一种检测图拉病毒的RAA引物探针及检测方法与流程

一种检测图拉病毒的raa引物探针及检测方法
技术领域
1.本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测图拉病毒的raa引物探针及检测方法。


背景技术：

2.图拉病毒（tula virus，tulv）是汉坦病毒科汉坦病毒属的一个成员，从田鼠（micotus arvalis）中分离出该病毒。tulv病毒是欧亚大陆不同地区广泛分布的一种病毒，普通田鼠是其宿主，但也在其他田鼠中发现该病毒。tulv病毒致病性的临床表现非常罕见。2003年，通过血清学和分子流行病学方法诊断出一例与tulv病毒相关的汉坦病毒病。到目前为止，仅在2例中发现与tulv病毒感染的直接分子证据，1例为患有严重汉坦病毒病的免疫功能低下患者，另一例为患有轻度汉坦病毒病的免疫功能正常者。tulv病毒即使在健康的人身上也能引起汉坦病毒病，这表明了这种病毒的致病潜力。因此，携带tulv病毒的田鼠应被视为潜在感染源，应该被认为是对人类健康的威胁。目前，实验室对于tulv的诊断主要有分子生物学检测和血清学检测。一般可以通过荧光抗体检测试验、电子显微镜观察和分子检测进行病毒鉴定。也可用病毒中和试验或间接elisa检测急性和康复阶段血清中的抗体。常规病毒检测方法中病毒分离与鉴定、血清中和抗体试验难以广泛使用，不适合大规模流行病学调查或现场快速诊断。而酶联免疫吸附检测(elisa)特异性较差，存在交叉反应，易出现假阳性。荧光定量pcr方法虽然特异性和敏感性均较高，重复性好，但仍然具有仪器昂贵、巨大、对实验场地、人员要求高的问题，难以适用于现场大规模筛查，检测时间偏长，需要1～2小时。所有上述方法都不适合在口岸现场使用，而且这些方法需要操作熟练的人员和设备齐全的实验室；因此，基于现有检测技术存在时间长、操作不方便及假阳性高等缺点，提供一种准确、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测tulv的荧光rt-raa法，是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明提供了一种荧光rt-raa法检测junv的引物、探针及检测方法，可实现在39
°
c条件下20min内完成junv的检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测的特点。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明首先提供一种检测junv的荧光rt-raa法扩增用引物和探针；具体的，所述的引物包含有：上游引物：5
’‑
agggtcagtggctggtccttcaatgtcgag-3’；下游引物：5
’‑
gggacaacacaagtattgatctgacaagga-3’；本发明还提供用于检测上述引物扩增产物的探针，所述探针的序列如下：5
’‑
tcgagtttccccactgcctctctgatgacagcttcttgtatctctgtcaag-3’；
所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5
′
端碱基数35bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3
′
端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基c，其中c用thf替换；修饰后的探针为：5
’‑
tcgagtttccccactgcctctctgatgacagct/i6famdt/thf/ibhq1dt/tgtatctctgtcaag-3’。进一步，所述荧光报告基团为fam、hex、tet、joe或vic；所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或bhq3。优选地，所述荧光报告基团为fam；所述荧光淬灭基团为bhq1。上述的引物和探针用于制备荧光rt-raa检测试剂盒。进一步，本发明还提供一种荧光rt-raa法检测junv的方法，具体步骤如下：1) 提取待检测样本的核酸；2) 将恒温荧光基因检测仪接通电源进行预热，对反应参数进行设置；反应参数设置为39
°
c，反应时间：20min；3) 在25μl反应缓冲液中加入12.7μl水，浓度为10μm的2.1μl上述的上下游引物和0.6μl探针，充分混合后添加到rt-raa荧光基础反应试剂中混合，得到反应预混液；4) 在反应管盖上加2.5μl的mg2+，将5μl所述步骤1)中得到的核酸与所述步骤3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪检测荧光信号；5) 根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mv判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mv的判定为阴性。进一步，所述上游引物和下游引物的使用浓度为1～50μm。优选地，所述上游引物和下游引物的使用浓度为10μm。进一步，所述探针的浓度为1～50μm。优选地，所述探针的浓度为10μm。本发明相比于现有技术具有如下的优点：1)本发明提供的引物和探针适用于荧光rt-raa法检测，并且能够准确地检测出junv，与macv质粒、lasv质粒、puuv质粒、汉坦病毒无交叉反应，特异性达100％；2)本发明提供的检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于荧光rt-raa法快速检测junv的方法，灵敏度高，反应检测灵敏度在95％的概率下达到37copies/反应；3)本发明提供的一种荧光rt-raa法快速检测junv的方法，能方便快速准确地鉴定junv，操作简便，检测时间短，20min内完成检测；无需像pcr一样，通过高温变性使dna解旋后退火，最后再延伸，只需在39
°
c下进行等温扩增即可完成检测；也无需像lamp技术一样使用4～6条引物进行扩增且容易产生假阳性。
具体实施方式
4.在genebank中下载tulv病毒的全基因组序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用cluatal w软件进行同源性分析和blast序列分析，筛出tulv高度保守序列如下：以筛选获得的高度保守序列作为检测目的基因片段，并进行引物、探针设计筛选
检测。根据以上保守序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成dna质粒。1)引物探针设计设计raa方法检测用的引物，上游引物和下游引物长度30～35bp；根据tulv保守序列，引物设计包括上游引物和下游引物，上游引物、下游引物和探针各设计序列如下表1：将上述引物组合成5个引物组合，引物探针组合见表2。在5个引物探针组合中，组合6、7、9、10在同一junv质粒浓度下，出峰时间和荧光值相对较高，更优选为组合2，具体为：junv-raa-fp1：5
