1.本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种保存菌种保护剂及其制备方法和应用。
背景技术：
2.优良的菌种是生物发酵生产的核心，是提供高效高产的保证。菌种保藏是指保持微生物菌株的生活力和遗传性状的技术。菌种保藏有多种方法，其原理大多大同小异，主要是运用一些方式尽量降低生物体内的代谢，达到延长生命，减少变异的目的。通常采用的方法为低温、缺氧、干燥。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
3.目前工业上常用的菌种保藏方法包括：斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、半固体穿刺保藏法、沙土管保藏法、冷冻真空干燥法、液氮超低温冻存法等。这些菌种保藏方法各有其优缺点。例如斜面低温保藏法虽然操作简便，成本低廉，复苏方便，但其保藏时间较短，而且因连续传代而容易引入基因突变或者杂菌，培养基的理化性质及微生物代谢产物等原因还会导致微生物性状发生改变；液体石蜡保藏法由于要试管直立保存，因此比较耗费空间，不便于携带；沙土管保藏法对于营养细胞效果不好；冷冻真空干燥法和液氮超低温冻存法对设备和操作人员要求高，操作繁琐。
4.为了克服上述缺陷，很多研究者对菌种保藏保护剂进行了研究，以期达到高效、简便的、稳定性好的菌种保藏目的，如专利cn 106544275 a和cn 111454843 a均提供了一种菌种保护剂的解决方案。但不同的菌种保护剂对菌种的保护性能差异较大，而且目前报道的菌种保护剂均从细胞学角度对菌种的稳定性的考虑，未考虑到在保藏过程中外界因素对细胞毒性的侵害。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于克服上述菌种保藏方法的缺陷，提供一种操作简便、生物安全性高、保藏效能稳定、成本低廉的菌种保护剂及保藏方法。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种菌种保藏保护剂包含以下成分及质量含量：10~20%甘油，2~5%海藻糖，0.04~0.1%胰蛋白胨；0.05~0.8%卵磷脂，0.01~0.05%硫代乙醇酸钠，0.01~0.03%亚硫酸氢钠，余量为去离子水。
7.作为优选，所述菌种保护剂包含以下成分及质量含量：15%甘油，3.5%海藻糖，0.07%胰蛋白胨；0.65%卵磷脂，0.03%硫代乙醇酸钠，0.02%亚硫酸氢钠，余量为去离子水。
8.以上菌种保护剂的制作方法为：按照菌种保护剂中各成分的质量配比，将甘油、海藻糖、胰蛋白胨、卵磷脂、硫代乙醇酸钠、亚硫酸氢钠与去离子水充分混合，于55-65℃水浴中将其完全溶解，将溶解后的菌种保护剂于120~125℃湿热灭菌18-25min备用。
9.优选地，所述水浴的温度为60℃。
10.优选地，所述湿热灭菌的温度为122℃。
11.优选地，所述湿热灭菌的温度为20min。
12.一种上述菌种保护剂的应用，采用以下方法：将所述菌种保护剂与菌种混合，菌种保护剂与菌种混合后菌种的浓度为103~107cfu/ml，于≤-20℃保藏。
13.上述菌种保护剂中各成分协同作用，实现对菌种的长期保藏。其中甘油是常规保护剂，可降低冰点，避免菌体损伤；海藻糖能保护蛋白质分子不变性失活，保持细胞的生命体征；胰蛋白胨提供氮源；卵磷脂、硫代乙醇酸钠、亚硫酸氢钠等能避免外界有毒物质对细胞的毒害侵蚀。
14.本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明提供的菌种保护剂能能解决传统甘油保护剂中菌体的不均匀状态，同时确保菌体性状的稳定，防止外界环境对菌体的毒害，同时该保藏方法成本低，无需购买专用设备，并且菌种存活率高，传代性能稳定。
具体实施方式
15.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
