一种产1,3-丙二醇的基因工程菌

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种产1,3-丙二醇的基因工程菌，具体涉及一种产1,3-丙二醇的基因工程菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用。


背景技术：

2.1,3-丙二醇是一种重要的化学物质，已经被广泛应用于纺织品、树脂和药物等领域中，尤其是可以作为聚合物聚对苯二甲酸三甲酯(ptt)的合成单体。根据technavio(infiniti research ltd)出版的global 1,3-propanediol(pdo)market 2020-2024一书，全球1,3-丙二醇(pdo)市场在2020年～2024年，将以11％的年复合成长率增长，并达到2亿9242万美元的规模。
3.1,3-丙二醇的生产方法主要有化学合成法和生物合成法，化学合成法代表性工艺有丙烯醛法和环氧乙烷法，但是污染较为严重，副产物多，生物合成法通过微生物发酵生产，污染少，生物法合成1,3-pdo成为一种替代化学合成最具潜力的策略。
4.因此，目前需要研究开发一种转化率高，经济性好，易于工业化生产的1,3-pdo生物合成技术。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于为克服现有技术的不足提供一种1,3-丙二醇的基因工程菌，该菌为高产1,3-丙二醇的基因工程菌，利用该基因工程菌生产1,3-丙二醇，转化率高，经济性好，易于工业化生产。
6.为此，本发明提供了一种产1,3-丙二醇的基因工程菌，其合成1,3-丙二醇的途径如下：
7.(1)葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成草酰乙酸；
8.(2)草酰乙酸在天冬氨酸氨基转移酶的作用下生成l-天冬氨酸；
9.(3)l-天冬氨酸在天冬氨酸脱羧酶的催化作用下生成β-丙氨酸；
10.(4)β-丙氨酸在β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的催化作用下生成丙二酸半醛；
11.(5)丙二酸半醛在3-羟基酸脱氢酶的催化作用下生成3-羟基丙酸；
12.(6)3-羟基丙酸在3-羟基丙酰辅酶a合成酶的催化作用下生成3-羟基丙酰辅酶a；
13.(7)3-羟基丙酰辅酶a在醛脱氢酶的催化作用下生成3-羟基丙醛；
14.(8)3-羟基丙醛在醇脱氢酶的催化作用下生成1,3-丙二醇。
15.根据本发明，所述基因工程菌为包含编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand、编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua、经过密码子优化的编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg、经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup、编码醇脱氢酶的基因yqhd、经过密码子优化的经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456的重组宿主菌。
16.在本发明的一些实施例中，所述编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand来源于枯草芽孢杆菌168株(bacillus subtilis strain 168)，其序列如seq no.1所示。
17.在本发明的一些实施例中，所述编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua来源于铜绿假单胞菌pao1(pseudomonas aeruginosa pao1)，其序列如seq no.2所示。
18.在本发明的一些实施例中，所述编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg来源于大肠杆菌k12株(escherichia coli strain k12)，其序列如seq no.3所示。
19.在本发明的一些实施例中，所述编码醛脱氢酶的基因pdup来源于肠道沙门氏菌(salmonella enterica)，所述经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup的序列如seq no.4所示。
20.在本发明的一些实施例中，所述编码醇脱氢酶的基因yqhd来源于大肠杆菌k12株(escherichia coli strain k12)，其序列如seq no.5所示。
21.在本发明的一些实施例中，所述编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456来源于金属球菌dsm 5348(metallosphaera sedula dsm 5348)，所述经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456的序列如seq no.6所示。
22.根据本发明，所述宿主菌包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母、以及经过改造的细菌、真菌。
23.在本发明的一些优选的实施例中，所述宿主菌为大肠杆菌。
24.在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述宿主菌为大肠杆菌bw25113。
25.本发明还提供了一种如本发明上述的基因工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
26.根据本发明，所述应用包括将产1,3-丙二醇的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得1,3-丙二醇。
27.在本发明的一些实施例中，所述发酵培养条件为：发酵培养时间为72h，当菌体生长至od600＝0.6～0.8时，加入iptg，添加iptg后，发酵温度从37℃转为30℃，iptg诱导浓度为0.2mm；进一步优选地，体外添加天冬氨酸，且天冬氨酸添加量为2-10g/l，更进一步优选为5-10g/l。
28.在本发明的一些实施方式中，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括：
29.步骤s1，对发酵培养液进行第ⅰ次离心分离，获得第ⅰ上清液；
