小麦籽粒大小相关蛋白TaGS2互作蛋白的筛选方法及应用

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及小麦籽粒大小相关蛋白tags2互作蛋白的筛选方法及应用。

背景技术：

1、粒重，作为小麦产量构成三要素之一，对小麦产量有重要影响，它主要由籽粒大小和籽粒灌浆程度控制。籽粒大小主要通过粒长、粒宽、粒厚影响小麦的千粒重，最终影响小麦产量。因此，开展小麦籽粒大小相关的研究对提高小麦产量具有重要意义。

2、普通小麦(triticum aestivum,2n＝6×＝42；bbaadd)为异源六倍体，遗传背景极其复杂，有着巨大的基因组(17.9×109bp)和冗余的重复序列(>80％)，与水稻(≈400mb)、玉米(≈3gb)等基因组相对较小的作物相比，其功能研究和作用机制研究较其它作物困难。

3、酵母双杂交系统(yeast two hybrid system,y2h)是研究生物体内蛋白质与蛋白质之间相互作用的一种强大且常用的分子生物学技术，它具有设计简单、易操作、实验成本低等优点，因此在分子生物学研究中应用广泛。目前，该技术主要应用于植物、动物和微生物等研究中。例如，2014年，chini等利用y2h检测技术识别了以高通量的方式直接调节植物激素感知复合物的小分子。因此，该技术在植物激素感知复合物的鉴定和分析中发挥着关键作用。2021年，也利用酵母双杂交技术鉴定了犬弓形虫抗原的互作蛋白，并对其宿主-寄生虫相互作用机制进行了较为深入的研究。另外，该技术在人类疾病和药物研究上，尤其是对帕金森病的发病机制研究方面也取得了较大的进步。

4、随着分子生物技术的快速发展，酵母双杂交技术在小麦中也得到了广泛的应用。2019年，he等通过图位克隆成功地从小麦中克隆a pore-forming toxin-like(pft)基因，并通过酵母双杂获得了23个与pft相互作用的蛋白，它们主要参与泛素化过程、网格蛋白外壳组装、氧化还原过程和蛋白磷酸化。阐明了pft与其互作蛋白的作用机制，并提出了pft对抗赤霉病基因fhb抗性的网络调控机理。2020年，yu等利用酵母双杂证实了小麦蛋白磷酸酶pp2c-a10可与小麦延迟萌发蛋白tadog1l1(delay of germination 1)和tadog1l4相互作用，促进转基因拟南芥种子萌发，降低种子的耐旱性。2021年，kim等在研究编码rna聚合酶ii相关因子1(paf1)基因taelf7的分子生物学功能时，利用酵母双杂技术成功验证了taelf7可与环型e3连接酶tahub2直接相互作用，为解析该基因在小麦小花发育和扬花阶段起负调控因子的作用机制奠定了基础。除此之外，该技术在小麦品质、干旱胁迫以及其它非生物胁迫等相关研究中也发挥了重要作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种小麦籽粒大小相关蛋白tags2互作蛋白的筛选方法及应用，筛选出小麦籽粒大小相关蛋白tags2的互作蛋白，确定蛋白tags2在小麦生长发育、生殖器官生长、籽粒贮藏蛋白和种子发育中的作用。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供的小麦籽粒大小相关蛋白tags2互作蛋白的筛选方法及应用是这样实现的：

3、一种小麦籽粒大小相关蛋白tags2互作蛋白的筛选方法，包括如下步骤：

4、诱饵载体pgbkt7-tags2的构建：将小麦tags2 cds序列连接到载体pgbkt7上，重组载体质粒转入dh5α感受态细胞中，提取大肠杆菌质粒进行测序，确定pgbkt7-tags2诱饵载体构建成功；

5、验证tags2是否具有自激活活性：将pgbkt7-tags2重组载体、阴性对照pgbkt7-lam和阳性对照pgbkt7-p53分别与pgadt7共同转入酵母菌株y2h gold感受态细胞中，分别在二缺培养基、三缺培养基和四缺培养基上培养，确定tags2编码的蛋白具有自激活功能；

