一种发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶的制备方法

1.本发明属于水凝胶技术领域，具体涉及一种发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.蚕丝是一种由丝素蛋白和丝胶蛋白组成的天然生物大分子,其中丝素蛋白约占蚕丝质量的70％，丝胶蛋白则约占总质量的25％。将丝胶蛋白与丝素蛋白分离的方法多种多样，如酶解、碱水解、酸水解、高温水解以及有机溶剂溶解法，其中，高温水解法最为简单。家蚕中的丝素蛋白(silk fibroin，sf)是一种三个亚单元即重链(h-chain)、轻链(l-chain)和糖蛋白p25组成。重链和轻链之间通过二硫键连接，然后再与糖蛋白p25通过疏水键等共价键作用结合。sf由多种氨基酸组成，主要氨基酸有甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，约占氨基酸组成的85％。sf具有良好的生物相容性、可生物降解性、高拉伸强度等特点，已被用于各种生物医学领域，包括伤口敷料、人造血管、细胞培养等。丝素蛋白纤维经不同溶解体系溶解获得再生丝素蛋白溶液，进而再生制备成微球、膜、纤维、凝胶、支架等形式并赋予再生材料特殊性能。可以通过调控丝素蛋白的二级结构从而有效控制丝素蛋白材料的各种性能，包括制备高强度，高取向材料等。
3.蚕丝经溶解制备成再生丝素蛋白基材料，可获得优异的电学、光学等性能，为其提供更广泛的应用空间。基于生物质绿色环保、且富含氮元素和碳元素的优点，以天然材料制备碳基纳米材料是一种发展趋势。蚕茧是一种来源广阔的生物质材料，丝素蛋白含氮量高达18％，是制备氮掺杂碳基纳米材料的理想前驱体。在此，我们采用一种简单而快速的微波辅助方法降解家蚕丝素蛋白，制备水中可分散的氮掺杂发光材料(fm)，而不需要任何添加剂。由丝素蛋白制备的发光纳米材料，具有生物相容性好，细胞毒性低和发光性能强的优点，有望用于生物医药领域。
4.水凝胶由于具有众多良好的特性,成为组织工程研究中一种优良的支架材料。丝素蛋白水凝胶由于独特的性质、多样化的成胶方式以及优异的可加工性成为了支架材料研究的热点，备受学者的青睐并涌现出了大量的研究成果。水凝胶具有三维交联网络结构，可以在水中迅速膨胀并能够保持大量的水分，同时还可以保持其结构。这种结构与生物组织的结构相似，水、营养、离子以及很多其他生物学相关的分子可以在这种多孔水凝胶基质中自由运输。作为一种柔性材料，水凝胶具有良好的可调节物理和化学性能，在涂层、粘合剂、组织工程、储能装置、药物输送、植入式电子设备等领域有着广泛的应用前景，近年来受到越来越多的关注。
5.聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，pva)是由聚醋酸乙烯酯(polyvinyl acetate,pvac)水解而成的半结晶聚合物。众所周知，pva水溶液可以通过反复冻融循环形成微晶转变为水凝胶，而不需要任何可能导致毒性的化学交联剂。pva溶液的冷冻过程中，在无定形区产生的冰诱导了聚合物微晶的生长，这些微晶充当pva链之间的物理交联点，从而产生水不溶性的水凝胶。在过去的几十年里，pva因其出色的生物相容性，低廉的价格和易于加工
的特性而在生物医学和制药方面的应用中作为组织工程的基质和控制药物输送的载体获得了广泛的关注。反复冻融循环方法简单，并且不需要添加任何可能有毒性的交联剂，但缺点是耗时，本文利用液氮处理以期望能够缩短水凝胶的制备时间。
6.综上所述，为了解决上述问题，因此迫切需要对丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶的制备工艺进行进一步深入研究。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶的制备方法。
8.本发明的技术方案具体如下：
9.1、一种发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)制备丝素蛋白溶液：将干净的家蚕蚕茧浸入超纯水中后，进行高温高压反应，得到固体丝素蛋白，洗涤，烘干，进行微波反应，得到丝素蛋白溶液。
11.(2)制备丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液：将聚乙烯醇加入到步骤(1)中制得的丝素蛋白溶液中，在加热条件下进行搅拌溶解，即可得到丝素蛋白/聚乙烯醇混合溶液；
12.(3)制备发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶：将步骤(2)中制备的丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液冷冻定型后，用液氮冷冻处理，再放入饱和硫酸钠溶液中浸泡，即可得到发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶。
