一株能够快速降解多种农药残留的蜡样芽孢杆菌的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体是一种能够快速降解多种农药残留的蜡样芽孢杆菌。


背景技术：

2.我国生态环境部与自然资源部于2014年4月17日联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，当前我国土壤存在有机型污染较为严重的问题，有机污染物超标情况仅次于重金属污染。有机污染物中的农药是重要的污染源之一，农药具有高毒、高残留、难降解的性质，是一种重要的农用化学品，在世界各地广泛使用，在防治农业病虫害、保证农作物增产增收方面，对农业发展起到了重要的促进作用。自农药诞生以来，为了满足人口增长对粮食的需求，其在全球范围的使用量不断上升。我国是农业大国，为了防治农作物病虫害的发生，每年使用大量农药，农药的年均使用量和出口量均居世界首位。农药在使用的过程中会对农业工作者的身体健康造成一定的威胁，对生物群落、土壤、水体和大气等生态环境乃至全球生态圈造成污染。为了解决这个矛盾，一方面需要开发高效、低毒、低残留的化学农药或生物农药，另一方面则是要找到能够高效、快速降解农药残留的制剂。
3.生物修复技术是80年代以来出现和发展的清除和治理环境污染的生物工程技术，生物修复技术包括植物修复、动物修复、微生物修复、生物联合修复等。理论上，该技术路线的潜力最大，有望实现最彻底的修复效果。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：提供一株能够快速降解多种农药残留的蜡样芽孢杆菌。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
6.本发明提供了一株农药残留广谱降解菌株，经鉴定为蜡样芽孢杆菌22-2(bacillus cereus 22-2)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年7月26日，保藏编号为cctcc no：m 2021936。
7.本菌株是从山东有20年蔬菜种植历史的大棚土壤中筛选得到，对吡虫啉、啶虫脒、三唑酮、噻唑膦、百菌清和氯氟氰菊酯等农药具有快速的降解效果，其中能够高效快速降解的农药是啶虫脒、噻唑膦和三唑酮。
8.该菌株形态特征是在lb平板培养基上，30℃、培养48小时，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色蜡烛样菌落，直径5-7mm，培养时间稍长，菌落表面及侧面呈毛玻璃状。
9.将该菌株进行分子生物学鉴定，测得其16s rdna序列，并在genbank核酸数据库中进行blast比对，结合该菌株的生物学特性和16s rdna比对结果，申请人确认该菌株为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)，命名为蜡样芽孢杆菌22-2(bacillus cereus 22-2)。
10.本发明还提供了所述蜡样芽孢杆菌22-2在降解吡虫啉、啶虫脒、三唑酮、噻唑膦、
百菌清、氯氟氰菊酯农药残留中的应用。
11.进一步的，所述蜡样芽孢杆菌22-2可以降解土壤或水体环境中吡虫啉、啶虫脒、三唑酮、噻唑膦、百菌清、氯氟氰菊酯等农药残留，其中啶虫脒、噻唑膦和三唑酮可以被快速高效降解。
12.本发明还提供一种利用所述的蜡样芽孢杆菌22-2生产的农药残留降解菌剂。所述农药残留降解菌剂对啶虫脒、噻唑膦和三唑酮等污染到土壤中的农药具有快速的降解效果。
13.本发明还提供一种所述的农药残留降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
14.(1)将蜡样芽孢杆菌22-2培养到对数期的试管液按发酵培养基体积的0.5-1％接种于发酵培养基中，培养至对数期，制得发酵菌种；
15.(2)将上述制得发酵菌种按种子罐的培养基体积的5-10％接种于种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；
16.(3)将种子液按5吨生产罐的培养基体积的5-10％接种于生产罐的培养基中培养发酵，发酵温度为32℃，镜检芽孢率达到95％以上时停止发酵，发酵完成后加入质量为12.2％的轻质钙粉并进行离心后再喷雾干燥，制得菌量为10亿/g的粉剂产品。
17.进一步的，本发明还进一步对所述菌株进行分子生物学检测，提供所述的蜡样芽孢杆菌22-2的基因岛、go功能、kegg功能、cog功能、nr功能和tcdb功能基因及数量。
18.本发明的有益效果：
19.本发明提供的蜡样芽孢杆菌22-2应用于土壤中，可以有效降解多种农药残留，高效降解啶虫脒、噻唑膦和三唑酮农药，降低化学农药对土壤的污染，降低作物的农药残留；同时有效降低因化学农药作用而导致的病原菌抗药性，保护土壤微生态系统平衡，改善作物生存环境并提高其抗病能力，对作物增产和品质提生有着重要意义。
附图说明
20.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