30.步骤s2，用乙腈将第ⅰ上清液稀释1000倍，混匀后，获得溶液a；取200μl溶液a加入10μl三氯乙酰异氰酸酯进行衍生化，混匀；向衍生化后的溶液中加入190μl超纯水，混匀，获得第ⅱ上清液；步骤s3，用0.22μm的有机相滤膜过滤第ⅱ上清液，获得1,3-丙二醇。
31.本发明人采用大肠杆菌为宿主细胞，通过导入编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand、编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua、编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg、经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup、编码醇脱氢酶的基因yqhd、经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456获得重组宿主菌。该菌为高产1,3-丙二醇的基因工程菌，利用该基因工程菌生产1,3-丙二醇，转化率高，经济性好，易于工业化生产。
附图说明
32.下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
33.图1示出生物合成1,3-丙二醇的反应机理；
34.图2为在250ml摇瓶内，菌株bw-pa-pby-pr-pym发酵生产1,3-丙二醇的产量图；
35.图3为在5l发酵罐内，菌株bw-pa-pby-pr-pym发酵生产1,3-丙二醇的产量图。
36.上述菌株bw-pa-pby-pr-pym携带两个质粒，其中一个为pacyc-pby质粒，该质粒包括来源于枯草芽孢杆菌168株(bacillus subtilis strain 168)的编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand、来源于铜绿假单胞菌pao1(pseudomonas aeruginosa pao1)的编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua、来源于大肠杆菌k12株(escherichia coli strain k12)的编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg；另一个为prsf-pym质粒，该质粒包括来源于肠道沙门氏菌(salmonella enterica)且经过密码子优化的密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup、来源于大肠杆菌k12株(escherichia coli strain k12)的编码醇脱氢酶的基因yqhd、来源于金属球菌dsm 5348(metallosphaera sedula dsm 5348)且经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456。
具体实施方式
37.为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
38.除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
[0039]ⅰ.术语
[0040]
本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，或者对其进行包括前体合成途径的强化和竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化的底盘微生物改造产生所需要的蛋白的细菌或真菌，如大肠杆菌等。基因工程的核心技术是dna的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为重组微生物。
[0041]
本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组dna分子，然后再将重组dna分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
[0042]ⅱ.实施方案
[0043]
为克服现有技术的不足，实现上述高效生物合成1,3-丙二醇的目标，本发明人对生物法合成1,3-丙二醇的工艺技术进行了大量的研究。本发明人发现采用大肠杆菌为宿主细胞，通过导入编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand、编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua、编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg、经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup、编码醇脱氢酶的基因yqhd、经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456，成功构建并获得一种高产1,3-丙二醇的基因工程菌，利用该基因工程菌生产1,3-丙二醇转化率高，经济性好，易于工业化生产。由此获得本发明。
[0044]
因此，本发明提供了一种1,3-丙二醇合成的新途径，其通过一种高产1,3-丙二醇的基因工程菌，实现以天冬氨酸为前体的1,3-丙二醇的高效合成。
[0045]
具体地，本发明中所述产1,3-丙二醇的基因工程菌合成1,3-丙二醇的途径如图1所示，其包括：
[0046]
(1)葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成草酰乙酸；
[0047]
(2)草酰乙酸在天冬氨酸氨基转移酶的作用下生成l-天冬氨酸；
[0048]
(3)l-天冬氨酸在天冬氨酸脱羧酶的催化作用下生成β-丙氨酸；
[0049]
(4)β-丙氨酸在β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的催化作用下生成丙二酸半醛；
[0050]
(5)丙二酸半醛在3-羟基酸脱氢酶的催化作用下生成3-羟基丙酸；
[0051]
(6)3-羟基丙酸在3-羟基丙酰辅酶a合成酶的催化作用下生成3-羟基丙酰辅酶a；
[0052]
(7)3-羟基丙酰辅酶a在醛脱氢酶的催化作用下生成3-羟基丙醛；
[0053]
(8)3-羟基丙醛在醇脱氢酶的催化作用下生成1,3-丙二醇。
[0054]
本领域技术人员应该了解的是，上述途径(1)中，葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成草酰乙酸，tca则可以做补充，使其生长。
[0055]
