通过特异性敲除或敲低Tyk2促进心肌细胞重编程的制作方法

通过特异性敲除或敲低tyk2促进心肌细胞重编程
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明涉及一种通过特异性敲除或敲低tyk2促进心肌细胞重编程的方法。
2.发明背景
3.全世界2300万人患有心力衰竭，通常由心肌细胞损伤或心肌细胞功能障碍引起。心肌细胞丢失的一个常见原因是导致心肌梗死的缺血性心脏病，由于心脏再生能力有限，损伤是永久性和渐进性的。尽管在医学治疗方面取得了进展，但目前除了原位心脏移植外，还没有恢复肌肉质量的策略，而原位心脏移植受限于细胞来源数量和长期疗效。迄今为止，在人体试验中使用的细胞疗法已经证明移植的细胞不会大量变成心肌细胞，也不会在心脏中持续存在。多能干细胞来源的心肌细胞移植正在接受测试，如果在细胞存活、成熟和电生理整合等问题得到有效解决后，这可能是有价值的。利用细胞类型特异的转录因子(tf)将细胞原位重编程为在疾病中丢失的细胞类型，是一种很有希望的除细胞治疗以外的另一有效的组织再生方法。在心脏中，大量的非心肌细胞，主要是心脏成纤维细胞，可以通过转录因子转变为诱导的心肌细胞样细胞。
4.自第一代通过3种心脏特异性tf：gata4、mef2c和tbx5(gmt)的心肌细胞重编程成功问世以来，已经有很多关于增强心脏重编程效率的报道。通过改变gmt三个基因的计量学，在gmt基础上鉴定额外的基因，或者通过操纵信号通路，体外产生的心肌细胞样细胞的质量和效率都可以得到改善。在大多数情况下，效率的提高主要是在小鼠胚胎成纤维细胞中发现的；相反，对心脏成纤维细胞以及成体皮肤为起始的重编程却效果有限。尽管最近sirna介导的bmi1基因敲除，以及通过sb431542联合xav939的策略提高了体外心脏成纤维细胞重编程的效率，但仍有待于确定是否存在能进一步增强小鼠重编程或影响人心脏成纤维细胞重编程的方法。
5.因此，本领域仍然需要新的重编程方法，其能够通过重编程高效地产生功能性心肌细胞，从而治疗心脏疾病例如心力衰竭。
6.附图简述
7.图1.小分子化合物sb43152(c1)和baricitinib(c2)的组合(2c)可以显著提高转录因子组合gmt(gata4、mef2c和tbx5)介导的心肌细胞重编程效率，并且可在gata4不存在下实现高效心肌细胞重编程。
8.图2.测试敲低tyk2对心肌细胞重编程的影响的示意图。a：实验设计图，以新生鼠成纤维细胞为起始细胞，在感染转录因子mt组合和shrna的情况下，仅在重编程培养基(加入c1)的条件下重编程为心肌细胞。b：重编程具体实验步骤。c：tyk2的敲低效果。
9.图3.示出在mt+sb的情况下，通过敲低tyk2从成纤维细胞诱导出大量心脏特异性标志物ctni和a-actinin阳性细胞。
10.图4.示出qpcr检测重编程的细胞心脏特异性标志物的表达水平。
11.图5.示出通过crispr敲除tyk2可以促进转录因子mt以及小分子化合物c1诱导的心肌细胞重编程。
12.发明详述
13.本发明人发现通过敲低或敲除tyk2可以促进转录因子和小分子化合物诱导的心肌细胞重编程。
14.因此，在一方面，本发明提供一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括特异性敲低或敲除起始细胞中tyk2的表达。
15.如本文所用，所述“敲低或敲除”指的是使内源tyk2的转录水平或翻译水平上的表达消除或降低，或者指导致内源tyk2蛋白中的突变而造成其活性的消除或降低。
16.本领域已知多种敲除或敲低基因表达的方法，这些都可以应用于本发明。在一些实施方案中，通过向所述起始细胞导入特异性靶向tyk2的shrna、反义rna或sirna来敲低tyk2的表达。
17.在一些实施方案中，向所述起始细胞导入特异性靶向tyk2的shrna或包含编码所述特异性靶向tyk2的shrna的表达载体。在一些具体实施方案中，所述特异性靶向tyk2的shrna的编码序列包含选自seq id no:1-3的序列。
18.在一些实施方案中，向所述起始细胞导入特异性靶向tyk2的基因编辑系统。在一些实施方案中，所述特异性靶向tyk2的基因编辑系统敲低tyk2的表达。在一些实施方案中所述特异性靶向tyk2的基因编辑系统敲除tyk2的表达。在一些实施方案中所述特异性靶向tyk2的基因编辑系统导致内源tyk2的突变，从而减少或消除tyk2的活性。在一些实施方案中，所述基因编辑系统是大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或crispr系统。