6、tags2转录激活区分析：设计特异性引物序列tags2-n-f/r和tags2-c-f/r，分别克隆tags2-n端和tags2-c端，构建pgbkt7-tags2-n和pgbkt7-tags2-c重组载体；将建好的两个载体分别转化y2h gold酵母菌，涂布在二缺培养基、三缺培养基和四缺培养基上培养，确定tags2的n端没有自激活活性、c端含有明显的自激活活性；

7、tags2互作蛋白的筛选：将小麦酵母文库质粒dna和无自激活活性的诱饵表达载体pgbkt7-tags2-n转入y2h gold酵母感受态中，分别在二缺培养基、三缺培养基和四缺培养基上培养，筛选出蓝色单克隆菌落，菌液pcr检测确认阳性克隆；将筛选获得的阳性克隆进行测序和序列的blast比对分析，确定与tags2互作的蛋白。

8、可选的，所述将小麦tags2 cds序列连接到载体pgbkt7上，重组载体质粒转入dh5α感受态细胞中是：根据小麦tags2编码区序列及pgbkt7载体序列，设计特异性引物tags2-f/r，在tags2基因两端分别引入nde i和sal i酶切位点，以小麦tags2-pmd18-t质粒dna为模板进行pcr扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段正确；目的片段的回收和纯化后，同时与pgbkt7载体进行双酶切、连接、转化大肠杆菌dh5α。

9、可选的，所述提取大肠杆菌质粒进行测序，是利用特异性引物tags2-f/r进行单克隆菌落的pcr检测，然后测序。

10、可选的，所述特异性引物tags2-f/r核苷酸序列如seq id no.4和seq idno.5所示。

11、可选的，特异性引物序列tags2-n-f/r核苷酸序列如seq id no.6和seq id no.7所示。

12、可选的，特异性引物序列tags2-c-f/r核苷酸序列如seq id no.8和seq id no.9所示。

13、可选的，所述tags2-n端包含qlq结构域和wrc结构域。

14、可选的，所述确定与tags2互作的蛋白是：xp_044426945.1、xp_044386493.1、xp_044356054.1、kag6582739.1、xp_044391097.1、xp_044323317.1、xp_044362945.1和xp_044381339.1，分别对应：水解酶氨基酰化酶、烯醇酶、茉莉-氨基酸合成酶、光合系统i中心亚基ii、光合系统i中心亚基ii、可能的蛋白酶体抑制剂、富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子和硫醇蛋白酶糊粉酶。

15、小麦籽粒大小相关蛋白tags2，在小麦生长发育、花器官生殖器官生长、籽粒贮藏蛋白或/和种子发育、机械损伤抗逆方面的应用。

16、小麦籽粒大小相关蛋白tags2在与烯醇酶taeno，光系统i反应中心亚基iitapsad2，参与植物生长发育、尤其是花器官等生殖器官生长的蛋白酶抑制剂，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子tasr45a-like，以及与籽粒贮藏蛋白相关的硫醇蛋白酶糊粉酶的相互作用中的应用。

17、本发明公开了一种小麦籽粒大小相关的重组质粒pgbkt7-tags2，通过酵母双杂交技术可获得更多的与小麦籽粒大小相关性状的基因资源。诱饵蛋白tags2可与其互作蛋白相互作用，共同调控小麦的籽粒大小，从而影响小麦的千粒重或者产量。本发明通过对小麦tags2自激活检测、转录活性区域分析，并利用酵母双杂交技术体系筛选与tags2互作的候选蛋白，为进一步阐明tags2调控小麦籽粒大小的分子机制奠定基础。

18、本发明对小麦tags2进行了自激活性检测，克隆tags2-n端区域(包含qlq结构域和wrc结构域)和tags2-c端区域(不包含qlq结构域和wrc结构域)，检测tags2的n端和c端的转录激活活性，分析tags2自激活结构域的位置。利用前期已构建好的小麦酵母cdna文库，以tags2-n为诱饵，通过酵母双杂交技术筛选其互作蛋白，将其阳性克隆进行鉴定、测序；利用ncbi数据库对筛选获得的tags2的候选互作蛋白进行分析。研究结果表明，tags2具有自激活活性，其转录激活功能区位于蛋白序列c端。以无自激活活性的tags2-n为诱饵，筛选酵母的cdna文库，共获得8个互作蛋白，这些蛋白涉及到植物生长发育、花器官生殖器官生长、籽粒贮藏蛋白或/和种子发育、机械损伤抗逆等多个方面。