一种CEPro722启动子及其应用的制作方法

本发明涉及农业生物，尤其涉及一种cepro722启动子及其应用。

背景技术：

1、转基因技术已经成为研究基因功能的基础研究应用研究领域不可或缺的技术之一，启动子作为驱动基因表达的重要功能顺式作用元件，在转基因技术中占据重要地位。启动子按其表达方式可分为组成型启动子、诱导型启动子和时空特异型启动子三类。组成型启动子能够在所有或大多数组织中启动基因转录，使基因表达具有时空持续性和表达恒定性。诱导型启动子能够在某些物理或化学信号的刺激下启动或大幅提高基因表达量，它们具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并表现出明显的专一性。时空特异型启动子只在特定的生长阶段或部位中启动基因表达。深入研究启动子的表达模式既有利于理解基因的表达调控机制和生物学功能，又有助于有效调控外源基因的表达。

2、目前，在植物转化过程中应用较多的启动子主要是花椰菜花病毒的启动子(camv35spro)和玉米多聚泛素蛋白基因启动子(zmubipro)。camv35spro是植物dna病毒的启动子，在应用于植物转基因中时，可能引起不必要的担忧；zmubipro虽然来源于植物，但在转化时频繁使用同一种启动子易导致转基因沉默。因此，挖掘新的高效的组成型启动子，尤其是植物本源的、生物安全低风险的启动子在显得尤其重要。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的问题，本发明提供一种cepro722启动子及其应用。

2、本发明提供一种cepro722启动子，所述cepro722启动子包括如下任一核苷酸序列：

3、i)seq id no.1所示的核苷酸序列或seq id no.2所示的核苷酸序列；

4、ii)与i)互补的核苷酸序列；

5、iii)如i)所示的核苷酸序列经取代、缺失、增加一个或多个核苷酸序列得到的具有同等启动子功能的核苷酸序列。

6、本发明进一步提供用于扩增权利要求1所述的cepro722启动子的引物对，包括：如seq id no.3-4所示的引物对，和/或如seq id no.5-6所示的引物对。

7、进一步地，如seq id no.3-4所示的引物对用于扩增如seq id no.1所示核苷酸序列；如seq id no.5-6所示的引物对用于扩增如seq id no.2所示核苷酸序列。

8、本发明进一步提供包含所述cepro722启动子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

9、进一步地，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒还包括功能基因和终止子。

10、进一步，所述功能基因为植物农艺性状相关基因或标记基因。

11、标记基因，即可以起到特异性标记作用的基因，通常用于检验基因转化成功与否，优选为β-葡萄糖苷酸酶基因gus、潮霉素磷酸转移酶基因hn、乙酰乳酸合酶突变基因als、bar基因、抗性epsps基因或nptii基因中的一种或多种。

12、植物农艺性状，即和农作物的生育期、株高、叶面积、果实重量、品质、除草剂抗性、病虫害抗性等可以代表作物品种特点的相关性状。相应的，植物农艺性状相关的基因即是和这些性状相关的基因。

13、本发明进一步提供包括所述cepro722启动子，或所述引物对，或所述生物材料的试剂盒。

14、本发明进一步提供所述cepro722启动子，或所述引物对，或所述生物材料，或所述试剂盒在制备转基因植物中的应用。

15、进一步地，所述应用为，将所述cepro722启动子构建至载体中后导入植物中制备转基因植物；或，将所述生物材料导入植物中制备转基因植物。

16、进一步地，在制备得到转基因植物后，通过标记基因进行筛选。

17、作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，包括：

18、通过农杆菌转化法将包括所述cepro722启动子的载体转化至水稻愈伤组织中；

19、将所述水稻愈伤组织经过抗性筛选和分化得到水稻幼苗；

20、将所述水稻幼苗进行生根培养得到转基因水稻。

21、进一步地，所述水稻愈伤组织通过如下方法制备得到：

22、水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，28～30℃暗培养30～50天；

23、进一步地，在将植物组成型启动子cepro432转化至水稻愈伤组织中后，还包括共培养，所述共培养为在22～24℃暗培养至愈伤组织表面出现菌体；

24、进一步地，所述抗性筛选为将经过共培养的愈伤组织接种到添加潮霉素的筛选培养基中，28～30℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；

