一种臭氧荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种臭氧荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.活性氧物种(reactive oxygen species,ros)是一类生物体中用于调控细胞活动的关键生物信号分子，包括双氧水(h2o2)、超氧阴离子(o
2.-)、臭氧(o3)等。在神经系统、心血管系统中发挥着广泛的病理生理作用，与神经传导、血管舒张、血压调节、线粒体保护与细胞凋亡等有着密切的关系。研究表明，抗体可以催化单线态分子氧(1o2*)和水生成过氧化氢(h2o2)，并且这个过程可以导致有效杀灭细菌，但单靠抗体产生的h2o2不足以杀死细菌，通过研究就发现抗体催化的水氧化途径产生了一种额外的分子物种，其化学特征与o3相似。随后在被激活的人体中性粒细胞的氧化爆发和炎症过程中也检测到这种物质。wentworth等人通过大量研究发现了动脉粥样硬化斑块中产生o3的证据，这表明内源性o3的产生可能是动脉粥样硬化的一个促成因素，并可能与胆固醇积累、氧化、炎症和细胞损伤等看似独立的因素有关，这些因素导致了动脉粥样硬化的发病机制。同时，也有研究发现大脑中的o3可以通过产生过量的il-8来诱导小鼠抑郁行为，表明内源性o3与抑郁症有密切的关系。因此，发展对o3浓度精准检测的新方法，对深入理解与之相关的生理功能意义重大。
3.对复杂生物样品中o3浓度的精准检测，往往因受到各种因素的制约而导致检测结果不理想。传统的o3浓度检测方法有液相色谱法、化学发光法等，但这些方法受到检测时间长、灵敏度低及无法在生物体内原位检测等限制。荧光探针分析法具有简便快捷、灵敏度高、选择性好、成本低等优点，这使得利用荧光探针实现对o3的精准检测成为科研工作者追求的目标。然而，已开发的o3荧光探针仍具有以下不足：一是探针多用于体外检测，具有较低的生物适用性；二是复杂体系中选择性比较差、灵敏度不高；三是探针斯托克位移比较小，检测误差大。
4.有鉴于此，开发一种能高选择性、高灵敏性、便捷快速检测o3浓度的技术是十分重要的。


技术实现要素：

5.本发明提供的一种臭氧荧光探针及其制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
6.为了实现上述技术目的，本发明主要采用以下技术方案：
7.一种臭氧荧光探针，所述探针具有式(i)所示的结构式：
[0008][0009]
其中，当r1＝h，r2＝h时，该探针用mip-o3表示；
[0010]
当r1＝h，r2＝cl时，该探针用mip-cl-o3表示；
[0011]
当r1＝cl，r2＝cl时，该探针用mip-cl
2-o3表示；
[0012]
其中，上述臭氧荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0013][0014]
步骤一：在无水、惰性气氛保护下，将4-羟基苯甲醛或3-氯-4-羟基苯甲醛或3，5-二氯-4-羟基苯甲醛与4-溴-1-丁烯溶于有机溶剂，然后在碱性条件下发生亲核取代反应，得到醛基中间体，所述醛基中间体的结构式为：
[0015][0016]
其中，当r1＝h，r2＝h时，该中间体用mip表示；
[0017]
当r1＝h，r2＝cl时，该中间体用mip-cl表示；
[0018]
当r1＝cl，r2＝cl时，该中间体用mip-cl2表示；
[0019]
步骤二：在无水、惰性气氛保护下，将步骤一中制备得到的醛基中间体与丙二腈异佛尔酮溶于有机溶剂，在催化剂条件下反应制备得到式(i)所示的化合物。
[0020]
上述制备方法中，步骤一中，所述4-羟基苯甲醛或3-氯-4-羟基苯甲醛或3，5-二氯-4-羟基苯甲醛与所述4-溴-1-丁烯的摩尔用量之比为1:1.2，所述惰性气氛为氩气，所述有机溶剂为干燥的n，n-二甲基甲酰胺，所述碱性条件为碳酸钾，反应温度为50-80℃，反应时间为6-12h。
[0021]
进一步的，步骤一中，所述醛基中间体为反应后先通过有机溶剂稀释反应体系，然后水洗除去n，n-二甲基甲酰胺、干燥、过滤、旋干并通过硅胶柱色谱法纯化得到。
[0022]
更进一步的，稀释反应体系所用的有机溶剂为乙酸乙酯，硅胶柱色谱法采用的洗脱液为石油醚/乙酸乙酯的混合液。
[0023]
优选的，所述石油醚/乙酸乙酯的混合液中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为10:1。
[0024]
上述制备方法中，步骤二中，所述醛基中间体与丙二腈异佛尔酮的摩尔用量之比为1:1，所述惰性气氛为氩气，所述有机溶剂为乙腈，所述催化剂为哌啶，反应温度为80-100
℃，反应时间为4-8h。
[0025]
更进一步的，步骤二中，还包括在反应后依次进行减压除去溶剂和使用乙醇进行重结晶的步骤。
[0026]
本发明还提供了上述的臭氧荧光探针或采用上述制备方法制备得到的荧光探针在检测臭氧中的应用。
[0027]
