，4℃冰箱磁力搅拌下透析过夜。
47.8)将透析好的klh-peptide取出到干净的1.5ml离心管中，按照免疫剂量进行分装，-20℃冰箱保存。
48.4.免疫兔，获得抗血清
49.1)动物选择：兔子采用新西兰白兔，体重2.5kg左右青壮年。动物选择毛色要光泽，活动自如的健康动物。挑选好动物，先预养2周左右。目的是淘汰有些不合格的动物，使后期的实验能顺利进行。
50.2)实验前准备：兔子做好标记。
51.3)抗原准备：
52.3.1)将抗原(3中的偶联产物)从-20℃冰箱中拿出，常温溶解，避免反复冻融。
53.3.2)抽取抗原(抗原完全混匀)，首免抗原浓度为1mg/ml，兔子为0.5ml/只，二免-四免抗原浓度减半，剂量不变。
54.3.3)抽取佐剂，佐剂和抗原为1:1体积比抽取。首免采用完全佐剂，二-四免采用不
完全佐剂。抽取时，佐剂要充分混合均匀后再抽入注射器。
55.3.4)二个注射器用针筒连接管对接后进行完全乳化，乳化标准为：乳化好的免疫原滴入37度水中不分散为合格。
56.4)免疫：兔子采用多点皮下注射，每点为0.2ml。
57.免疫时间：首免后第14天进行二免，二免到三免间隔时间为7天。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。
58.5.elisa检测(间接法)
59.1)包板：用包被缓冲液(coating buffer:na2co3和nahco3缓冲液)将已知抗原稀释至1μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1xtbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次。
60.2)封闭：每孔加60μl的1％bsa(tbst配制)进行封闭，置37℃孵育1小时。之后弃封闭液。
61.3)加样：加一定稀释的待检样品(把待检样品按照一定的比例进行稀释)，50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(阳性血清)与阴性对照孔(bsa)。置37℃孵育1小时，之后弃封闭液，用1xtbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次。
62.4)加酶标抗体：将新鲜稀释的二抗-hrp(1:5k，用1％bsa进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃封闭液，用1xtbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次。
63.5)加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的tmb底物溶液100μl，置37℃反应5min。
64.6)终止反应：于各反应孔中加入2m硫酸90μl。
65.7)读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据，进行分析。
66.6.利用抗原多肽纯化抗血清，得到纯化抗体
67.1)将亲和层析柱依次用20ml纯水和1
×
pbs(ph7.4)，流速70ml/h充分清洗。
68.2)取待纯化的血清10ml于50ml离心管中，用孔径0.45μm，直径25mm微孔滤膜抽滤。
69.3)将抽滤过的血清样品以40ml/h流速上样，重复一次。
70.4)用20ml 1
×
pbs(ph7.4)以70ml/h的流速清洗柱子，10min后连接蛋白检测仪，清洗过程中调节仪器透光率(t档)示数为100。
71.5)调节蛋白检测仪吸光率(1a档)示数为0，此时打开电脑桌面的hd-a电脑采集器，并将满屏量程调到5，用甘氨酸溶液(ph 2.7，0.2m)以40ml/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体。
72.6)在抗体收集过程中以1m的碳酸氢钠及时调节抗体的ph值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值。
73.7)抗体收集完后，调节ph值至7左右，并记录洗脱的抗体体积，之后用纯净水冲洗连接收集器的橡胶管。
74.8)依次用20ml 1
×
pbs和纯水以70ml/h的速度清洗亲和层析柱，之后加入20％乙醇，封口，4℃冰箱保存。
75.9)纯化后的抗体根据不同要求送检：elisa，wb，icc等。
76.结果
77.1.多肽信息
78.多肽编号序列信息hapm1067-1469-482a.a.cmnrwaeepstapg
79.2.免疫周期表
[0080][0081]
3.血清elisa的检测结果
[0082][0083][0084]
结论：5206免疫血清合格(基于elisa判断)。
[0085]
定义:1:256000的od450值为p值(阳性值)，bsa孔的od450值为n值(阴性值)；
[0086]
5206p/n＝(0.494+0.367)/2
÷
(0.167+0.098)/2＝3.2＞2.1达到阳性合格标准。
[0087]
基础elisa合格。
[0088]
5207p/n＝(0.420+0.428)/2
÷
(0.107+0.098)/2＝4.1＞2.1达到阳性合格标准。
[0089]
基础elisa合格。
[0090]
实施例2：抗体肽段封闭实验
[0091]
(1)取1mg肽段(hapm1067-1)溶于无酶灭菌水，终浓度为1mg/ml；
[0092]