13.优选的，步骤(1)中，所述高温高压的条件：温度为121℃，压强为0.17mpa，时间为10-15min。
14.优选的，步骤(1)中，所述微波反应的条件：温度为220℃，以500-1000rpm的搅拌速度反应1-2h。
15.优选的，步骤(1)中，所述家蚕蚕茧与超纯水的质量比为1:20-100，所述丝素蛋白溶液的浓度38-54mg/ml。
16.优选的，步骤(2)中，所述聚乙烯醇与丝素蛋白溶液的质量比为1:10-20，所述搅拌下进行加热反应的温度为60-100℃，时间为1-2h。
17.优选的，步骤(3)中，所述冷冻定型的条件：在-10-20℃预冷冻30-60min。
18.优选的，步骤(3)中，所述硫酸钠溶液的浓度为0.44g/ml。
19.优选的，步骤(3)中，所述丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液与饱和硫酸钠溶液的体积比为1:1。
20.优选的，步骤(3)中，液氮冷冻时间为6-15min。
21.本发明具有以下主要优点：
22.本发明提供了一种发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶的制备方法，该方法将丝素蛋白(sf)和聚乙烯醇(pva)复合，通过物理交联形成的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶，具有良好的拉伸性能和发光性能。首先，固体丝素蛋白在微波辅助作用下断链形成纳米颗粒，并暴露出大量的生色团，提高发光强度。而普通的丝素蛋白溶液大量的发光基团被亲水区包裹，无法显示出来，发光强度弱；其次丝素蛋白与聚乙烯醇复合后，通过液氮直接冷冻和无机盐溶液浸泡相结合的方法制备了具有发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶，与传统的冻融法相比，该方法具有简单高效的特点，采用饱和硫酸钠溶液浸泡水凝胶以
期望得到力学性能更好的水凝胶，并且所使用的离子仅作为凝胶触发剂和性质调节剂用于诱导聚合物链的聚集，离子可以被完全洗掉，而不留在聚合物网络中，从而保持了所制备水凝胶的生物相容性；然后该方法未添加辣根过氧化物酶和其他物质，相比于现有技术，避免了基体炎症的发生以及由于化学品残留而导致的应用局限性，大大加大了应用范围，打破了形成高拉伸率和模量的水凝胶的方法存在的局限性，解决了大多普通的水凝胶存在着强度低、溶胀性能低、稳定性不足等问题，使该水凝胶在生物医学领域存在巨大应用潜力。
23.本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
24.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
25.图1为实施例1中丝素蛋白发光拉伸水凝胶的制备流程图；
26.图2为实施例1中丝素蛋白(fm)、聚乙烯醇(pva)和丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶(pva/fm)的红外光谱图；
27.图3为实施例1中丝素蛋白(fm)和丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶(pva/fm)的紫外吸收光谱图和三维荧光光谱图，其中a为fm的三维荧光谱图，b为fm的紫外吸收光谱图，c为pva/fm的三维荧光谱图，d为pva/fm的紫外吸收光谱图；
28.图4为对比例和实施例1中方法制得丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶的应力-应变曲线，其中a为对比例中方法制得的丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶，b为实施例1中制得的丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶。
具体实施方式
29.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
30.实施例1
31.制备发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶，具体的制备流程如图1所示，包括如下步骤：
32.(1)制备丝素蛋白：将干净的家蚕蚕茧浸入超纯水中，在120℃和0.17mpa下进行脱胶10min，将脱胶后的固体丝用超纯水洗涤以除去表面残留的丝胶蛋白，在鼓风烘箱中干燥，即可得到固体丝素蛋白，家蚕蚕茧碎片的脱胶率为80％，其中家蚕蚕茧与超纯水的质量比为1:20；
33.(2)制备丝素蛋白溶液：将步骤(1)中制得的固体丝素蛋白，洗涤，烘干，加入去离
子水中，放入微波反应器中，在搅拌速度为500rpm，反应1h后，即可得到浓度为38mg/ml的丝素蛋白溶液；