’‑
agggtcagtggctggtccttcaatgtcgag-3’；junv-raa-rp2：5
’‑
gggacaacacaagtattgatctgacaagga-3’；(2)探针设计1)采用raa技术探针设计原则设计探针，根据junv保守序列，设计的探针序列为：5
’‑
tcgagtttccccactgcctctctgatgacagcttcttgtatctctgtcaag-3’；2)选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团根据实验仪器采用的是无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的raa-f1620荧光基因检测仪，所检测的荧光为fam荧光，因此荧光修饰基团选为fam，荧光淬灭基团选为bhq1；也可以根据仪器检测荧光的性能，将荧光修饰基团选择为hex、tet、joe或vic；荧光淬灭基团选择bhq2或bhq3；但优选荧光修饰基团为fam，优选荧光淬灭基团为bhq1。3)所述探针的修饰方法包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数35bp的
位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基c，碱基c用thf替换；5
’‑
tcgagtttccccactgcctctctgatgacagct/i6famdt/thf/ibhq1dt/tgtatctctgtcaag-3’。（3）引物、探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。（4）基于raa荧光法快速检测亨德拉病毒的检测试剂，包括raa荧光基础反应试剂、反应缓冲液、纯化水、乙酸镁、阳性质控品、阴性质控品、引物和探针；raa荧光基础反应试剂为经过低温冷冻干燥的冻干粉，购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为raa-f1620，反应规格为50μl，使用前用反应缓冲液进行重溶，反应缓冲液为raa荧光基础反应试剂配套试剂。合成的junv质粒用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度稀释制备2.1
×
100copies/μl～2.1
×
108copies/μl标准品备用。阴性质控品为ddh2o或纯化水。上游引物和下游引物的浓度为10μm；探针的浓度为10μm。实施例2raa荧光法检测junv病毒的方法，包括如下步骤：(1)将待检样本组织均浆，按组织提取rna方法提取核酸，-20
°
c保存备用；如样本为全血、血清、血浆采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；(2)将恒温荧光基因检测仪raa-f1620接通电源进行预热，对反应参数进行设置，反应参数设置为39
°
c，反应时间：20min；(3)在25μl反应缓冲液中加入12.7μl的水，浓度为10μm的2.1μl上下游引物和0.6μl探针，充分混合后添加到raa荧光基础反应试剂中混合，得到反应预混液；(4)在反应管盖上加2.5μl的mg
2+
，将5μl所述步骤(1)中得到的核酸提取液与所述步骤(3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪raa-f1620检测荧光信号；(5)根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mv判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mv的判定为阴性。相对荧光值＝测定荧光值-起始扩增荧光值(实际值标准化为500mv)下面对本发明引物对探针的灵敏度、重复性和特异性进行检测。1、灵敏度实验(1)引物上游引物：5
’‑
agggtcagtggctggtccttcaatgtcgag-3’；下游引物：5
’‑
gggacaacacaagtattgatctgacaagga-3’；(2)探针探针序列为：5
’‑
tcgagtttccccactgcctctctgatgacagcttcttgtatctctgtcaag-3’；采用荧光报告基团(fam)和荧光淬灭基团(bhq1)修饰探针；修饰的探针为：5
’‑
tcgagtttccccactgcctctctgatgacagct/i6famdt/thf/ibhq1dt/tgtatctctgtcaag-3’。(3)制备质粒工作标准品，分别为：
工作标准品1-8，含有2.1
×
10
8-2.1copies/μl junv病毒质粒非传染性dna片段。(4)灵敏度实施方法：步骤1、配制反应液(按10个反应进行配制)：从反应缓冲液中吸取250μl加入预先准备好的1 .5mlep管，分别加入167μl水，12.6μl引物，3.6μl探针(引物的浓度为10μm，探针的浓度为10μm)，充分混匀，得混匀后的反应液。步骤2、raa荧光基础反应试剂重溶准备6个raa荧光基础反应试剂，每次吸取46.5μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的6个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为raa反应体系，并做好标记。步骤3、加样反应在以上6个配制好的raa荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μlmg2+后，分别向管中加入1μl阴性质控品、标准工作品1-8各1μl，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μl。步骤4、检测及结果将混匀的10个反应管放入恒温荧光基因检测仪raa-f1620中，设定反应温度为39
°
c，反应时间20min。根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mv判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mv的判定为阴性。相对荧光值＝测定荧光值-起始扩增荧光值(实际值标准化为500mv)检测结果为单次的raa灵敏度实验结果；为了确认该方法的检出限，把上述灵敏度实验共重复8次，同时进行qpcr灵敏度实验比对，结合8次raa灵敏度实验和3次qpcr灵敏度实验结果进行概率回归分析，通过概率分析确定raa荧光法的分析灵敏度，结果显示，在20min内，95％概率的检出限为37copies/反应，实现快速灵敏的检出结果。2、重复性实验(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。(2)采用工作标准品3，(含有2.1
×