25、进一步地，所述分化为将经过抗性筛选的愈伤组织添加至添加潮霉素的分化培养基上，28～30℃光照培养25-40天。

26、进一步地，所述生根培养为将水稻幼苗接种到添加潮霉素的生根培养基上生根，30～32℃光照培养5～20天。

27、进一步地，在生根培养后，包括pcr检测，选择检测为阳性的植株种植。

28、本发明进一步提供所述cepro722启动子或所述生物材料在驱动基因在植物中表达中的应用，例如在植物愈伤组织、营养生长期的组织或生殖器官中的一种或多种中表达的应用。

29、进一步地，所述基因包括：功能基因、功能基因的反义基因、或小rna基因；

30、所述功能基因优选包括植物农艺性状相关基因或标记基因，所述小rna基因优选为能够干扰功能基因表达的小rna基因。

31、进一步地，所述植物为水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米中的一种或多种。

32、本发明具备如下有益效果：

33、本发明筛选得到一种cepro722启动子，该启动子为组成型启动子，来源于玉米中，其可以驱动基因在水稻、玉米或小麦的愈伤组织、营养生长期的主要功能组织(根、叶、花、幼苗、幼穗等)或生殖器官中高效表达，特别是别是3-5叶期幼苗中高效表达。

34、本发明提供的启动子cepro722可与植物内源或外源筛选标记基因组成植物转基因筛选表达盒，或植物遗传转化筛选载体，并添加其他功能元件进行植物组织培养或植物遗传转化，为植物遗传转化的筛选提供了有效的工具和方法。

35、本发明提供的启动子cepro722还可驱动基因在转化苗的营养生长期地上和地下部分的主要功能组织中高效表达。除此之外，启动子cepro722为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源基因片段，不仅丰富了植物转基因的启动子资源，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，具有良好的市场价值和社会效益。

技术特征：

1.一种cepro722启动子，其特征在于，所述cepro722启动子包括如下任一核苷酸序列：

2.一种引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增权利要求1所述的cepro722启动子，所述引物对包括：如seq id no.3-4所示的引物对，和/或如seq id no.5-6所示的引物对。

3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求1所述cepro722启动子，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

4.根据权利要求3所述生物材料，其特征在于，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒还包括功能基因和终止子；

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述cepro722启动子、权利要求2所述引物对、或权利要求3所述生物材料中的一种或多种。

6.权利要求1所述cepro722启动子，或权利要求2所述引物对，或权利要求3或4所述生物材料，或权利要求5所述试剂盒在制备转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为将权利要求1所述cepro722启动子构建至载体上，后转化至植物中。

8.权利要求1所述cepro722启动子，或权利要求3或4所述生物材料在驱动基因在植物中表达中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述基因为功能基因、功能基因的反义基因、或小rna基因；

10.根据权利要求6-10任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米中的一种或多种。

技术总结
本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种CEPro722启动子及其应用。所述CEPro722启动子包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明经过研究，在GRMZM2G069722基因中筛选发现了CEPro722启动子，该启动子可以驱动基因在例如水稻、小麦或玉米等植株中表达；尤其是在植物愈伤组织、营养生长期的叶片，幼穗及种子等各组织中高效稳定的表达，可替代非植物源启动子。本发明提供的CEPro722启动子在植物的基因工程领域有重要意义，可有效降低外源DNA引起的转基因植物的潜在安全风险。

技术研发人员：安保光,欧阳超,赵光苗,陈思兰,赵惠敏,吴永忠,黄培劲
受保护的技术使用者：海南波莲水稻基因科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12