具体的，其检测臭氧的方法如下：在37℃下，将荧光探针加入到ph＝7.4的磷酸缓冲液中，加入不同浓度的臭氧进行检测，观察探针的荧光强度变化。
[0028]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0029]
(1)本发明提供的荧光探针可以通过建立荧光强度与臭氧浓度的线性关系()，定量检测臭氧浓度；
[0030]
(2)本发明提供的荧光探针选择性好，抗干扰性强，灵敏度高，样品检测不需繁琐的预处理过程，响应快，检测效率高。
附图说明
[0031]
图1是荧光探针mip-cl
2-o3检测臭氧的荧光滴定结果图；
[0032]
图2是荧光探针mip-cl
2-o3对臭氧响应时间图；
[0033]
图3是荧光探针mip-cl
2-o3对臭氧的选择性实验结果图；
[0034]
图4是荧光探针mip-cl
2-o3对细胞内臭氧的荧光成像图。
具体实施方式
[0035]
下面通过实例结合附图对本发明做进一步的说明，实施例仅用于说明本发明的方法，包括但不限于实施例的方法。
[0036]
实施例1：本发明臭氧荧光探针mip-o3的合成
[0037][0038]
在无水、氩气保护环境下，将化合物4-羟基苯甲醛(1.22g,10.0mmol)和4-溴-1-丁烯(1.62g,12.0mmol)溶于n，n-二甲基甲酰胺(30ml)，然后加入碳酸钾(4.15g,30.0mmol)，加热至80℃反应6小时。冷却至室温，用乙酸乙酯(200ml)稀释反应体系，水洗(6
×
50ml)除去n，n-二甲基甲酰胺，干燥、过滤、旋干，以石油醚：乙酸乙酯(10：1)为洗脱剂进行柱层析，得到中间体mip。
[0039]
然后，再在无水、氩气保护环境下，将丙二腈异佛尔酮(500mg,2.7mmol)和mip(475m g,2.7mmol)溶于乙腈(10ml)中，然后加入哌啶(0.5ml)，加热至90℃反应4小时后，减压除去溶剂，乙醇重结晶得到黄色晶体mip-o3。
[0040]
核磁表征数据：1h nmr(400mhz,cdcl3):δ7.46(d,j＝8.8hz,2h),7.02(d,j＝16.1hz,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.86(d,j＝16.1hz,1h),6.80(s,1h),5.93-5.85(m,1h),5.28(dq,j＝17.2,1.5hz,1h),5.14-5.10(m,1h),4.05(t,j＝6.7hz,2h),2.59-2.50
(m,4h),2.45(s,2h),1.07(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3):δ169.3,160.3,154.3,136.9,134.1,129.1,128.3,126.9,122.6,117.2,115.0,113.7,112.9,77.6,67.3,42.9,39.2,33.5,31.9,27.9。
[0041]
质谱表征数据：hrms calcd for c
23h24
n2o[m-h]-343.1810,found 343.1854。
[0042]
实施例2：本发明臭氧荧光探针mip-cl-o3的合成
[0043][0044]
在无水、氩气保护环境下，将化合物3-氯-4-羟基苯甲醛(1.56g,10.0mmol)和4-溴-1-丁烯(1.62g,12.0mmol)溶于n，n-二甲基甲酰胺(30ml)，然后加入碳酸钾(4.15g,30.0mmol)，加热至80℃反应6小时。冷却至室温，用乙酸乙酯(200ml)稀释反应体系，水洗(6
×
50ml)除去n，n-二甲基甲酰胺，干燥、过滤、旋干，以石油醚：乙酸乙酯(10：1)为洗脱剂进行柱层析，得到中间体mip-cl。
[0045]
然后，再在无水、氩气保护环境下，将丙二腈异佛尔酮(500mg,2.7mmol)和mip-cl(567m g,2.7mmol)溶于乙腈(10ml)中，然后加入哌啶(0.5ml)，加热至90℃反应4小时后，减压除去溶剂，乙醇重结晶得到黄色晶体mip-cl-o3。
[0046]
核磁表征数据：1h nmr(400mhz,cdcl3):δ7.53(d,j＝2.2hz,1h),7.36(dd,j＝8.6,2.2hz,1h),6.93(d,j＝16.1hz,1h),6.92(d,j＝8.6hz,1h),6.85(d,j＝16.1hz,1h),6.81(s,1h),5.98-5.88(m,1h),5.20(dq,j＝17.2,1.6hz,1h),5.17-5.12(m,1h),4.11(t,j＝6.7hz,2h),2.62(t,j＝6.7hz,2h),2.59(s,2h),2.44(s,2h),1.07(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3):δ169.1,155.5,153.6,135.3,133.7,129.2,129.1,128.0,127.1,123.6,123.2,117.5,113.5,113.2,112.7,78.3,68.4,42.9,39.1,33.3,31.9,27.9。