19.在本发明方法优选的实施方案中，所述基因编辑系统是crispr系统。在一些实施方式中，crispr系统使用的核酸酶例如可以选自cas3、cas8a、cas5、cas8b、cas8c、cas10d、cse1、cse2、csy1、csy2、csy3、gsu0054、cas10、csm2、cmr5、cas10、csx11、csx10、csf1、cas9、csn2、cas4、cpf1、c2c1、c2c3或c2c2蛋白。在一些具体实施方式中，所述crispr系统是crispr/cas9系统。
20.将shrna、反义rna或sirna或者基因编辑系统引入细胞的方法是本领域已知的。所述shrna、反义rna或sirna或者基因编辑系统组分可以直接导入细胞。但是，也可以将编码所述shrna、反义rna或sirna或者基因编辑系统组分的表达载体导入细胞。
21.在一些实施方案中，所述方法还进一步包括使起始细胞与小分子化合物sb43152接触。
22.在一些实施方案中，所述起始细胞为分化的细胞。在一些实施方案中，起始细胞是非心肌细胞。起始细胞可以为中胚层来源细胞诸如心脏细胞，外胚层来源细胞诸如神经细胞，或者内胚层来源细胞如结肠细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞或体内几乎任何细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为皮肤成纤维细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为心脏成纤维细胞。
23.在一些实施方案中，所述起始细胞为分离的细胞(离体细胞)。
24.在本发明中，所述起始细胞可以来源于哺乳动物或非哺乳动物。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞来源于人。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞来源于非
人哺乳动物。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞来源于鼠如小鼠或大鼠或非人灵长类动物。
25.在一些实施方案中，所述重编程获得的心肌细胞是功能性心肌细胞。所述功能性心肌细胞例如具有以下特征中的一或多种：α-actinin阳性、ctnt阳性、具有排列整齐的肌节结构、跳动(beating)、表达心室型心肌细胞标志物例如myl2v、自发的钙瞬变、与心室型心肌细胞相似的动作电位等。
26.在一些实施方案中，所述方法还包括向起始细胞提供至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microrna。
27.如本文所用，“心肌细胞诱导转录因子”是指在导入起始细胞后能够在合适条件下导致起始细胞重编程为心肌细胞的转录因子。本领域已知许多的可用于通过重编程产生心肌细胞的转录因子，包括但不限于：mef2c、tbx5、gata4、mesp1、myocd、hand2、srf、esrrg、zfpm2、nkx2.5、vegf、baf60c，及它们的任意组合。
28.在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子至少包括mef2c。
29.在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子还包括tbx5。例如所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括mef2c和tbx5，或由其组成。
30.在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子还包括gata4。例如所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括mef2c、tbx5和gata4，或由其组成。
31.在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子还包括myocd。例如所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括mef2c、tbx5、gata4和myocd，或由其组成。
32.在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子还包括mesp1。例如所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括mef2c、tbx5、gata4、myocd和mesp1，或由其组成。
33.在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括mef2c、gata4、myocd和mesp1，或由其组成。