34.(3)制备丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液：将聚乙烯醇加入到步骤(2)中制得的丝素蛋白溶液中，在60℃下，搅拌1h后，超声消去气泡，即可得到丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液，其中聚乙烯醇与丝素蛋白溶液的质量比为1:10；
35.(4)制备发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶：将步骤(3)中制得的丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液在-20℃冷冻定型25min后，用液氮冷冻处理6min，再放入浓度为0.44g/ml的饱和硫酸钠溶液中浸泡24小时，即可得到发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶，其中丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液与饱和硫酸钠溶液的体积比为1:1。
36.图2为实施例1中丝素蛋白(fm)、聚乙烯醇(pva)和丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶(pva/fm)的红外光谱图，由图2可知，峰值范围从3000cm-1
到3500cm-1
的峰对应于o-h或者n-h的伸缩振动峰；fm的红外光谱图在3300～2500cm-1
，中心约为3000cm-1
处出现了宽的强吸收峰，分别代表了fm中的羧基与羟基，并且在1656cm-1
处的次强峰，代表了fm中c＝o伸缩振动峰；pva的红外光谱图在3600～3000cm-1
处有宽的强吸收峰，并且在1085cm-1
处出现了强吸收峰，代表了pva中c-o的伸缩振动峰；pva/fm的红外光谱图在相应处出现了吸收峰，说明fm与pva已反应成功。
37.图3为实施例1中丝素蛋白(fm)和丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶(pva/fm)的紫外吸收光谱图和三维荧光光谱图，其中a为fm的三维荧光谱图，b为fm的紫外吸收光谱图，c为pva/fm的三维荧光谱图，d为pva/fm的紫外吸收光谱图，由图3可知，a为fm的三维荧光谱图，当激发波长由400nm逐渐增大到550nm时，荧光的发射波长从500nm增加至650nm，说明fm的发射波长由激发波长决定，而且fm的发射波长可以从500nm到650nm，范围比较大，然后从紫外吸收光谱图中得到最大的发射波长是在565nm左右。c为pva/fm的三维荧光谱图，当激发波长由350nm逐渐增大到550nm时，荧光的发射波长从400nm增加至700nm，然后从紫外吸收光谱图中得到最大的发射波长是在525nm。
38.实施例2
39.制备发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶，包括如下步骤：
40.(1)制备丝素蛋白：将干净的家蚕蚕茧碎片浸入超纯水中，在120℃和0.17mpa下进行脱胶12min，将脱胶后的固体丝用超纯水洗涤以除去表面残留的丝胶蛋白，在鼓风烘箱中干燥，即可得到固体丝素蛋白，家蚕蚕茧碎片的脱胶率为82％，其中家蚕蚕茧与超纯水的质量比为1:50；
41.(2)制备丝素蛋白溶液：将步骤(1)中制得的固体丝素蛋白，洗涤，烘干，加入去离子水中，放入微波反应器中，在搅拌速度为750rpm，反应1.5h后，即可得到浓度为46mg/ml的丝素蛋白溶液；
42.(3)制备丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液：将聚乙烯醇加入到步骤(2)中制得的丝素蛋白溶液中，在80℃下，搅拌1.5h后，超声消去气泡，即可得到丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液，其中聚乙烯醇与丝素蛋白溶液的质量比为1:15；
43.(4)制备发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶：将步骤(3)中制得的丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液在5℃冷冻定型45min后，用液氮冷冻处理10min，再放入浓度为0.44g/ml的饱和硫酸钠溶液中浸泡24小时，即可得到发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇
水凝胶，其中丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液与饱和硫酸钠溶液的体积比为1:1。
44.实施例3
45.制备发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶，包括如下步骤：