21.图1蜡样芽孢杆菌22-2基因岛中基因分布统计图。对菌株进行框架测序，采用islandpath-diomb软件(version 0.2)预测基因岛，测序结果发现该菌株有14个基因岛。
22.图2蜡样芽孢杆菌22-2菌株基因功能注释go功能分类图。对菌株22-2进行的基因功能注释，go功能的全称是gene ontology，是一套国际标准化的基因功能描述的分类系统。go分为三大类：1)细胞组分(cellular component)：用于描述亚细胞结构、位置和大分子复合物，如核仁、端粒和识别起始的复合物；2)分子功能(molecular function)：用于描述基因、基因产物个体的功能，如与碳水化合物结合或atp水解酶活性等；3)生物过程(biological process)：用来描述基因编码的产物所参与的生物过程，如有丝分裂或嘌呤代谢等。go数据库三大分类基因的统计结果如下图。说明：横坐标表示样品注释上的go功能分类，右侧纵坐标表示注释上的基因个数，左侧纵坐标表示注释上的基因个数占所有编码基因的百分比。
23.图3蜡样芽孢杆菌22-2基因功能注释kegg代谢通路分类图。kegg全称为kyoto encyclopedia of genes and genomes。系统分析基因产物和化合物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能的数据库。它整合了基因组、化学分子和生化系统等方面的数据,
包括代谢通路(kegg pathway)、药物(kegg drug)、疾病(kegg disease)、功能模型(kegg module)、基因序列(kegg genes)及基因组(kegg genome)等等。ko(kegg ortholog)系统将各个kegg注释系统联系在一起，kegg已建立了一套完整ko注释的系统，可完成新测序物种的基因组或转录组的功能注释。说明：条形图上的数字代表注释上的基因数目；其余一个坐标轴是数据库中level1各功能类的代码。
24.图4蜡样芽孢杆菌22-2基因功能注释cog功能分类图。cog全称是cluster of orthologous groups of proteins，由ncbi创建并维护的蛋白数据库，根据细菌、藻类和真核生物完整基因组的编码蛋白系统进化关系分类构建而成。通过比对可以将某个蛋白序列注释到某一个cog中，每一簇cog由直系同源序列构成，从而可以推测该序列的功能。cog数据库按照功能一共可以分为二十六类。横坐标表示cog功能类型，纵坐标表示注释上的基因个数。
25.图5蜡样芽孢杆菌22-2基因功能注释nr功能分类图。nr全称为non-redundant protein database，是一个非冗余的蛋白质数据库，由ncbi创建并维护，其特点在于内容比较全面，同时注释结果中会包含有物种信息，可作物种分类用。根据基因注释到的物种情况，统计注释到的物种及基因数目，其统计结果如下图。横坐标表示物种id，纵坐标表示注释上的基因个数。
26.图6蜡样芽孢杆菌22-2基因功能注释tcdb功能分类图。cdb全称是transporter classification database，转运蛋白分类数据库，是膜转运蛋白，包括离子通道(ion channels)的分类系统(tc system)。tcdb数据库转移系统以5个级别进行分类，第一级统计结果如下图。横坐标表示tcdb一级分类类型，纵坐标表示注释上的基因个数。
具体实施方式
27.实施例1菌株来源与鉴定
28.1、菌株来源：
29.本实施例提供一种蜡样芽孢杆菌，是从山东寿光有20年蔬菜种植历史的大棚土壤中筛选得到，对吡虫啉、啶虫脒、三唑酮、噻唑膦、百菌清、氯氟氰菊酯有降解作用，其中对残留在土壤中啶虫脒、噻唑膦和三唑酮农药具有快速高效的降解效果。
30.2、特征：
31.在lb平板培养基上，30℃、培养48小时，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色蜡烛样菌落，直径5-7mm，培养时间稍长，菌落表面及侧面呈毛玻璃状。
32.将该菌株进行分子生物学鉴定，测得其16s rdna序列，并在genbank核酸数据库中进行blast比对，结合该菌株的生物学特性和16s rdna比对结果，申请人确认该菌株为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)，命名为蜡样芽孢杆菌22-2(bacillus cereus 22-2)。申请人已于2021年7月26日将上述解蜡样芽孢杆菌22-2(bacillus cereus 22-2)保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021936。
33.实施例2菌剂样品制备
34.本实施例提供一种蜡样芽孢杆菌22-2的农药残留降解菌剂，具体方法如下：
35.(1)将蜡样芽孢杆菌22-2培养到对数期的试管液按发酵培养基体积的0.5-1％接种于发酵培养基中，培养至对数期，制得发酵菌种；
36.(2)将上述制得发酵菌种按种子罐的培养基体积的5-10％接种于种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；