16.具体实施例1一种菌种保藏保护剂，由以下质量分数的成分组成：10%甘油，5%海藻糖，0.04%胰蛋白胨；0.8%卵磷脂，0.01%硫代乙醇酸钠，0.03%亚硫酸氢钠，余量为去离子水。
17.以上菌种保护剂的制作方法为：按照菌种保护剂中各成分的质量配比，将甘油、海藻糖、胰蛋白胨、卵磷脂、硫代乙醇酸钠、亚硫酸氢钠与去离子水充分混合，于55℃水浴中将其完全溶解，将溶解后的菌种保护剂于125℃湿热灭菌18min备用。
18.革兰氏阴性细菌验证将上述菌体保护剂与大肠杆菌（cgmcc 1.10756）混合均匀，混合后菌浓度为104cfu/ml于-20℃保藏24月，-70℃保藏10年，复苏后对菌种的生理生化特征及16srrna进行测序鉴定，未发生变异，说明此保护剂对该菌种有良好的保护作用。
19.具体实施例2一种菌种保藏保护剂，由以下质量分数的成分组成：20%甘油，2%海藻糖，0.1%胰蛋白胨；0.05%卵磷脂，0.05%硫代乙醇酸钠，0.01%亚硫酸氢钠，余量为去离子水。
20.以上菌种保护剂的制作方法为：按照菌种保护剂中各成分的质量配比，将甘油、海藻糖、胰蛋白胨、卵磷脂、硫代乙醇酸钠、亚硫酸氢钠与去离子水充分混合，于65℃水浴中将其完全溶解，将溶解后的菌种保护剂于120℃湿热灭菌25min备用。
21.革兰氏阳性细菌验证将上述菌体保护剂与枯草芽孢杆菌（cgmcc 1.14985）混合均匀，混合后菌浓度为105cfu/ml，于-20℃保藏12月，-70℃保藏5年，复苏后对菌种的生理生化特征及16srrna进行测序鉴定，未发生变异，说明此保护剂对该菌种有良好的保护作用。
22.具体实施例3一种菌种保藏保护剂，由以下质量分数的成分组成：15%甘油，3.5%海藻糖，0.07%胰蛋白胨；0.65%卵磷脂，0.03%硫代乙醇酸钠，0.02%亚硫酸氢钠，余量为去离子水。
23.以上菌种保护剂的制作方法为：按照菌种保护剂中各成分的质量配比，将甘油、海藻糖、胰蛋白胨、卵磷脂、硫代乙醇酸钠、亚硫酸氢钠与去离子水充分混合，于60℃水浴中将其完全溶解，将溶解后的菌种保护剂于122℃湿热灭菌20min备用。
24.里氏木霉保存后产纤维素酶性能验证将上述菌体保护剂与里氏木霉（ trichoderma reesei，cgmcc3.3711）混合均匀，混合后菌浓为106cfu/ml于-20℃保藏3年，复苏后对其产纤维素酶酶活进行测定。测定方法为：（1）将复苏后的菌种接种于平板pda培养基，30℃活化7天（2）发酵培养基配制：葡萄糖10g/l，纤维素粉20g/l，蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.2g/l，微量元素0.02g/l，ph6.5，500ml摇瓶装量为100ml，121~122℃灭菌60min，备用。
25.（3）用无菌生理盐水洗下步骤（1）活化好的孢子液，通过平板活菌计数将其稀释至浓度为1.0
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107cfu/ml，接种此浓度的孢子液1ml于步骤（2）所述的发酵培养基中，30℃，185r/min摇床培养6天，测定纤维素酶活性，结果如表1所示，可以看出，用此保护剂保藏里氏木霉（ trichoderma reesei，cgmcc3.3711）菌种，产纤维素酶活性并未受到影响。
26.表1 里氏木霉保藏3年与保藏前（对照）产纤维素酶性能对比
序号72h酶活（u/ml）96h酶活（u/ml）120h酶活（u/ml）144h酶活（u/ml）168h酶活（u/ml）对照8.2413.75818.76826.8336.494保藏3年后9.30416.91420.78427.70437.096
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。