(2)取2管15ml离心管，其中一管配置抗体和肽段预混液，rabbit anti-onecut3抗体(#5206，conc.0.5mg/ml)与肽段加入于5％脱脂牛奶中，抗体与肽段摩尔比为1：2，为封闭的抗体；另一管仅加入rabbit anti-onecut3抗体(#5206，conc.0.5mg/ml)于5％脱脂牛奶中，即抗体与肽段摩尔比为1：0，为抗体对照；4℃预混过夜；
[0093]
(3)收集病人骨髓单个核细胞，按照1x 10e6细胞加50μl sds蛋白变性裂解液，吹打混匀，置于冰上裂解10min，bioruptor超声(功率high，超声10s停10s，4-6个循环)；
[0094]
(4)等量样品于10％sds-page凝胶电泳；
[0095]
(5)待溴酚蓝电泳至底部时停止并进行pdvf膜转膜；
[0096]
(6)5％脱脂牛奶室温封闭1h；
[0097]
(7)剪膜后分别置于对照抗体和封闭的抗体，4℃冰箱孵育过夜，1
×
tbst洗膜3次(每次10min)；
[0098]
(8)goat anti-rabbit二抗室温孵育1h，1
×
tbst洗膜3次(每次10min)；
[0099]
(9)洗膜后加入化学显影液(pierce
tm
supersignal
tm
west pico plus chemiluminescent，thermo)，置于于化学发光显影仪(chemidoc mp成像系统，bio-rad)中显影。
[0100]
(10)用洗脱液(restore plus western blot stripping buffer，thermo)洗脱15min以后，5％牛奶室温封闭1h；
[0101]
(11)孵育anti-actin hrp(huabio,et1702-67)室温1h，1
×
tbst洗膜3次(每次10min)；再次加入化学显影液(pierce
tm
supersignal
tm
west pico plus chemiluminescent，thermo)，置于于化学发光显影仪(chemidoc mp成像系统,bio-rad)中显影。
[0102]
结果：抗体对照组(即抗体比肽段＝1：0)可见onecut3内源性条带(约54kda)；抗体封闭组(即抗体比肽段＝1：2)，泳道无信号，提示该onecut3抗体可被该肽段封闭(见图3)。
[0103]
实施例3：敲减验证抗体特异性实验
[0104]
(1)构建tet-plko-hoc3质粒：tet-plko-puro载体(从美国addgene公司购入)经ecor i和age i双酶切；合成以下碱基序列并插入双酶切空载：
[0105]
shoc3 forward:ccggcagcatcccgcaggcaatcctcgaggattgcctgcgggatgctgtttt(如seq id no.2所示)；
[0106]
shoc3 reverse:aattaaaacagcatcccgcaggcaatcctcgaggattgcctgcgggatgctg(如seq id no.3所示)；转化后挑取单克隆测序；提取测序正确的质粒；
[0107]
(2)以10cm培养皿为例，当hela细胞长至70％密度时进行转染，取500μl无血清opti-mem培养基两支，分别加入脂质体转染试剂polyjet(signagen)40μl和质粒9μg，将质粒加入转染试剂中充分混匀，室温静置10-15min后滴入细胞培养皿中，对照组不加doxycycline，敲降组加入1μg/mldoxycycline；
[0108]
(3)72h后收集对照和敲降细胞，按照1x 10e6细胞加50μl sds蛋白变性裂解液，吹打混匀，置于冰上裂解10min，bioruptor超声(功率high，超声10s停10s，4-6个循环)；
[0109]
(4)等量样品于10％sds-page凝胶电泳；
[0110]
(5)待溴酚蓝电泳至底部时停止并进行pdvf膜转膜；
[0111]
(6)5％脱脂牛奶室温封闭1h；
[0112]
(7)rabbit anti-onecut3抗体(#5206，conc.1mg/ml)一抗置于4℃冰箱孵育过夜，1
×
tbst洗膜3次(每次10min)；
[0113]
(8)goat anti-rabbit二抗室温孵育1h，1
×
tbst洗膜3次(每次10min)；
[0114]
(9)洗膜后加入化学显影液(pierce
tm
supersignal
tm
west pico plus chemiluminescent，thermo)，置于于化学发光显影仪(chemidoc mp成像系统,bio-rad)中显影。
[0115]
(10)用洗脱液(restore plus western blot stripping buffer，thermo)洗脱15min以后，5％牛奶室温封闭1h；
[0116]
(11)孵育anti-actin hrp(huabio,et1702-67)室温1h，1
×
tbst洗膜3次(每次10min)，再次加入化学显影液，置于于化学发光显影仪(chemidoc mp成像系统,bio-rad)中显影。
[0117]
结果：对照组(即-dox组)可见onecut3内源性条带(约54kda)；敲低组(即+dox组)泳道无信号，提示该抗体特异性识别人源onecut3蛋白(见图4)。实施例4：骨髓增生异常综合征病人的骨髓原代样本内源性onecut3表达检测(wb)
[0118]
(1)构建pcdna3.1-hoc3质粒：将humanonecut3 cds序列合成于pcdna3.1-空载内(由丰晖生物完成)，质粒测序鉴定；
[0119]
(2)以10cm培养皿为例，当293t细胞长至70％密度时进行转染，取500μl无血清opti-mem培养基两支，分别加入脂质体转染试剂polyjet(signagen)40μl和质粒9μg，将质粒加入转染试剂中充分混匀，室温静置10-15min后滴入细胞培养皿中；