[0047]
质谱表征数据：hrms calcd for c
23h24
cln2o[m-h]-377.1421,found 377.1465。
[0048]
实施例3：本发明臭氧荧光探针mip-cl
2-o3的合成
[0049]
在无水、氩气保护环境下，将化合物3,5-二氯-4-羟基苯甲醛(1.89g,10.0mmol)和4-溴-1-丁烯(1.62g,12.0mmol)溶于n，n-二甲基甲酰胺(30ml)，然后加入碳酸钾(4.15g,30.0mmol)，加热至80℃反应6小时。冷却至室温，用乙酸乙酯(200ml)稀释反应体系，水洗(6
×
50ml)除去n，n-二甲基甲酰胺，干燥、过滤、旋干，以石油醚：乙酸乙酯(10：1)为洗脱剂进行柱层析，得到中间体mip-cl2。
[0050]
然后，再在无水、氩气保护环境下，将丙二腈异佛尔酮(500mg,2.7mmol)和mip-cl2(660mg,2.7mmol)溶于乙腈(10ml)中，然后加入哌啶(0.5ml)，加热至90℃反应4小时后，减压除去溶剂，乙醇重结晶得到黄色晶体mip-cl
2-o3。
[0051]
核磁表征数据：1h nmr(400mhz,cdcl3):δ7.43(s,2h),6.88-6.85(m,3h),5.99-5.92(m,1h),5.20(dq,j＝17.2,1.7hz,1h),5.19-5.11(m,1h),4.10(t,j＝6.8hz,2h),2.63(t,j＝6.8hz,2h),2.60(s,2h),2.42(s,2h),1.07(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3):δ168.9,152.6,152.1,134.0,133.4,133.0,130.6,130.1,127.5,124.4,117.2,113.2,112.4,79.7,72.9,42.8,39.0,34.4,31.9,27.9。
[0052]
质谱表征数据：hrms calcd for c
23h24
cl2n2o[m-h]-411.1031,found 411.1035。
[0053]
实施例4：荧光探针mip-cl
2-o3检测臭氧的荧光滴定。
[0054]
如图1所示，37℃下，在磷酸缓冲溶液(ph＝7.4)中加入荧光探针mip-cl
2-o3(10μm)。当往探针溶液中加入不同浓度臭氧时，探针荧光强度逐渐增强。探针在668nm处荧光强度与臭氧浓度(0-30μm)呈现良好的线性关系(r2＝0.994)，由此可计算出检出限为385nm。该实例证明探针mip-cl
2-o3能高灵敏检测臭氧。
[0055]
实施例5：荧光探针mip-cl
2-o3对臭氧响应时间。
[0056]
如图2所示，37℃下，在磷酸缓冲溶液(ph＝7.4)中先加入荧光探针mip-cl
2-o3(10μm)，再加入臭氧(30μm)，记录668nm处荧光强度随时间的变化，发现mip-cl
2-o3的荧光强度在30分钟几乎饱和。该实例证明探针mip-cl
2-o3可快速检测臭氧。
[0057]
实施例6：荧光探针mip-cl
2-o3对臭氧的选择性实验。
[0058]
如图3所示，37℃下，在多组磷酸缓冲溶液(ph＝7.4)中先加入荧光探针mip-cl
2-o3(10μm)，再分别加入不同的生理活性干扰物：三价铁离子(20μm)、、双氧水(100μm)、次氯酸钠(20μm)、单线态氧(50μm)、超氧阴离子(100μm)、一氧化氮(50μm)、过氧亚硝基阴离子(20μm)、硫代硫酸钠(200μm)、柠檬酸(50μm)、钠离子(100μm)、钙离子(100μm)、锌离子(100μm)、半胱氨酸(500μm)、谷胱甘肽(500μm)。该实例证明探针mip-cl
2-o3对臭氧选择性很高，仅有臭氧引起探针在668nm处的荧光强度明显增加，而其他生理活性物种几乎没有变化。
[0059]
实施例7：荧光探针mip-cl
2-o3对细胞内臭氧的荧光成像。
[0060]
如图4所示，选取了人巨噬细胞raw264.7来验证探针mip-cl
2-o3在细胞水平上对外源/内源臭氧的成像能力。细胞成像实验分为三组：1.对照组，37℃下，将探针mip-cl
2-o3与raw264.7细胞共孵育30分钟；2.外源性臭氧细胞成像实验，37℃下，先将臭氧与raw264.7细胞共孵育30分钟，再加探针mip-cl
2-o3共孵育30分钟；3.内源性臭氧细胞成像实验，先用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(pma)处理细胞30分钟，再加探针mip-cl
2-o3共孵育30分钟。结果显示，无论是外源添加臭氧还是通过pma刺激产生内源性臭氧氢，相较于对照组，荧光都出现了不同程度的增强。该实例证明探针mip-cl
2-o3有能力在细胞水平对内源/外源的臭氧成像。
[0061]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。