34.如本文所用，“心肌细胞诱导microrna”是指在导入起始细胞后能够在合适条件下导致起始细胞重编程为心肌细胞的microrna。本领域已知多种可用于通过重编程产生心肌细胞的microrna，包括但不限于：mir1、mir133、mir208和mir499，及它们的任意组合。在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导microrna包括mir1、mir133，或由其组成。在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导microrna包括mir1、mir133、mir208和mir499，或由其组成。
35.所述至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microrna可以通过本领域已知的任何方法提供给所述起始细胞，即导入所述起始细胞。例如，可以将包含编码所述转录因子和/或microrna的核苷酸序列的表达载体导入所述起始细胞。
36.将表达载体导入细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于deae-葡聚糖法、磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物、biolistic颗粒传递法(基因枪粒子轰击法)、显微注射法、电穿孔法和病毒介导法。其中优选地所述表达载体是病毒表达载体，其可以通过病毒转染实现编码所述shrna、反义rna、sirna、基因编辑系统、转录因子和/或microrna的核苷酸序列的导入。所述病毒载体优选为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等。构建包含所需核苷酸序列的病毒载体例如慢病毒载体的方法是本领域已知的。
37.在本发明的方法的一些实施方案中，所述“向起始细胞提供至少一种心肌细胞诱
导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microrna”的步骤可以在“特异性敲低或敲除起始细胞中tyk2的表达”的步骤之前或之后或同时进行，优选在同时进行。
38.在本发明的方法的一些实施方案中，所述“向起始细胞提供至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microrna”的步骤以及“特异性敲低或敲除起始细胞中tyk2的表达”的步骤在“使起始细胞与小分子化合物sb43152接触”的步骤之前进行。
39.例如，所述“向起始细胞提供至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microrna”的步骤以及“特异性敲低或敲除起始细胞中tyk2的表达”的步骤同时进行，且在在“使起始细胞与小分子化合物sb43152接触”的步骤之前1天进行。
40.在一方面，本发明提供一种通过本发明的方法制备的心肌细胞。
41.在一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含通过本发明的方法制备的心肌细胞和药学上可接受的载体。
42.在一方面，本发明还提供通过本发明的方法制备的心肌细胞或本发明的包含通过本发明的方法制备的心肌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物在制备用于治疗心脏疾病的药物中的用途。所述心脏疾病特别是心肌疾病，包括但不限于心力衰竭、心肌梗死等。
43.在一方面，本发明还提供一种在对象中治疗心脏疾病的方法，所述方法包括给所述对象施用通过本发明的方法制备的心肌细胞或本发明的包含通过本发明的方法制备的心肌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
44.如本文所用，“对象”可以是哺乳动物或非哺乳动物。所述对象可以是人，或非人哺乳动物例如小鼠或大鼠或非人灵长类动物。
45.在一方面，本发明提供一种用于将起始细胞重编程为心肌细胞的试剂盒，所述试剂盒包含本文所定义的特异性靶向tyk2的shrna、反义rna或sirna，或特异性靶向tyk2的基因编辑系统，或编码它们的表达载体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含小分子化合物sb43152。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含本文所定义的至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microrna，或者包含编码所述转录因子和/或microrna的核苷酸序列的表达载体。
