一种用于实时检测KofuDNA高保真聚合酶酶活的组合物及检测方法与流程

一种用于实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活的组合物及检测方法
技术领域
1.本发明涉及dna聚合酶技术领域，具体为kofu dna高保真聚合酶的酶活检测方法。


背景技术：

2.分子酶和工具酶产品广泛用于普通pcr，qpcr、逆转录rt-pcr、rt-qpcr、荧光定量pcr、ngs等常见的分子生物学实验，所有的产品需经过严格的qc测试和应用验证，产品质量稳定可靠。
3.对于分子酶和工具酶，我们最关注的就是它的活性。在实验中，当我们做酶实验时，只有知道自己在做的酶是有活性对的，我们后续的工作才有可能继续。在实验室购买的特定的酶时，我们关注的不是购买的重量，而是购买的酶活性有多少，能催化多少摩尔的化学反应。掌握酶催化的活性也有利于我们估计反应需要进行的时间。甚至在我们改造酶结构的时候，也许要一个标准证明我们的改造是有效的。这一切，都需要我们能够测定酶的活性。
4.kofu dna polymerase是一种通过基因改造的工程酶，向较于一般的dna聚合酶对dna有更高的亲附性，与野生型b-家族dna聚合酶相比，kofu dna polymerase在扩增速度、产物产量及灵敏度上，都有更好的表现。另外，该酶对复杂模板(如长片段、高gc和高at模板)的扩增效果较野生型更好。需要的反应时间也较野生型b-家族dna聚合酶更短。
5.kofu dna polymerase能显著的提高dna的持续合成能力，有效的提高pcr产物。kofu dna polymerase具有优良5
’‑3’
聚合酶活性和3
’‑5’
外切酶活性(较读活性)，但不具备5
’‑3’
核酸外切酶活性。3
’‑5’
外切酶活性增强了kofu dna polymerase的保真度。其保真度是野生型taq dna聚合酶的100倍，是其他b-家族dna聚合酶保真度的10倍。kofu dna polymerase的扩增产物可以直接用于下游的分析和应用，例如酶切实验、克隆实验和测序实验等。
6.kofu dna polymerase的扩增产物是平末端，如果进行ta克隆，需要在3’端加da。其优异生物外切酶活性能有效的降低错配的发生概率保证了扩增的准确性，具有很高的保真性，是普通taq酶的100倍；kofu dna polymerase具有较普通dna聚合酶更快的合成速度，广泛的适用于含高gc、高at在内各种底物模板进行长片段高效，高保真的扩增。
7.目前还没用统一的酶活测定方法，导致各个生产企业只能依据公司内部企业标准来定义酶活，导致下游ivd原料筛选时，对于不同公司的酶活之间没有可比性。基于目前的现状，酶活测定方法研发就迫在眉睫。