37.(3)将种子液按5吨生产罐的培养基体积的5-10％接种于生产罐的培养基中培养发酵，发酵温度为32℃，镜检芽孢率达到95％以上时停止发酵，发酵完成后加入质量为12.2％的轻质钙粉并进行离心后再喷雾干燥，制得菌量为10亿/g的粉剂产品。
38.实施例3蜡样芽孢杆菌22-2降解吡虫啉能力评价
39.1、试验地点山东省寿光市潍坊科技学院北洛实验基地
40.2、试验设计
41.实验田块在2天前进行灌溉，两天后吡虫啉农药(98％原药)稀释为500mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植一周的甜瓜植株)，同时施入含10g菌剂的悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的吡虫啉农药和100ml清水)、阴性对照(根围施入200ml清水)。
42.3、吡虫啉农药降解效果测定
43.污染土壤修复7天和9天后分别取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定土壤样品中吡虫啉的的含量，同时进行吡虫啉标准品的土壤添加回收实验，检测结果如表1-2所示，吡虫啉从土壤中的回收率在94％以上，22-2菌株修复7天和9天比不修复的土壤吡虫啉降解率分别增加16.9％和35.4％。
[0044][0045]
表1吡虫啉污染土壤蜡样芽孢杆菌22-2降解7天测定结果
[0046][0047]
表2吡虫啉污染土壤蜡样芽孢杆菌22-2降解9天测定结果
[0048][0049][0050]
实施例4蜡样芽孢杆菌22-2降解啶虫脒能力评价
[0051]
1、试验地点山东省寿光市潍坊科技学院北洛实验基地
[0052]
2、试验设计
[0053]
实验田块在2天前进行灌溉，两天后啶虫脒农药(98％原药)稀释为500mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植一周的甜瓜植株)，同时施入含10g菌剂的悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的啶虫脒农药和100ml清水)、阴性对照((根围施入200ml清水)。
[0054]
3、啶虫脒农药降解效果测定
[0055]
污染土壤处理7天和14天后分别取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定土壤样品中啶虫脒的的含量，同时进行啶虫脒标准品的土壤添加回收实验，检测结果如表3-4所示，啶虫脒从土壤中的回收率在96％以上，22-2菌株修复7天和14天比不修复的土壤啶虫脒降解率分别增加45.9％和89.8％。
[0056][0057]
表3啶虫脒污染土壤蜡样芽孢杆菌22-2降解7天测定结果
[0058]
[0059][0060]
表4啶虫脒污染土壤蜡样芽孢杆菌22-2降解14天测定结果
[0061][0062]
实施例5蜡样芽孢杆菌22-2降解噻唑膦能力评价
[0063]
1、试验地点山东省寿光市潍坊科技学院北洛实验基地
[0064]
2、试验设计
[0065]
实验田块在2天前进行灌溉，两天后噻唑膦农药(98％原药)稀释为500mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植一周的甜瓜植株)，同时含有10g菌剂的悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的噻唑膦农药和100ml清水)、阴性对照((根围施入200ml清水)。
[0066]
3、噻唑膦农药降解效果测定
[0067]
污染土壤处理9天后取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定土壤样品中噻唑膦的的含量，同时进行噻唑膦标准品的土壤添加回收实验，检测结果如表5所示，噻唑膦从土壤中的回收率为97％以上，22-2菌株修复9天比不修复的土壤噻唑膦降解率增加76.1％。
[0068][0069]
表5噻唑膦污染土壤蜡样芽孢杆菌22-2降解9天测定结果
[0070][0071]
实施例6蜡样芽孢杆菌22-2降解三唑酮能力评价
[0072]
1、试验地点山东省寿光市潍坊科技学院北洛实验基地
[0073]
2、试验设计
[0074]
实验田块在2天前进行灌溉，两天后三唑酮农药(98％原药)稀释为500mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植一周的甜瓜苗植株)，同时施入含有10g菌剂的悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的三唑酮农药和100ml清水)、阴性对照((根围施入200ml清水)。
[0075]
3、三唑酮农药降解效果测定
[0076]
污染土壤处理7天和14天后分别取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定土壤样品中三唑酮的的含量，同时进行三唑酮标准农药的土壤添加回收实验，检测结果如表6-7所示，三唑酮从土壤中的回收率在99％以上，22-2菌株修复7天和14天比不修复的土壤三唑酮降解率增加65.5％和66.1％。