实施例
46.实验材料
47.本技术实施例中使用的小鼠、细胞和质粒如下表1和2所示。
48.表1：实验材料及来源
[0049][0050]
表1：质粒名称及来源
[0051][0052]
实验方法
[0053]
乳鼠心脏成纤维细胞的获得与培养
[0054]
用弯剪刀剖开乳鼠胸腔，取出心脏，放入装有imdm培养基的6孔板中，将清洗后的心脏组织块转移至无菌的10cm培养皿中，用手术剪剪碎，加入type ii collagenase(1mg/ml)，水浴(37℃)消化，收集消化液，离心，弃上清，加入红细胞裂解液，收集细胞悬液。悬液均分入10cm培养皿中，放入原代恒温培养箱中。待其长满10cm培养皿进行磁分选。分选后的细胞铺于24孔板中。
[0055]
慢病毒制备和感染
[0056]
待293t细胞密度长致为60％-70％时，转染包装质粒和目的质粒，12h后换液，48h后收集病毒上清，并加入1000x polybreen和等体积培养基感染目的细胞，24h后完成感染。
[0057]
载体构建
[0058]
合成sgrna和shrna引物，之后pcr仪退火形成双链，连接入lenticrisprv2和plko.1载体中，所用引物如下表3所示：
[0059]
表1：引物列表
[0060][0061]
qpcr
[0062]
根据magen试剂盒的指示，提取细胞总的rna，real-time pcr使用sybr green master作为染料，其中gapdh作为对照，使用2c-δδt的方法计算差异倍数，所用引物如下表4所示：
[0063]
表4：引物列表
[0064][0065]
实施例1、通过shrna敲低tyk2影响心肌细胞重编程
[0066]
本发明人之前已经筛选发现小分子baricitinib(c2)和sb43152(c1)的组合(2c)可以显著提高转录因子组合gmt(gata4、mef2c和tbx5)介导的心肌细胞重编程效率，并且该小分子组合还可以在不降低重编程效率和质量的前提下，减少重编程所需外源转录因子的数量，即在该小分子组合存在下，使用转录因子组合mt(mef2c和tbx5)即可实现高效的心肌细胞重编程。见图1。
[0067]
本发明人现令人惊奇地发现，敲低细胞内tyk2的表达，可以代替c2的作用。本实施例的实验设计如图2所示。简言之，通过设计5种靶向tyk2基因的shrna(shtyk2#1、shtyk2#2、shtyk2#3、shtyk2#4、shtyk2#5)，和转录因子组合mt一起导入新生小鼠成纤维细胞，然后在包含c1的重编程培养基中进行诱导，测试其重编程为心肌样细胞的效率。图2c显示五种shrna均能敲低tyk2的表达。
[0068]
心脏特异性标志物ctni和a-actinin的免疫荧光检测显示，shtyk2#1、shtyk2#2、shtyk2#3这三种shrna分别和转录因子mt以及c1组合，可以实现与小分子组合2c类似的心肌细胞重编程效率。shnt为非靶向对照。结果示于图3。此外，qpcr也证实心脏特异性标志物在mt+c1且敲低tyk2情况下表达显著提高。
[0069]
能够敲低tyk2并提高心肌重编程效率的tyk2特异性shrna的序列如下：
[0070]
shtyk2#1：
[0071]
cccatcttcattagctgggaactcgagttcccagctaatgaagatggg(seq id no:1)；
[0072]
shtyk2#2：
[0073]
cccttcatcaagctaagtgatctcgagatcacttagcttgatgaaggg(seq id no:2)；
[0074]
shtyk2#3：
[0075]
ccactttaagaatgagagcttctcgagaagctctcattcttaaagtgg(seq id no:3)。
[0076]
本实施例证实，特异性敲低tyk2可以促进心肌细胞重编程。
[0077]
实施例2、通过基因编辑敲除tyk2影响心肌细胞重编程
[0078]
为了进一步证实特异性抑制tyk2在心肌细胞重编程中的作用，本发明人进一步设计了5种不同的靶向tyk2基因的sgrna，利用crispr技术敲除新生小鼠成纤维细胞的tyk2基因，并分别测试在转录因子mt以及c1存在下的心肌细胞重编程效率。sgnt为非靶向tyk2的对照。
[0079]
实验结果见图5，心脏特异性标志物ctni和a-actinin的免疫荧光检测显示，敲除了tyk2基因的成纤维细胞，在转录因子mt以及小分子化合物c1存在下，能实现高效的心肌细胞重编程。
[0080]
本发明上述结果证明特异性敲除或敲低tyk2的能够显著促进心肌细胞重编程。