1.本发明属于肝素生产技术领域。更具体地，涉及一种提取动物肺脏中肝素的方法。
背景技术：
2.养殖的家畜主要的利用部位为肉和皮毛，其余脏器如肺脏等的市场需求较少，往往价格低廉，经济效益较低，除少量的动物肺直接食用或加工成饲料肥料外，大部分都被丢弃，造成了极大的生物资源的浪费。实际上，动物的肺脏中含有非常丰富的肝素，完全可以作为肝素生产的材料来源。其中所述肝素是从动物组织中提取的粘多糖硫酸酯类抗凝血物质，通过和抗凝血酶的结合产生抗凝血功能，是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物。肝素主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，是在血液透析治疗中唯一有效的特效药物；并且，肝素或其衍生物还具有调血脂、抗炎、抗过敏及免疫调节等多种生物学功能，到目前为止还没有一种产品能够完全替代肝素的临床作用，其仍然是当今最重要的抗凝药物之一。
3.目前肝素的提取主要以小肠黏膜为原料，采用盐解-树脂交换法、酶解-树脂交换法、超声波辅助盐解法和盐解酶解结合法等进行肝素的提取。但是上述方法无法直接应用于动物肺脏中提取肝素，因为动物肺脏中肝素会和肺脏中存在的各种蛋白质、肝素类似物、核酸类似物、小分子物质等杂质结合，常用的针对小肠粘膜的肝素提取方法无法将肝素与杂质较好的分离，残留的杂质会直接影响肝素的抗凝效果，降低效价。针对动物肺脏提取肝素的问题，中国专利申请提供了一种利用猪肺提取肝素钠粗品的制备工艺，主要通过肝素钠专用酶酶解、树脂吸附、沉淀等步骤来对猪肺中的肝素进行提取；但是该工艺所采用的肝素钠专用酶主要为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，只能去除蛋白质，而对于肺脏肝素中存在的其他杂质如肝素类似物、小分子物质等无法去除，仍然存在于肝素钠粗品中，活性较低，效价仅为90u/mg。
4.因此，迫切需要提供一种可以高效提取动物肺脏中肝素的方法，并且可以显著提高所得肝素的效价。
技术实现要素：
5.本发明要解决的技术问题是克服现有针对动物肺脏肝素提取的方法较难完全除杂，所得肝素效价交底的缺陷和不足，提供一种可以高效提取动物肺脏中肝素的方法，并且可以显著提高所得肝素的效价。
6.本发明的目的是提供一种提取动物肺脏中肝素的方法。
7.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8.一种提取动物肺脏中肝素的方法，包括以下步骤：
9.s1、复合酶解：将动物肺脏加水匀浆，调节匀浆液ph为8.0～8.8，温度为40～45℃，加入复合酶酶解完全，过滤，收集滤液；
10.s2、树脂吸附与洗脱：调节步骤s1所得滤液的ph为8.2～8.5，加入阴离子交换树
脂，搅拌至完全吸附，过滤，收集树脂，用12～16wt％盐水洗脱，收集洗脱液；
11.s3、膜分离：将步骤s2所得洗脱液用聚丙烯腈膜或聚砜酰胺膜进行膜分离，得截留液；
12.s4、氧化过滤：向步骤s3所得截留液中加入30～35wt％过氧化氢溶液，氧化完全后过滤，收集滤液；
13.s5、醇沉干燥：调节步骤s4所得滤液ph至中性，加入饱和盐水搅拌均匀，再加入乙醇溶液，搅拌均匀，沉淀完全，收集沉淀物，干燥，即得；
14.其中，所述复合酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶组成。
15.本发明先采用由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶组成的复合酶对动物肺脏中的蛋白质、核酸类似物等杂质进行酶解，再依次经过阴离子交换树脂去除矿物质、金属盐、色素等杂质，然后经过膜分离将肝素截留，去除分子量较小的杂质，最后依次经过氧化、醇沉，即可得到杂质残留量少，效价较高的肝素产品。