102copies/μl junv质粒非传染性dna片段)进行8个验证重复性：(3)重复性实施方法：步骤1、配制反应液(按10个反应进行配制)：从反应缓冲液中吸取250μl加入预先准备好的1 .5mlep管，分别加入167μl的水，21μl引物，6μl探针(引物的浓度为10μm，探针的浓度为10μm)，充分混匀，得混匀后的反应液。步骤2、raa荧光基础反应试剂重溶准备9个raa荧光基础反应试剂，每次吸取46.5μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的10个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为raa反应体系，并做好标记。步骤3、加样反应
在以上10个配制好的raa荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μlmg
2+
后，在以上10个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中的2个各加入1μl阴性质控品、其他8个反应管中分别加入1μl标准工作品3为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μl。步骤4、检测及结果将混匀的10个反应管放入恒温荧光基因检测仪raa-f1620中，设定反应温度为39
°
c，反应时间20min。根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mv判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mv的判定为阴性。相对荧光值＝测定荧光值-起始扩增荧光值(实际值标准化为500mv)检测结果显示除阴性对照外，工作标准品3全部在20min内均有扩增，重复性较好。3、特异性实验(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。(2)特异性实验中马秋波病毒、普马拉病毒及拉沙热病毒由宁波国际旅行卫生保健中心提供，汉坦病毒的样本核酸由宁波国际旅行卫生保健中心实验室提供。(3)样本提取方法：组织样本先进行均浆，再按天根商品化组织提取rna方法提取核酸；全血、血清、血浆按采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；-20
°
c保存备用。(4)特异性实验实施方法：步骤1、配制反应液(按10个反应进行配制)：从反应缓冲液中吸取250μl加入预先准备好的1.5mlep管，分别加入167μl的水，21μl引物，6μl探针(引物的浓度为10μm，探针的浓度为10μm)，充分混匀，得混匀后的反应液。步骤2、raa荧光基础反应试剂重溶准备10个raa荧光基础反应试剂，每次吸取46.5μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的10个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为raa反应体系，并做好标记。步骤3、加样反应在以上10个配制好的raa荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μlmg
2+
后，在以10个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中的1个加入1μl阴性质控品、其他9个反应管中分别加入1μl工作标准品3、2.5
×
106copies/μlmacv质粒、2.3
×
106copies/μllasv质粒、2.1
×
106copies/μlpuuv质粒、汉坦病毒样本核酸，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μl。步骤4、检测及结果将混匀的10个反应管放入恒温荧光基因检测仪raa-f1620中，设定反应温度为39
°
c，反应时间20min。根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mv判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mv的判定为阴性。
相对荧光值＝测定荧光值-起始扩增荧光值(实际值标准化为500mv)检测结果显示只有工作标准品3有明显扩增，macv质粒、lasv质粒、puuv质粒、汉坦病毒样本核酸均没有明显扩增，显示出良好的特异性。实施例3实际样本检测(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。(2)实验中临床样本1～8共计8个，由宁波国际旅行卫生保健中心提供；(3)样本提取方法：组织样本先进行均浆，再按天根商品化组织提取rna方法提取核酸；血清、血浆按采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；-20
°
c保存备用；(4)实施方法步骤1、配制反应液(按10个反应进行配制)：从反应缓冲液中吸取250μl加入预先准备好的1.5mlep管，分别加入167μl的水，21μl引物，6μl探针(引物的浓度为10μm，探针的浓度为10μm)，充分混匀，得混匀后的反应液。步骤2、raa荧光基础反应试剂重溶准备10个raa荧光基础反应试剂，每次吸取42.5μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的10个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为raa反应体系，并做好标记。步骤3、加样反应在以上10个配制好的raa荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μlmg
2+
后，在以上10个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中的1个加入1μl阴性质控品、1个加入工作标准品3，其他8个反应管中分别加入5μljunv样本核酸，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μl。步骤4、检测及结果将混匀的10个反应管放入恒温荧光基因检测仪raa-f1620中，设定反应温度为39
°
c，反应时间20min。根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mv判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mv的判定为阴性。相对荧光值＝测定荧光值-起始扩增荧光值(实际值标准化为500mv)检测结果显示8例hev样本核酸通过raa检测方法和qpcr检测方法的结果一致性为100％，均为阴性；阴性对照样品无扩增，而阳性对照样品出现目标曲线。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。