[0120]
(3)72h后收集对照和敲降细胞，按照1x 10e6细胞加100μl sds蛋白变性裂解液，吹打混匀，置于冰上裂解10min，bioruptor超声(功率high，超声10s停10s，4-6个循环)；作为阳性对照；
[0121]
(4)各取2份伴有复杂核型的骨髓增生异常综合征病人骨髓样本(p1和p2)、正常核型的骨髓增生异常综合征病人骨髓样本(p3和p4)，每个骨髓、健康供者骨髓样本(d1和d2)，每份骨髓样本取5ml于15ml离心管；
[0122]
(5)用ficoll人淋巴细胞分离液进行相对密度梯度离心收集单个核细胞，行细胞计数，按照1x 10e6细胞加50μl sds蛋白变性裂解液，吹打混匀，置于冰上裂解10min，bioruptor超声(功率high，超声10s停10s，4-6个循环)；作为检测样品；
[0123]
(6)3μl的阳参样品(1x loading补齐体积)和15μl的待测样品于10％sds-page凝胶电泳；
[0124]
(7)待溴酚蓝电泳至底部时停止并进行pdvf膜转膜；
[0125]
(8)5％脱脂牛奶室温封闭1h；
[0126]
(9)rabbit anti-onecut3抗体(#5206，conc.1mg/ml)一抗置于4℃冰箱孵育过夜，1
×
tbst洗膜3次(每次10min)；
[0127]
(10)goat anti-rabbit二抗室温孵育1h，1
×
tbst洗膜3次(每次10min)；
[0128]
(11)洗膜后加入化学显影液(pierce
tm
supersignal
tm
west pico plus chemiluminescent，thermo)，置于于化学发光显影仪(chemidoc mp成像系统,bio-rad)中显影。
[0129]
(12)用洗脱液(restore plus western blot stripping buffer，thermo)洗脱15min以后，5％牛奶室温封闭1h；
[0130]
(13)孵育anti-actin hrp(huabio,et1702-67)室温1h，1
×
tbst洗膜3次(每次10min)，再次加入化学显影液，置于于化学发光显影仪(chemidoc mp成像系统，bio-rad)中显影。
[0131]
结果：使用onecut3抗体作为一抗，可检测内源性和外源性的onecut3蛋白表达，同时骨髓增生异常综合征患者伴随复杂核型组骨髓细胞onecut3表达相对正常核型组升高，健康供者组骨髓细胞onecut3表达低(见图5)。
[0132]
实施例5：骨髓组织onecut3表达的免疫组化检测
[0133]
(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ8min-二甲苯ⅱ8min-二甲苯ⅲ8min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min，自来水洗2min。
[0134]
(2)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(ph 6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸腾停火8min再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0135]
(3)画圈：用组化专用的组化笔沿着组织外围轮廓画一个与组织间隔3-4毫米的小圈，然后加入足量的pbs保证后续依次加入的封闭血清，一抗，二抗，以及显色剂能完全覆盖组织，而不沿着玻片流走。
[0136]
(4)阻断内源性过氧化物酶：切片加上试剂盒内的内源性过氧化物酶，每张切片50-100ul室温避光孵育25min，将玻片置pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0137]
(5)血清封闭：在组化圈内滴加3％bsa均匀覆盖组织，室温封闭30min。
[0138]
(6)加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加pbs按一定比例配好的rabbit anti-onecut3抗体(1：100)，切片平放于湿盒内4
°
孵育过夜。
[0139]
(7)加二抗：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与超敏兔鼠通用二抗(hrp标记)覆盖组织，室温孵育50min。
[0140]
(8)复染细胞核：苏木素染色2-3min左右，自来水洗，1％的盐酸酒精分化液分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝液返蓝15-30s，流水冲洗。
[0141]
(9)脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min
‑‑
无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
[0142]
(10)显微镜镜检，图像采集分析。
[0143]
结果：使用onecut3抗体作为一抗，可检测骨髓组织中内源性onecut3蛋白的表达，主要位于核内表达；左侧为10x镜下，右图为40x镜下观察所示。(见图6)。
[0144]
综上所述，利用本发明所得抗onecut3抗原多肽的兔多克隆纯化抗体，具有对onecut3的特异性识别功能，几乎无杂带，且可靠反映细胞水平和组织水平onecut3蛋白的表达水平，同时具备检测内源性和外源性表达outcut3蛋白的能力。