为实现上述技术方案，本发明提供了能够产1,3-丙二醇的宿主菌株，其在原始或改造过的细菌、真菌细胞中表达1,3-丙二醇合成路径中的基因，制备能够合成1,3-丙二醇的宿主。
[0056]
在本发明的实施方式中，本发明提供了一种产1,3-丙二醇的基因工程菌，其为表达了1,3-丙二醇合成路径中的基因的重组宿主菌。
[0057]
本发明中生物合成1,3-丙二醇的反应机理如图1所示，基于图1可以理解，所述1,3-丙二醇合成路径中的基因包括编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand、编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua、编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg、经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup、编码醇脱氢酶的基因yqhd、经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456。
[0058]
基于上述容易理解，本发明中所涉及的产1,3-丙二醇的基因工程菌为包含编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand、编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua、编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg、密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup、编码醇脱氢酶的基因yqhd、经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456的重组宿主菌。
[0059]
在本发明的一些具体实施例中，所述来源于枯草芽孢杆菌168株(bacillus subtilis strain 168)的编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand(genbank:cab14157.1)核苷酸序列如seq no.1所示。
[0060]
在本发明的一些具体实施例中，来源于铜绿假单胞菌pao1(pseudomonas aeruginosa pao1)的编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua(genbank:aag03522.1)核苷酸序列如seq no.2所示。
[0061]
在本发明的一些具体实施例中，来源于大肠杆菌k12株(escherichia coli strain k12)的编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg(genbank:baa15241.1)核苷酸序列如seq no.3所示。
[0062]
在本发明的一些具体实施例中，经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup，其序列如seq no.4所示；编码醛脱氢酶的基因pdup序列的genbank登录号为ebo5705941.1，其来源于肠道沙门氏菌(salmonella enterica)。
[0063]
在本发明的一些具体实施例中，来源于大肠杆菌k12株(escherichia coli strain k12)的编码醇脱氢酶的基因yqhd(genbank:bae77068.1)核苷酸序列如seq no.5所示。
[0064]
在本发明的一些具体实施例中，经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456，其序列如seq no.6所示；编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456序列的genbank登录号为abp95613.1，其来源于金属球菌dsm 5348(metallosphaera sedula dsm 5348)。
[0065]
在本发明的一些进一步优选的实施例中，通过在宿主菌中高效表达1,3-丙二醇合成途径中相关酶的基因，包括来源于枯草芽孢杆菌168株(bacillus subtilis strain 168)的编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand、来源于铜绿假单胞菌pao1(pseudomonas aeruginosa pao1)的编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua、来源于大肠杆菌k12株(escherichia coli strain k12)的编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg、来源于肠道沙门氏菌(salmonella enterica)且经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup、来源于大肠杆菌k12株(escherichia coli strain k12)的编码醇脱氢酶的基因yqhd、来源于金属球菌dsm 5348(metallosphaera sedula dsm 5348)且经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456，实现以天冬氨酸为前体的1,3-丙二醇合成。
[0066]
根据本发明，所述宿主菌包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母、以及经过改造的细菌、真菌；优选地，所述宿主菌为大肠杆菌；进一步优选地，所述宿主菌为大肠杆菌bw25113(北京华越洋生物科技有限公司)。
[0067]
本发明中对表达质粒的种类没有特殊要求，可根据宿主的选择进行相应的调整，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因和表达载体经过酶切处理后连接，之后不再赘述。
[0068]
在一些进一步优选的实施例中，大肠杆菌菌株trans10(北京全式金生物)用于载体构建，大肠杆菌bw25113(北京华越洋生物科技有限公司)则作为发酵用菌株。
[0069]
