一种分泌tbhq单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
1.本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种分泌tbhq单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术：2.tbhq是抗氧化效果较好的新合成的抗氧化剂，尤为适用于植物油抗氧化，可使食用油制品的抗氧化稳定性提高3-5倍。然而研究发现长期食用含有过量合成抗氧化剂的食品会对人体产生不利影响，因而几乎所有国家都对加工食品中合成抗氧化剂的添加有严格的限制，如：我国gb 2760-2014中规定合成抗氧化剂添加量不超过0.1g/kg或0.2g/kg。因此，有必要建立快速、高效的食品中tbhq的检测方法。
3.tbhq含量分析方法有气质联用(gc-ms)、高效液相色谱法(hplc)、液质联用(lc-ms)等仪器方法，如张凤妹等(基于低共熔溶剂的液相微萃取-高效液相色谱法测定大豆油中的tbhq[j].河南工业大学学报(自然科学版),2017,38(5):32-36.doi:10.3969/j.issn.1673-2383.2017.05.007.)利用乙腈直接提取油脂中的特丁基对苯二酚(tbhq)，再利用气相色谱法进行分析测定，结果表明tbhq的最低检出限为5mg/kg，相对标准偏差为2.5％～3.2％，线性范围为1～200μg/ml，线性相关系数均大于0.999；张康迪等通过基于低共熔溶剂的液相微萃取-高效液相色谱法测定大豆油中的tbhq，发现氯化胆碱/乙二醇在物质的量比为1：2时组成的低共熔溶剂对大豆油中的tbhq具有较高的萃取率，最佳萃取条件为：低共熔溶剂用量400μl，油用量0.15g，萃取温度50℃，萃取时间30min，正己烷用量2ml，检测限为0.02μg/ml；熊巍林等(固相萃取-高效液相色谱法测定植物油中的tbhq含量[j].中国油脂,2017,42(10):143-145.doi:10.3969/j.issn.1003-7969.2017.10.031.)建立了植物油中tbhq的中性氧化铝固相萃取-高效液相色谱分析法，分别用tbhq标准溶液10、25μg/ml和50μg/ml进行加标回收率和精密度试验，结果显示加标回收率在100.0％～103.0％之间，rsd为2.0％～6.0％；专利cn202011529362.1公开了一种表面增强拉曼光谱检测tbhq的方法，专利cn201811039067.0公开了一种生物柴油中tbhq的测定方法，专利cn200910064791.3公开了一种食用油脂中tbhq的快速检测方法，但以上检测方法均具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，且检测限仅为毫克或微克级别，因此建立快速简便的tbhq检测方法具有重要意义。酶联免疫法(elisa)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为tbhq检测提供了一种新的检测途径。
技术实现要素：[0004]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种分泌tbhq单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并应用该菌株及其产生的单克隆抗体进行tbhq的检测。
[0005]
本发明的第一个目的是提供一种分泌tbhq单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为单克隆细胞株，于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.45016。
[0006]
进一步地，上述杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0007]
s1：将tbhq免疫原制备成弗氏佐剂，后将弗氏佐剂注射入免疫动物体内；首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂，冲刺免疫采用tbhq免疫原；
[0008]
其中，tbhq免疫原由tbhq半抗原制备得到，tbhq半抗原的结构如式i所示；
[0009]
s2：对经过上述免疫过程的免疫动物进行采血，检测免疫动物的血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中tbhq抗体含量高的免疫动物；
[0010]
s3：将步骤s2筛选出的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合并进行培养，检测阳性细胞孔并测定阳性细胞孔的抑制效果，对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行亚克隆，得到分泌tbhq单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0011][0012]
进一步地，tbhq免疫原由tbhq半抗原活化后与牛血清蛋白偶联得到。具体地，
[0013]
将tbhq半抗原溶解在dmf中，加入edc、nhs，在20-30℃下搅拌5-8h，得到反应液a；将bsa溶解于硼酸盐缓冲液中，得到溶液b；将反应液a加入到溶液b中，反应5-10h，即得偶联物tbhq-cooh-bsa混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原tbhq-cooh-bsa。