16.进一步地，步骤s1中，所述复合酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶按重量比10：(3～5)：(0.3～0.5)组成。优选地，所述复合酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶按重量比10：(4～5)：(0.4～0.5)组成。更优选地，所述复合酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶按重量比10：5：0.5组成。
17.更进一步地，步骤s1中，所述复合酶的添加量为匀浆液质量的0.05～0.2％。优选地，所述复合酶的添加量为匀浆液质量的0.1～0.2％。
18.进一步地，步骤s1中，所述酶解的时间为3～4h。
19.优选地，步骤s1中，所述动物肺脏和水的体积比为1:(3～4)。
20.优选地，步骤s1中，所述过滤采用的是80～100目的筛网。
21.更进一步地，步骤s2中，所述用12～16wt％盐水洗脱先用12～14wt％盐水洗脱，再用15～16wt％盐水洗脱。优选地，先用树脂体积3～4倍量的12～14wt％盐水洗脱2～3h，再用树脂体积2倍量的15～16wt％盐水洗脱1～2h，合并两次洗脱液。
22.优选地，步骤s2中，所述完全吸附需要3～4h。
23.优选地，步骤s2中，所述过滤的筛网为80～100目。
24.进一步地，步骤s3中，所述聚丙烯腈膜或聚砜酰胺膜的截留分子量为3000～4000da。
25.更进一步地，步骤s3中，当截留液体积为步骤s2所得洗脱液总体积15～20％时，停止膜分离。
26.进一步地，步骤s4中，所述过氧化氢溶液的添加量为步骤s3所得截留液体积的0.8～1.2％。
27.更进一步地，步骤s4中，所述氧化的时间为16～24h。
28.优选地，步骤s4中，过滤采用0.22～0.45μm微孔滤膜过滤器进行过滤。
29.进一步地，步骤s5中，所述乙醇溶液的乙醇体积浓度为80～100％。
30.优选地，步骤s5中，所述乙醇溶液的添加量为步骤s4所得滤液和盐水总体积的1.5～2倍量体积。
31.优选地，步骤s5中，所述沉淀完全所需时间为8～12h。
32.更进一步地，所述动物肺脏主要包括猪、牛、羊的肺脏。
33.经过测定，本发明方法制备得到的肝素效价大于100u/mg。
34.本发明具有以下有益效果：
35.本发明一种提取动物肺脏中肝素的方法，采用复合酶解、树脂吸附与洗脱、膜分离、氧化过滤、醇沉干燥的步骤，对动物肺脏进行处理，提取其中的肝素，可以将动物肺脏中含有的蛋白质等其他杂质最大程度地与肝素分离，避免杂质的存在影响肝素的抗凝效果，显著提高动物肺脏中提取所得肝素的效价；并且，本发明方法操作简单，非常适合大规模产业化生产肝素。
具体实施方式
36.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
37.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
38.实施例1一种提取动物肺脏中肝素的方法
39.所述提取动物肺脏中肝素的方法具体包括以下步骤：
40.s1、复合酶解：向动物肺脏中加入体积3倍量的水后，粉碎匀浆，调节匀浆液ph为8.0，温度为40℃，加入匀浆液质量0.05％的复合酶(由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶按重量比10：3：0.3组成)，酶解反应3h至反应完全，用80目筛网过滤，收集滤液；
41.s2、树脂吸附与洗脱：调节步骤s1所得滤液的ph为8.2，加入阴离子交换树脂，搅拌3h至完全吸附，用80目筛网过滤，收集树脂，先用树脂体积3倍量的12～14wt％盐水洗脱2h，再用树脂体积2倍量的15～16wt％盐水洗脱1h，合并两次洗脱液；
42.s3、膜分离：将步骤s2所得洗脱液用聚丙烯腈膜(截留分子量为3000da)进行膜分离，当截留液体积为步骤s2所得洗脱液总体积15％时，停止膜分离，得截留液；
