一种降解二甲基二硫醚的同温层芽孢杆菌GDUTAN16及其应用

一种降解二甲基二硫醚的同温层芽孢杆菌gdutan16及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一种降解二甲基二硫醚的同温层芽孢杆菌gdutan16及其应用。


背景技术：

2.二甲基二硫醚(dimethyl disulfide，dmds)，又称二硫化二甲基，是一种重要的化工产品，广泛应用于石油工业中，可作为农药原料，生产杀虫剂“倍硫磷”，对害虫具有触杀和胃毒作用，对作物具有一定渗透性，也作为防腐剂和防焦剂以及石油加氢脱硫过程中预硫化剂，橡胶工业中的再生剂和增塑剂；此外，还可以应用于食品工业中，作为食品香精，农药原料等。二甲基二硫醚作为常见的硫醚类有机恶臭污染物，具有强烈、持久且具刺激性的蒜臭味，当人体大量吸入时，会引起呼吸困难、血压降低，并会出现呕吐、喉咙不适等症状；且某些恶臭污染物(如硫化氢、硫醇类、氨、甲硫醚、酚类或苯系化合物等)对人体具有毒害作用，兼有恶臭污染和有害气体污染两重性。可见，二甲基二硫醚的泄露会导致严重的恶臭污染困扰人们的生活，严重影响人们身心健康。为此寻找一种积极有效的方法来处理二甲基二硫醚带来的恶臭污染问题势在必行。
3.目前，治理恶臭污染物的方法主要有物理法、化学法和生物法，其中生物降解法因具有成本低、处理效果好、无二次污染等优点逐渐受到环境工作者重视。目前对于生物降解法的研究大多集中于研究能降解二甲基二硫醚的微生物菌株，已有研究表明能降解二甲基二硫醚的微生物菌株有：蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus fusiformis)和科恩芽孢杆菌(bacillus cohn)，对于能降解二甲基二硫醚的微生物菌株还未见其他不同的菌株报道；而关于同温层芽孢杆菌，现有技术中仅公开了对蛋白质或有机磷的降解功能的同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)，还未见有可降解二甲基二硫醚的同温层芽孢杆菌的相关报道。因此，为了扩充能降解二甲基二硫醚的微生物菌种资源库，有必要筛选出更多新的具有二甲基二硫醚降解能力的微生物菌株，为治理恶臭污染物提供新的治理方法，充实微生物菌种资源库。