[0014]
进一步地，tbhq半抗原的制备方法包括以下步骤：
[0015]
将3-叔丁基-4-羟基苯甲酸、甘氨酸叔丁酯、碳二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解在dmf中，混合液用ch2cl2稀释，盐水洗涤，na2so4干燥。将有机层去除，所得残渣经硅胶柱(ch2cl2:甲醇＝20:1)层析纯化，将得到的化合物溶解于ch2cl2和三氟乙酸中，得到tbhq半抗原tbhq-cooh。
[0016]
进一步地，使用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)活化tbhq半抗原。
[0017]
进一步地，首次免疫与第一次加强免疫之间间隔28-30天，加强免疫之间间隔20-22天，最后一次加强免疫与冲刺免疫之间间隔18-21天。
[0018]
进一步地，在步骤s1中，弗氏佐剂通过背部皮下注射入免疫动物体内。
[0019]
进一步地，在步骤s3中，融合的细胞在hat培养基上进行培养。
[0020]
本发明的第二个目的是提供一种tbhq单克隆抗体，由保藏编号为cgmcc no.45016的杂交瘤细胞株分泌得到。
[0021]
进一步地，向免疫动物腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为cgmcc no.45016的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，得到上述tbhq单克隆抗体。
[0022]
本发明的第三个目的是提供上述杂交瘤细胞株或tbhq单克隆抗体在检测tbhq中的应用，应用于食品(尤其是油制品)安全检测中tbhq残留的分析检测。
[0023]
一种包括上述杂交瘤细胞株和/或tbhq单克隆抗体的tbhq检测试剂盒。
[0024]
进一步地，tbhq检测试剂盒中还包括tbhq包被原，tbhq包被原由tbhq半抗原活化
后与鸡卵白蛋白偶联得到。
[0025]
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0026]
本发明提供的tbhq单克隆抗体杂交瘤细胞株可以高效且稳定地分泌tbhq单克隆抗体，对tbhq具有较好的特异性(对tbhq类似物交叉率小于10％)和检测灵敏度(ic
50
值为1.37ng/ml)，为检测油制品和其他含有tbhq的食品中tbhq含量提供了免疫学方法。本发明提供的tbhq单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测tbhq的试剂盒，具有实际应用价值。
[0027]
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
[0028]
生物材料保藏
[0029]
单克隆细胞株，所述单克隆细胞株已于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45016，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
[0030]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
[0031]
图1为本发明的tbhq单克隆抗体对tbhq的抑制标准曲线。
具体实施方式
[0032]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0033]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0034]
rpmi-1640培养基(mg/l)：l-精氨酸290、l-门冬酰胺50、l-门冬氨酸20、l-胱氨酸二盐酸盐65.15、l-谷氨酸20、甘氨酸10、l-组氨酸15、l-羟脯氨酸20、l-异亮氨酸50、l-亮氨酸50、l-赖氨酸盐酸盐40、l-甲硫氨酸15、l-苯丙氨酸15、l-脯氨酸20、l-丝氨酸30、l-苏氨酸20、l-色氨酸5、l-酪氨酸23.19、l-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、l-谷氨酰胺300、生物素0.2、d-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素b12 0.005、碳酸氢钠2000。
[0035]
下述实施例中涉及的试剂如下：
[0036]
碳酸盐缓冲液(cbs)：称取na2co
3 1.59g，nahco
3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；
[0037]
磷酸盐缓冲液(pbs)：8.00g nacl，0.2g kcl，0.2g kh2po4，2.9g na2hpo4·
12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
[0038]
pbst：含0.05％吐温20的pbs；
[0039]
抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；
[0040]
tmb显色液：a液：na2hpo
4.