43.s4、氧化过滤：向步骤s3所得截留液中加入截留液体积0.8％的30wt％过氧化氢溶液，常温下氧化16h完全后，不断搅拌并用0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液；
44.s5、醇沉干燥：调节步骤s4所得滤液ph至7.0，加入饱和盐水搅拌均匀，再加入滤液和盐水总体积的1.5倍量体积95％乙醇溶液，搅拌均匀，沉淀8h至完全，收集沉淀物，减压真空干燥，即得。
45.实施例2一种提取动物肺脏中肝素的方法
46.所述提取动物肺脏中肝素的方法具体包括以下步骤：
47.s1、复合酶解：向动物肺脏中加入体积3.5倍量的水后，粉碎匀浆，调节匀浆液ph为8.5，温度为42℃，加入匀浆液质量0.1％的复合酶(由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶按重量比10：4：0.4组成)，酶解反应3.5h至反应完全，用80目筛网过滤，收集滤液；
48.s2、树脂吸附与洗脱：调节步骤s1所得滤液的ph为8.4，加入阴离子交换树脂，搅拌3.5h至完全吸附，用80目筛网过滤，收集树脂，先用树脂体积3.5倍量的12～14wt％盐水洗脱2.5h，再用树脂体积2倍量的15～16wt％盐水洗脱1.5h，合并两次洗脱液；
49.s3、膜分离：将步骤s2所得洗脱液用聚砜酰胺膜(截留分子量为4000da)进行膜分离，当截留液体积为步骤s2所得洗脱液总体积18％时，停止膜分离，得截留液；
50.s4、氧化过滤：向步骤s3所得截留液中加入截留液体积1％的30wt％过氧化氢溶液，常温下氧化20h完全后，不断搅拌并用0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液；
51.s5、醇沉干燥：调节步骤s4所得滤液ph至7.0，加入饱和盐水搅拌均匀，再加入滤液和盐水总体积的1.8倍量体积95％乙醇溶液，搅拌均匀，沉淀10h至完全，收集沉淀物，减压真空干燥，即得。实施例3一种提取动物肺脏中肝素的方法
52.所述提取动物肺脏中肝素的方法具体包括以下步骤：
53.s1、复合酶解：向动物肺脏中加入体积4倍量的水后，粉碎匀浆，调节匀浆液ph为8.8，温度为45℃，加入匀浆液质量0.2％的复合酶(由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶按重量比10：5：0.5组成)，酶解反应4h至反应完全，用80目筛网过滤，收集滤液；
54.s2、树脂吸附与洗脱：调节步骤s1所得滤液的ph为8.5，加入阴离子交换树脂，搅拌4h至完全吸附，用100目筛网过滤，收集树脂，先用树脂体积4倍量的12～14wt％盐水洗脱3h，再用树脂体积2倍量的15～16wt％盐水洗脱2h，合并两次洗脱液；
55.s3、膜分离：将步骤s2所得洗脱液用聚丙烯腈膜(截留分子量为3000da)进行膜分离，当截留液体积为步骤s2所得洗脱液总体积20％时，停止膜分离，得截留液；
56.s4、氧化过滤：向步骤s3所得截留液中加入截留液体积1.2％的30wt％过氧化氢溶液，常温下氧化24h完全后，不断搅拌并用0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液；
57.s5、醇沉干燥：调节步骤s4所得滤液ph至7.0，加入饱和盐水搅拌均匀，再加入滤液和盐水总体积的2.0倍量体积95％乙醇溶液，搅拌均匀，沉淀10h至完全，收集沉淀物，减压真空干燥，即得。对比例1一种提取动物肺脏中肝素的方法
58.所述提取动物肺脏中肝素的方法具体包括以下步骤：
59.s1、复合酶解：向动物肺脏中加入体积3倍量的水后，粉碎匀浆，调节匀浆液ph为8.0，温度为40℃，加入匀浆液质量0.05％的复合酶(由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶按重量比8：3：0.3组成)，酶解反应3h至反应完全，用80目筛网过滤，收集滤液；