技术实现要素：

4.本发明为了克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供了一株新的能降解二甲基二硫醚的同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)gdutan16菌株，该菌株能高效降解二甲基二硫醚，为治理恶臭污染物提供新的可治理的高效菌株和方法，充实微生物菌种资源库。
5.本发明的目的是提供一种能降解二甲基二硫醚的同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)gdutan16菌株。
6.本发明的第二个目的是提供所述同温层芽孢杆菌gdutan16的应用。
7.本发明的第三个目的是提供一种降解二甲基二硫醚的降解菌剂。
8.本发明的第四个目的是提供一种降解环境中二甲基二硫醚的方法。
9.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
10.一种能降解二甲基二硫醚的同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)gdutan16菌株，该菌株于2021年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20211470。该菌株从广东省广州市兴丰垃圾填埋场垃圾渗滤液中筛选分离纯化而得，经形态学特征和16s rrna基因序列分析鉴定为同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)相似度为100％，该gdutan16菌株的16s rdna的核苷酸序列如seq id no.1所示。同温层芽孢杆菌gdutan16的菌体的形态特性为为杆状，菌体大小为(1.4～1.6)μm
×
(0.4～0.5)μm，无鞭毛，菌落形态为圆形，淡黄色，不透明，菌落直径为5.0～6.0mm，属于革兰氏阳性菌。
11.本发明所述的同温层芽孢杆菌gdutan16菌株能高效降解二甲基二硫醚，在72h时，对浓度为5～25mg/l的二甲基二硫醚降解率均达到94％以上。
12.本发明提供所述同温层芽孢杆菌gdutan16菌株在降解二甲基二硫醚或制备降解二甲基二硫醚的降解菌剂中的应用。
13.本发明提供一种降解二甲基二硫醚的微生物制剂，含有同温层芽孢杆菌gdutan16菌株和/或其菌液。
14.优选地，所述菌液浓度不低于1.0
×
106cfu/ml。
15.本发明提供所述同温层芽孢杆菌gdutan16菌株在降解环境中二甲基二硫醚中的应用。
16.优选地，所述环境中二甲基二硫醚是指二甲基二硫醚污染土壤、二甲基二硫醚污染空气和/或含二甲基二硫醚污水。
17.本发明提供一种降解环境中二甲基二硫醚的方法，将同温层芽孢杆菌gdutan16菌株接种于培养基中，培养后得到菌液后对环境中的二甲基二硫醚进行处理。
18.优选地，所述菌株在无机盐培养基中的接种量为8～12％，培养温度30～40℃，时间18～25h。
19.更优选地，所述菌株在无机盐培养基中的接种量为10％，培养温度37℃，培养时间24h。
20.优选地，培养后的菌液浓度不低于1.0
×
106cfu/ml。
21.优选地，所述降解的二甲基二硫醚的浓度为5～25mg/l，降解温度30～40℃，时间为70～80h。
22.本发明具有以下有益效果：
23.本发明提供的一种能降解二甲基二硫醚的同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)gdutan16菌株，该菌株能高效降解二甲基二硫醚；本研究表明，同温层芽孢杆菌gdutan16菌株在72h对不同浓度下二甲基二硫醚的降解效率不同，同温层芽孢杆菌gdutan16菌株对5mg/l的二甲基二硫醚的降解效率能达到100％；在二甲基二硫醚的浓度逐渐增大时(15mg/l～25mg/l)其降解效率有所下降，但均能达到94％以上；表明本发明的同温层芽孢杆菌gdutan16菌株对二甲基二硫醚具有显著的降解作用。
24.同温层芽孢杆菌gdutan16菌株可以作为新型生物治理恶臭污染物的微生物细菌，用于降解二甲基二硫醚，为治理恶臭污染物提供新的可治理的高效菌株和方法，充实了微生物菌种资源库。
附图说明
25.图1为菌株gdutan16在电子扫描显微镜下的形态；
26.图2为不同初始浓度的二甲基二硫醚的降解率统计结果。
具体实施方式
27.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
28.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
29.以下实施例中采用的培养基配方为：
30.无机盐培养基：k2hpo4·
3h2o 1.2g/l，kh2po41.2 g/l，nh4cl 0.4g/l，mgso4·
7h2o 0.2g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，cacl2·
2h2o 0.2g/l，mnso4·
4h2o 0.2g/l，cuso4·
2h2o 0.01g/l，znso4·
7h2o 0.2g/l，cocl2·
6h2o 0.09g/l，na2moo4·
2h2o 0.12g/l，h3bo
3 0.006g/l；
31.肉汤培养基：牛肉膏3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 5.0g/l；
32.营养琼脂培养基：每升培养基含蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g。
33.实施例1菌株的分离筛选
34.本发明采用从广东省广州市兴丰垃圾填埋场的垃圾渗滤液，通过在无机盐培养基中添加二甲基二硫醚对菌株进行筛选，以二甲基二硫醚为驯化底物对菌株进行驯化，驯化底物浓度依次为1mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l和25mg/l。
35.驯化的具体步骤为：首先取10ml垃圾渗滤液加入含1mg/l二甲基二硫醚的无机盐培养基，37℃驯化5天后，以10％接种量移入下一浓度中接着驯化，以此类推逐步提高浓度进行驯化。