[0077][0078]
表6三唑酮污染土壤蜡样芽孢杆菌22-2降解7天测定结果
[0079][0080]
表7三唑酮污染土壤蜡样芽孢杆菌22-2降解14天测定结果
[0081][0082]
实施例7蜡样芽孢杆菌22-2降解百菌清能力评价
[0083]
1、试验地点：山东省寿光市潍坊科技学院北洛实验基地
[0084]
2、试验设计
[0085]
实验田块在2天前进行灌溉，两天后百菌清农药(98％原药)稀释为1000mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植一周的甜瓜植株)，同时含有10g菌剂的悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的百菌清农药和100ml清水)、阴性对照((根围施入200ml清水)。
[0086]
3、百菌清农药降解效果测定
[0087]
污染土壤处理9天和14天取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用气相色谱-质谱仪测定土壤样品中百菌清的的含量，同时进行百菌清标准品的土壤添加回收实验，检测结果如表8-9所示，百菌清从土壤中的回收率在90％以上，22-2菌株修复9天比不修复的土壤百菌清降解率增加87.1％和93.8％。
[0088][0089]
表8百菌清污染土壤蜡样芽孢杆菌22-2降解9天测定结果
[0090][0091]
表9百菌清污染土壤蜡样芽孢杆菌22-2降解14天测定结果
[0092][0093][0094]
实施例8蜡样芽孢杆菌22-2菌株的基因注释
[0095]
提取蜡样芽孢杆菌22-2的基因组dna，利用随机pcr扩增和序列的双端测序，测序得到的原始数据(raw data)，由于原始数据会存在一定比例的低质量数据，为了保证后续信息分析结果的准确可靠，首先要对原始数据进行过滤处理，得到有效数据(clean data)，步骤如下：
[0096]
(1)去除所含低质量碱基(质量值≤20)超过一定比例(默认设为40％)的reads；
[0097]
(2)去除n碱基达到一定比例的reads(默认设为10％)；
[0098]
(3)去除与adapter之间overlap超过一定阈值(默认设为15bp)，且错配数小于3的
reads；
[0099]
(4)对于小基因组等项目，如果样品存在宿主污染，需与宿主数据库进行比对，过滤掉可能来源于宿主的reads。
[0100]
从各样品质控后的clean data出发，进行基因组组装，得到能反映样品基因组基本情况的序列文件，并对组装结果进行评价。基因组组装的具体处理步骤如下：
[0101]
(1)经过预处理后得到clean data，使用soap denovo组装软件进行组装：
[0102]
选取不同的k-mer(默认选取95、107、119)进行组装，根据项目类型选择最优的kmer，
[0103]
选取最少scaffold的组装结果；利用最优kmer并调节其他参数(-d-u-r-f等)再次筛选得到初步组装结果；
[0104]
(2)使用spades软件进行组装：
[0105]
选取不同的k-mer(默认选取99和127)进行组装，根据项目类型选择最优的kmer，选取最少scaffold的组装结果；
[0106]
(3)使用abyss软件进行组装：选取k-mer 64进行组装，获得组装结果：
[0107]
(4)使用cisa软件整合三个软件的组装结果，并挑选其中最少scaffold的组装结果；
[0108]
(5)采用gapclose软件对初步组装结果进行补洞，并且通过过滤低测序深度(小于平均深度的0.35)的reads去除同lane污染，从而得到最终的组装结果；
[0109]
(6)过滤掉500bp以下的片段，并进行评估和统计分析以及后续基因预测。
[0110]
(7)通过go(gene ontology，http://geneontology.org/)、kegg kyoto encyclopedia of genes and genomes，http://www.genome.jp/kegg/)、cog(cluster of orthologous groups of proteins，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cog/)、nr(nonredundant protein database)、tcdb(transporter classification database)进行22-2菌株功能基因的数量和功能注释。
[0111]
功能注释基本步骤如下：
[0112]
1)将预测基因与各功能数据库进行blast比对(blastp，evalue≤1e-5)；
[0113]
2)blast结果过滤：对于每一条序列的blast结果，选取score最高的比对结果(默认identity》＝40％，coverage》＝40％)进行注释。注释结果见附图1-附图6。
[0114]
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。