60.s2、树脂吸附与洗脱：调节步骤s1所得滤液的ph为8.2，加入阴离子交换树脂，搅拌3h至完全吸附，用80目筛网过滤，收集树脂，先用树脂体积3倍量的12～14wt％盐水洗脱2h，再用树脂体积2倍量的15～16wt％盐水洗脱1h，合并两次洗脱液；
61.s3、膜分离：将步骤s2所得洗脱液用聚丙烯腈膜(截留分子量为3000da)进行膜分离，当截留液体积为步骤s2所得洗脱液总体积15％时，停止膜分离，得截留液；
62.s4、氧化过滤：向步骤s3所得截留液中加入截留液体积0.8％的30wt％过氧化氢溶液，常温下氧化16h完全后，不断搅拌并用0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液；
63.s5、醇沉干燥：调节步骤s4所得滤液ph至7.0，加入饱和盐水搅拌均匀，再加入滤液和盐水总体积的1.5倍量体积95％乙醇溶液，搅拌均匀，沉淀8h至完全，收集沉淀物，减压真空干燥，即得。
64.其中，对比例1与实施例1方法不同之处在于，对比例1改变复合酶的组成，采用的复合酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶按重量比8：3：0.3组成，其余操作及参数参考实施例1。
65.对比例2一种提取动物肺脏中肝素的方法
66.所述提取动物肺脏中肝素的方法具体包括以下步骤：
67.s1、复合酶解：向动物肺脏中加入体积3倍量的水后，粉碎匀浆，调节匀浆液ph为8.0，温度为40℃，加入匀浆液质量0.05％的复合酶(由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按重量比10：3组成)，酶解反应3h至反应完全，用80目筛网过滤，收集滤液；
68.s2、树脂吸附与洗脱：调节步骤s1所得滤液的ph为8.2，加入阴离子交换树脂，搅拌3h至完全吸附，用80目筛网过滤，收集树脂，先用树脂体积3倍量的12～14wt％盐水洗脱2h，再用树脂体积2倍量的15～16wt％盐水洗脱1h，合并两次洗脱液；
69.s3、膜分离：将步骤s2所得洗脱液用聚丙烯腈膜(截留分子量为3000da)进行膜分离，当截留液体积为步骤s2所得洗脱液总体积15％时，停止膜分离，得截留液；
70.s4、氧化过滤：向步骤s3所得截留液中加入截留液体积0.8％的30wt％过氧化氢溶液，常温下氧化16h完全后，不断搅拌并用0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液；
71.s5、醇沉干燥：调节步骤s4所得滤液ph至7.0，加入饱和盐水搅拌均匀，再加入滤液和盐水总体积的1.5倍量体积95％乙醇溶液，搅拌均匀，沉淀8h至完全，收集沉淀物，减压真空干燥，即得。
72.其中，对比例2与实施例1方法不同之处在于，对比例2改变复合酶的组成，采用的复合酶由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按重量比10：3组成，其余操作及参数参考实施例1。
73.对比例3一种提取动物肺脏中肝素的方法
74.所述提取动物肺脏中肝素的方法具体包括以下步骤：
75.s1、复合酶解：向动物肺脏中加入体积3倍量的水后，粉碎匀浆，调节匀浆液ph为8.0，温度为40℃，加入匀浆液质量0.05％的复合酶(由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和核酸酶按重量比10：3：0.3组成)，酶解反应3h至反应完全，用80目筛网过滤，收集滤液；
76.s2、树脂吸附与洗脱：调节步骤s1所得滤液的ph为8.2，加入阴离子交换树脂，搅拌3h至完全吸附，用80目筛网过滤，收集树脂，先用树脂体积3倍量的12～14wt％盐水洗脱2h，再用树脂体积2倍量的15～16wt％盐水洗脱1h，合并两次洗脱液；