36.驯化结束后将不同驯化底物浓度的菌液稀释10-1
～10-7
倍，然后各取0.2ml分别均匀涂布在以二甲基二硫醚为碳源的无机盐培养基中，挑选生长速度快、边缘整齐的单菌落富集培养后进行的降解实验，将降解效果最好的菌落进行保存并做菌种鉴定。
37.实施例2菌株的鉴定分析
38.(1)菌株的形态特性：
39.通过常规的菌株生理生化鉴定方法得知所筛选出的菌株为革兰氏阳性菌；将筛选出的菌株放在扫描电子显微镜sem下观察，观察到其形态为杆状，菌体大小为(1.4～1.6)μm
×
(0.4～0.5)μm，无鞭毛，结果如图1所示；在营养琼脂培养基培养24h后，菌落形态为圆形，淡黄色，不透明，菌落直径为5.0～6.0mm；菌株主要的生理生化特征如下表1所示。
40.表1菌株的生理生化特征
41.[0042][0043]
注：反应状态分为阳性和阴性，阳性形状编码为“+”，阴性形状编码为
“‑”
。
[0044]
(2)16s rdna鉴定：
[0045]
采用dna提取试剂盒提取菌株的总dna，采用细菌的16s rdna通用引物：
[0046]
上游引物：27f(5'-agtttgatcmtggctcag-3')；
[0047]
下游引物：1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')；
[0048]
经pcr扩增其16s rdna基因，pcr扩增程序为：95℃预变性3min；30个扩增循环，条件为95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸10min；最后程序停止于12℃；
[0049]
pcr扩增体系为：总体系25μl，master mix(blue)12.5μl，10μm的前后引物各0.5μl，模板dna10 ng，补ddh2o至25μl。采用的样本全部按照上述实验条件进行，每个样本均进行3个重复处理，将同一样本的3个pcr产物混合。pcr产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后测序分析，得到菌株的16s rdna的核苷酸序列如seq id no:1所示。将长为1449bp的16srrna基因序列与genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌种与bacillus stratosphericus strain foki 29最相似，相似度为100％。
[0050]
综合上述的生理生化特性和16s rrna基因序列结果，表明本发明所筛选的细菌应归属于同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)，命名为为同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)gdutan16菌株，该菌株于2021年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m20211470，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
[0051]
实施例3菌株gdutan16降解环境中二甲基二硫醚性能的评价
[0052]
(1)配置无机盐培养基：
[0053]
在血清瓶中加入100ml配制好的无机盐培养液，置于121℃下高压灭菌30min。
[0054]
(2)同温层芽孢杆菌gdutan16降解环境中二甲基二硫醚：
[0055]
将实施例1中筛选得到的同温层芽孢杆菌gdutan16菌株接种在肉汤培养基中富集增菌培养24h，离心，收集菌体，用pbs洗涤三次；然后以10％接种量将同温层芽孢杆菌gdutan16接种于装有100ml步骤(1)制备的无机盐培养基的血清瓶中，再加入不同浓度的二甲基二硫醚使其在无机培养基，其浓度分别为5mg/l、8mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l和25mg/l，加盖密封后置于37℃恒温摇床，在140r/min下振荡72h进行降解试验。
[0056]
(3)同温层芽孢杆菌gdutan16菌株对二甲基二硫醚的降解能力检测：
[0057]
使用含硫化学发光检测器(scd)的agilent gc 8850气相色谱仪(agilent db sulfur scd毛细管柱(60m
×
0.32mm
×
4.2μm)，测定气相中二甲基二硫醚的浓度，经过计算从而得到其降解率。
[0058]
气相色谱仪的检测条件为：进样量为1ml，分流比10：1，进样口气化室温度80℃，检测器氧化气流量50ml/min；加热器250℃；燃烧器850℃；升温程序：35℃保持3min，然后10℃/min升至200℃，保持3min。采用agilent 1ml气密针进样。采用气相色谱仪检测不同初始浓度的二甲基二硫醚的降解率统计结果如图2所示，由结果可知同温层芽孢杆菌gdutan16菌株在72h对不同浓度下二甲基二硫醚的降解效率不同，同温层芽孢杆菌gdutan16菌株对5mg/l的二甲基二硫醚的降解效率能达到100％；同温层芽孢杆菌gdutan16菌株对8mg/l和10mg/l的二甲基二硫醚的降解效率差异不大，降解效率均在98％左右；在二甲基二硫醚的浓度逐渐增大时(15mg/l～25mg/l)其降解效率有所下降，但均能达到94％以上；表明本发明的同温层芽孢杆菌gdutan16菌株对二甲基二硫醚具有显著的降解作用。
[0059]
综上所述，本发明提供的一种能降解二甲基二硫醚的同温层芽孢杆菌gdutan16菌株，该菌株能高效降解二甲基二硫醚，对环境中二甲基二硫醚具有良好的降解性能，在72h时，对浓度为5～25mg/l的二甲基二硫醚降解率均达到94％以上；同温层芽孢杆菌gdutan16菌株可以作为新型生物治理恶臭污染物的微生物细菌，用于降解二甲基二硫醚，为治理恶臭污染物提供新的可治理的高效菌株和方法，充实了微生物菌种资源库。
[0060]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。