12h2o 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mg tmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1：5混合即为tmb显色液，现用现混。
[0041]
下述实施例中涉及的检测方法如下：
[0042]
tbhq抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-elisa中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(cbs)将抗原稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/ml，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/ml。选择最佳工作点后，将tbhq标准品稀释0，0.04，0.12，0.37，1.11,3.33，10和30ng/ml等浓度，按照ic-elisa操作步骤，最后用originpro 8.5做图(结果如图1所示)，获得tbhq标准抑制曲线，计算ic
50
。
[0043]
实施例1 tbhq半抗原的合成
[0044]
将160mg化合物1 3-叔丁基-4-羟基苯甲酸，200mg化合物2甘氨酸叔丁酯，65mg碳二亚胺和36mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解在8ml n,n-二甲基甲酰胺溶解中。混合液用10ml ch2cl2稀释，5ml盐水洗涤，na2so4干燥。再将溶剂中的有机层除去，所得残渣经硅胶柱(ch2cl2:甲醇＝20:1)层析纯化，得到化合物3。将化合物3溶解于3ml ch2cl2和1ml三氟乙酸中，混合物在室温下搅拌过夜。最后，将溶液浓缩得到化合物4tbhq-cooh。半抗原合成路线如下：
[0045][0046]
实施例2 tbhq免疫原的合成
[0047]
称取5.50mg的半抗原将其溶解在800μl dmf中，然后加入9.08mg edc，5.12mg nhs，该混合物在室温搅拌6h，得到反应液a；称取10mg bsa，溶解于0.1m硼酸盐缓冲液中，得到溶液b；随后，逐滴将反应液a液加入到溶液b液中，室温反应8h，即得偶联物tbhq-cooh-bsa混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原tbhq-cooh-bsa。
[0048]
实施例3 tbhq包被原的合成
[0049]
称取1.92mg tbhq半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐4.54mg，n-羟基琥珀酰亚胺2.35mg，用600μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，得到a1液，室温搅拌反应6h。称取10mg鸡卵清白蛋白ova，溶解于2ml 0.1m硼酸盐缓冲溶液中，得到b1溶液，在室温条件下，逐滴将a1液加入到b1液中，室温反应8h，即得偶联物tbhq-cooh-ova混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测，并不直接用于小鼠，是制备单抗必需的。
[0050]
实施例4分泌tbhq单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
[0051]
1、动物免疫：选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取tbhq完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5ul+995ul抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-elisa测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
[0052]
2、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规peg(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
[0053]
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞
悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
[0054]
b、收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10％fbs(胎牛血清)rpmi-1640培养基在5％co2培养箱中。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1～4
×
107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
[0055]
c、融合过程7min。第1min，将1ml的peg 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1ml rpmi-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2ml rpmi-1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50
×
hat的rpmi-1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
[0056]
3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100
×
ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用tbhq为标准品，用ic-elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对tbhq标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得tbhq单克隆抗体细胞株。
[0057]
实施例5 tbhq单克隆抗体的制备与鉴定
[0058]
取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01m pbs溶液(ph 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
[0059]
使用间接竞争elisa，测得tbhq单克隆抗体的ic
50
值为1.37ng/ml、对tbhq类似物交叉率小于10％，说明对tbhq有很好的灵敏度和特异性，可用于tbhq免疫分析检测。其中，交叉率＝(tbhq的ic
50
/类似物的ic
50
)
×
100％)，tbhq类似物的ic
50
值见下表。
[0060]
表1 tbhq类似物的ic
50
值
[0061][0062]
实施例6 tbhq单克隆抗体的应用
[0063]
将实施例5制备的单克隆抗体应用于tbhq的elisa添加回收试验，具体步骤如下：
[0064]
(1)包被：将包被原tbhq-ova用0.05m ph9.6碳酸盐缓冲液从1μg/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2h。
[0065]
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.
[0066]
(3)封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
[0067]
(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min。
[0068]
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min.
[0069]
(6)终止和测定：每孔加入50μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。
[0070]
tbhq单克隆抗体对tbhq的抑制标准曲线如图1所示，可见用ic-elisa测定tbhq单克隆抗体的ic
50
值为1.37ng/ml，说明该抗体对tbhq有较好的灵敏度，可用于tbhq的免疫分析检测。
[0071]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。