77.s3、膜分离：将步骤s2所得洗脱液用聚丙烯腈膜(截留分子量为3000da)进行膜分离，当截留液体积为步骤s2所得洗脱液总体积15％时，停止膜分离，得截留液；
78.s4、氧化过滤：向步骤s3所得截留液中加入截留液体积0.8％的30wt％过氧化氢溶液，常温下氧化16h完全后，不断搅拌并用0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液；
79.s5、醇沉干燥：调节步骤s4所得滤液ph至7.0，加入饱和盐水搅拌均匀，再加入滤液和盐水总体积的1.5倍量体积95％乙醇溶液，搅拌均匀，沉淀8h至完全，收集沉淀物，减压真空干燥，即得。
80.其中，对比例3与实施例1方法不同之处在于，对比例3改变复合酶的组成，采用的复合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和核酸酶按重量比10：3：0.3组成，其余操作及参数参考实施例1。
81.对比例4一种提取动物肺脏中肝素的方法
82.所述提取动物肺脏中肝素的方法具体包括以下步骤：
83.s1、复合酶解：向动物肺脏中加入体积3倍量的水后，粉碎匀浆，调节匀浆液ph为8.0，温度为40℃，加入匀浆液质量0.05％的复合酶(由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和核酸酶按重量比10：3：0.3组成)，酶解反应3h至反应完全，用80目筛网过滤，收集滤液；
84.s2、树脂吸附与洗脱：调节步骤s1所得滤液的ph为8.2，加入阴离子交换树脂，搅拌3h至完全吸附，用80目筛网过滤，收集树脂，先用树脂体积3倍量的12～14wt％盐水洗脱2h，再用树脂体积2倍量的15～16wt％盐水洗脱1h，合并两次洗脱液；
85.s3、氧化过滤：向步骤s2所得洗脱液中加入洗脱液体积0.8％的30wt％过氧化氢溶
液，常温下氧化16h完全后，不断搅拌并用0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液；
86.s4、醇沉干燥：调节步骤s3所得滤液ph至7.0，加入饱和盐水搅拌均匀，再加入滤液和盐水总体积的1.5倍量体积95％乙醇溶液，搅拌均匀，沉淀8h至完全，收集沉淀物，减压真空干燥，即得。
87.其中，对比例4与实施例1方法不同之处在于，对比例4去掉膜分离的步骤，其余操作及参数参考实施例1。
88.试验例肝素效价测定
89.对实施例和对比例所得肝素的效价进行测定，测定方法为：
90.取冷冻储藏羊血浆，置于37℃的水浴锅自然融化，用脱脂棉过滤至清洁干燥的锥形瓶中备用；取冷藏的肝素钠标准品，精密吸取160μl、170μl、180μl、190μl、200μl置10ml带塞试管中，沿着试管壁依次加入1ml羊血浆、0.8ml 0.25wt％的cacl2溶液，盖好试管塞倒转3～4次摇匀，使内壁润湿，不得产生气泡，垂直放入37℃水浴锅中1小时，观察、并记录标准品半凝固点。制备待测肝素的固体样品和液体样品，逐级稀释待测肝素液体样品，通过羊血浆凝固法，对比标准品半凝固点，最终得出样品半凝固点。
[0091][0092][0093]
测定结果参见表1。
[0094]
表1实施例和对比例所得肝素效价测定结果
[0095]
组别效价(u/mg)实施例1110实施例2115实施例3120对比例195对比例290对比例385对比例475
[0096]
由表可见，本发明实施例制备得到的肝素效价均在100u/mg以上，所含杂质较少，避免了杂质对肝素效价的影响，可以达到较高的效价；并且制备方法简单，适于大规模产业化生产。而对比例1～4分别改变了复合酶的组成或制备方法，所得肝素中的杂质无法完全去除，直接影响到终产物的抗凝活性，效价显著降低。
[0097]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。