46.(1)制备丝素蛋白：将干净的家蚕蚕茧碎片浸入超纯水中，在120℃和0.17mpa下进行脱胶15min，将脱胶后的固体丝用超纯水洗涤以除去表面残留的丝胶蛋白，在鼓风烘箱中干燥，即可得到固体丝素蛋白，家蚕蚕茧碎片的脱胶率为85％，其中家蚕蚕茧与超纯水的质量比为1:100；
47.(2)制备丝素蛋白溶液：将步骤(1)中制得的固体丝素蛋白，洗涤，烘干，加入去离子水中，放入微波反应器中，在搅拌速度为1000rpm，反应2h后，即可得到浓度为54mg/ml的丝素蛋白溶液；
48.(3)制备丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液：将聚乙烯醇加入到步骤(2)中制得的丝素蛋白溶液中，在100℃下，搅拌2h后，超声消去气泡，即可得到丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液，其中聚乙烯醇与丝素蛋白溶液的质量比为1:20；
49.(4)制备发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶：将步骤(3)中制得的丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液在20℃冷冻定型60min后，用液氮冷冻处理15min，再放入浓度为0.44g/ml的饱和硫酸钠溶液中浸泡24小时，即可得到发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶，其中丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液与饱和硫酸钠溶液的体积比为1:1。
50.对比例
51.其他步骤与实施例1相同，不同之处在于步骤(4)中将步骤(3)中制得的丝素蛋白/聚乙烯醇的混合溶液在-20℃下冷冻12h，再融化2h，重复该操作三次，放入饱和硫酸钠溶液中浸泡24h，制得水凝胶。
52.图4为对比例和实施例1中方法制得丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶的应力-应变曲线，其中a为对比例中方法制得的丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶，b为实施例1中制得的丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶。由图4可知，经过冷却冻融法制备的丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶最大应力为0.23mpa，断裂伸长率为401.15％，而使用液氮单次冷冻后的丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶最大应力为0.17mpa，断裂伸长率为528.60％，说明经过液氮处理后的水凝胶强度略微降低，但可以获得更大的断裂伸长率。
53.由此可知，对比例中冻融循环方法制备的丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶耗费时间长，实施例1中液氮方法制备的丝素蛋白/聚乙烯醇的水凝胶断裂伸长率增大，且制备的时间比冻融循环方法更少，有利于工业化生产。
54.综上所述：本发明提供了一种发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶的制备方法，该方法将丝素蛋白(sf)和聚乙烯醇(pva)复合，通过物理交联形成的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶，具有良好的拉伸性能和发光性能。首先，固体丝素蛋白在微波辅助作用下断链形成纳米颗粒，并暴露出大量的生色团，提高发光强度。而普通的丝素蛋白溶液大量的发光基团被亲水区包裹，无法显示出来，发光强度弱；其次丝素蛋白与聚乙烯醇复合后，通过液氮直接冷冻和无机盐溶液浸泡相结合的方法制备了具有发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶，与传统的冻融法相比，该方法具有简单高效的特点，采用饱和硫酸钠溶液浸泡水凝胶以期望得到力学性能更好的水凝胶，并且所使用的离子仅作为凝胶触发剂和性质调节剂用于诱导聚合物链的聚集，离子可以被完全洗掉，而不留在聚合物网络中，从而保持了所
制备水凝胶的生物相容性；然后该方法未添加辣根过氧化物酶和其他物质，相比于现有技术，避免了基体炎症的发生以及由于化学品残留而导致的应用局限性，大大加大了应用范围，打破了形成高拉伸率和模量的水凝胶的方法存在的局限性，解决了大多普通的水凝胶存在着强度低、溶胀性能低、稳定性不足等问题，使该水凝胶在生物医学领域存在巨大应用潜力。
55.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。