本发明的实施方式所涉及的产1,3-丙二醇的基因工程菌为能表达编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand、编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua、编码3-羟基酸脱氢酶的基因ydfg、密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup、编码醇脱氢酶的基因yqhd、经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456的大肠杆菌bw25113。
[0070]
在一些进一步优选例子中，利用基因pand、baua、ydfg、pdup(经过密码子优化)、yqhd、msed_1456(经过密码子优化)和质粒pacyc-ptac、prsf-ptac构建基因工程菌，用于构建重组质粒的相关引物如表1所示，相应的序列如seq no.7-22所示。
[0071]
表1构建重组质粒的相关引物
[0072]
1.6mg/l。
[0083]ⅲ、实施例
[0084]
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
[0085]
实施例1：
[0086]
本实施例中所用到的引物如前文中表1所示。
[0087]
委托华大基因对来源于枯草芽孢杆菌168株(bacillus subtilis strain 168)的编码天冬氨酸脱羧酶的基因pand(genbank:cab14157.1，核苷酸序列如seq no.1所示)，来源于铜绿假单胞菌pao1(pseudomonas aeruginosa pao1)的编码β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因baua(genbank:aag03522.1核苷酸序列如seq no.2所示)，来源于肠道沙门氏菌(salmonella enterica)且经过密码子优化的编码醛脱氢酶的基因pdup(genbank:ebo5705941.1核苷酸序列如seq no.4所示)，来源于金属球菌dsm 5348(metallosphaera sedula dsm 5348)且经过密码子优化的编码3-羟基丙酰辅酶a合成酶的基因msed_1456(genbank:abp95613.1核苷酸序列如seq no.6所示)进行全基因合成，分别获得携带有pand、baua、pdup、msed_1456基因的puc57质粒。分别利用pand-f/pand-r、baua-f/baua-r、ydfg-f/ydfg-r、pdup-f/pdup-r、yqhd-f/yqhd
–
r、msed_1456-f/msed_1456-r、pacyc-tac-f/pacyc-tac-r、prsf-tac-f/prsf-tac-r、作为引物，以puc57-pand、puc57-baua、bw25113基因组、puc57-pdup、bw25113基因组、puc57-msed_1456、pacyc-tac、prsf-tac作为模板，进行目的基因pand、baua、ydfg、pdup、yqhd、msed_1456和质粒片段pacyc-tac、prsf-tac的扩增。之后通过gibson连接的方法将pand、baua、ydfg、插入到pacyc-tac中，获得质粒pacyc-pby；将pdup、yqhd、msed_1456插入到prsf-tac中，获得质粒prsf-pym(见表2)。
[0088]
实施例2：
[0089]
制备大肠杆菌bw25113的感受态细胞，并分装100μl于1.5ml的离心管用于电转化。将构建好的pacyc-pby和prsf-pym重组质粒2-4μl加入到含有100μl感受态细胞的1.5ml离心管中，混合均匀。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，快速加入lb培养基[蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 5g/l]，并将混合物转移到1.5ml离心管中，37℃复苏1h。之后将菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃培养12h。制备成生产1,3-丙二醇的菌株bw-pa-pby-pr-pym(见表2)。
[0090]
表2质粒和菌株
[0091][0092]
实施例3：
[0093]
(1)产1,3-丙二醇基因工程菌株的摇瓶培养
[0094]
在生产1,3-丙二醇的菌株bw-pa-pby-pr-pym的平板上挑取单菌落，接到4ml的带有抗性的液体lb中，37℃下培养12h，之后将菌液按5％的接种量，转接至20ml发酵培养基中，需要时在培养基中添加对应浓度的天冬氨酸，当菌体生长至od600＝0.6～0.8时，加入终浓度0.2mm的iptg进行诱导，添加iptg后，发酵温度从37℃转为30℃，转速为200rpm，培养时间为72小时。
[0095]
(2)生物量测定
[0096]
取发酵液加入适量无菌蒸馏水稀释至od600位于0.2-0.8之间，取200μl稀释后的发酵液至于96孔板中，利用酶标仪(multiskan spectrum，thermo)在600nm波长下进行吸光度测定。
[0097]
(3)样品处理与检测
[0098]
对发酵培养液进行第ⅰ次离心分离，获得第ⅰ上清液；
[0099]
步骤s2，用乙腈将第ⅰ上清液稀释1000倍，混匀后，获得溶液a；取200μl溶液a加入10μl三氯乙酰异氰酸酯进行衍生化，混匀；向衍生化后的溶液中加入190μl超纯水，混匀，获得第ⅱ上清液；
[0100]
步骤s3，用0.22μm的有机相滤膜过滤第ⅱ上清液，获得1,3-丙二醇。
[0101]
将上述发酵液在4℃，12000rpm条件下离心10min。取100μl上清液加入乙腈900μl，稀释10倍，混匀后(获得溶液a)，而后取10μl溶液a)加入乙腈990μl，再稀释100倍。混匀后取200μl稀释溶液上清液加入10μl三氯乙酰异氰酸酯进行衍生化，混匀；向衍生化后的溶液中加入190μl超纯水，混匀，过0.22μm的有机相滤膜。之后利用液相色谱-质谱联用(qtrap 5500，ab sciex)进行定量检测。菌株bw-pa-pby-pr-pym的最终产量如图2和图3所示，其中，图2为在250ml摇瓶内，菌株bw-pa-pby-pr-pym发酵生产1,3-丙二醇的产量图；图3为在5l发酵罐内，菌株bw-pa-pby-pr-pym发酵生产1,3-丙二醇的产量图。试验结果表明，从头合成产量达到162mg/l，而5l发酵罐内产量为1002.5mg/l。
[0102]
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性
和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。