技术实现要素：

8.基于上述情况，我们公开了一种实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活的方法，解决上述技术问题。
9.本发明旨在通过生物信息学和基于定向进化理论对酶活中心进行分析，根据各自
的酶活检测定义，建立绝对定量测活和相对定量测活2种理想测活的模型，精确定量分子酶和工具酶的酶活，实验方法偏差＜10％。
10.本发明基于双链dna结合染料能特异嵌入双链dna发出荧光的原理，开发了一种实时监测dna聚合酶活性的简便方法。在检测过程中，聚合酶的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光强度的变化时检测聚合酶的活性及药物对聚合酶活性的影响，该方法不需要对dna进行放射性同位素标记和荧光标记，也不需要聚丙烯酰胺电泳和聚合酶链式反应，是一种简便、快速的聚合酶活性实时监测新方法，为研究抗体肿瘤药物对聚合酶活性的影响提供了一种简捷方法，也将为相关疾病诊治和药物筛选提供一种新的思路。
11.通过等温延伸的方式，来精准的测定kofu dna聚合酶的酶活。kofu dna polymeras酶活活性定义：用活性化的大马哈鱼精子dna作为模板/引物，在74℃，30分钟内，摄入10nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位(u)。
12.本发明旨在基于引物延伸反应和双链dna结合染料实现了聚合酶活性的实时研究，操作简便、快捷、成本低，用此方法我们可以实时监测dna聚合酶的活性，即采用等温延伸的方法，而非pcr扩增的方式，可以精确测得聚合酶的活力浓度，通过等温延伸实验，检测聚合酶活力浓度，用标准对照酶的信号增加值和酶量作标准曲线，计算待测酶的活力浓度。
13.本发明运用高精度和高灵敏度的酶活检测仪器：例如lightcylcer roche 480荧光定量pcr仪、abi 7500荧光定量pcr仪、biotek多细胞微孔板检测系统(cytation 1酶标仪)对建立的理想模型的相关参数和反应条件进行充分优化和验证，要求建立酶活测试的标准曲线，实现r2＞0.98，批内差＜10％，批间差＜10％，偏差＜10％。
14.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
15.一种用于实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活的组合物，包括1份10倍的等温延伸测活缓冲液、终浓度为5mm的mgcl2、灭菌水、终浓度为0.4um引物m13r、1.6份sybr green i、终浓度为0.2nm的dntps、终浓度为10ng/ul m13ssdna；
16.所述10倍的等温延伸测活缓冲液包括：去rna酶水、终浓度为200mm的tris8.0、终浓度为100mm的kcl、终浓度为10mm的dtt、终浓度为1mm的edta、0.5％的ca630、0.5％的tween 20、终浓度为1mg/ml的bsa；
17.所述m13ssdna的序列如seq id no.1所示；
18.所述引物m13r的序列如seq id no.2所示。
19.一种用于实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活的检测方法，包括以下步骤：
20.在同一反应过程中，将对照酶或待测酶与所述实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活的组合物混合，获得以反应速率稳定后的某一时间的信号值与起始信号值的差值δrn；
21.以对照酶不同浓度梯度为横坐标，对照酶的δrn为纵坐标建立标准曲线，获得标准曲线y＝kx+b；
22.待测酶的酶活x＝[(待测酶的δrn-b)
÷
k]*n；
[0023]
式中，待测酶的δrn为在同一反应过程中，待测酶与所述实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活的组合物混合，获得以反应速率稳定后的某一时间的信号值与起始信号值的差值δrn，k为以对照酶不同浓度梯度为横坐标，对照酶的δrn为纵坐标建立标准曲线，获得标准曲线的斜率，n为待测酶的稀释倍数。
[0024]
当建立标准曲线的对照酶的酶活单位为mu，计算得到的待测酶的酶活单位也为
mu，如最终获得的待测酶的酶活以u为单位计算，则对应的公式变为：
[0025]
待测酶的酶活x(单位为u)＝[(待测酶的δrn-b)
÷
k]
÷
c*n；
[0026]
式中c＝1000为u和mu的换算系数，1u＝1000mu。
[0027]
数据处理过程如下：
[0028]
1、输出反应的信号值
[0029]
2、选取第31min的rn值，减去起始信号值r1，得到δrn，计算δrn平均值和标准偏差。
[0030]
3、以对照酶每个浓度梯度的δrn平均值为x，对应的酶量mu为y，做单项式曲线，得到公式y＝kx+b，r2﹥0.99。
[0031]
4将待测酶的δrn平均值作为x带入公式中，计算得y即对应的酶量mu，再除以1000将酶量单位换算成u，然后除以理论酶量(u)，得到1u/ul待测酶的实际浓度(u/ul)，计算其平均值。
[0032]
5将4得到的浓度平均值
×
稀释到1u/ul的稀释倍数，得到待测酶母液相对于taq的浓度(u/ul)。
[0033]
优选的，所述反应速率稳定后的某一时间为31分钟。
[0034]
优选的，所述反应条件为：74℃，30s，62循环。
[0035]
优选的，所述对照酶或待测酶与所述实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活的组合物混合体积比为1:4。
[0036]
本发明的技术原理如下：
[0037]
基于双链dna结合染料能特异嵌入双链dna发出荧光的原理，开发了一种实时监测dna聚合酶活性的简便方法。在检测过程中，聚合酶的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光强度的变化时检测聚合酶的活性及药物对聚合酶活性的影响，该方法不需要对dna进行放射性同位素标记和荧光标记，也不需要聚丙烯酰胺电泳和聚合酶链式反应，是一种简便、快速的聚合酶活性实时监测新方法，为研究抗体肿瘤药物对聚合酶活性的影响提供了一种简捷方法，也将为相关疾病诊治和药物筛选提供一种新的思路。
[0038]
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
[0039]
1、与传统的分析聚合酶活性的方法相比，该方法不需要放射性同位素标记和变性聚丙烯胺凝胶电泳，操作简单方便；
[0040]
2、与现有的荧光分析方法相比较，该方法不需要对反应底物进行直接荧光标记及生物化学修饰，检测成本低；
[0041]
3、此方法可实时分析聚合酶的活性，与终点分析法相比，更加真实地反映了聚合反应动态过程信息；
[0042]
4、此方法操作简单、检测时间快捷，最快可10分钟之内测定酶活结果；
[0043]
5、此方法可方便快捷地研究药物对聚合酶的影响作用，为以聚合酶为靶标的新药的开发和筛选提供一种新的手段和方法。
[0044]
6、以hifi酶为标样，采用等温延伸的方法；建立酶活测试的标准曲线，可以实现r2＞0.98，批内差＜10％，批间差＜10％，偏差＜10％；
[0045]
7、适用性广，可以检测普通的kofu酶及突变体；
[0046]
8、检测时间短：10-30min；
[0047]
9、可以采用单条引物延伸，延伸温度为74℃。
附图说明
[0048]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0049]
图1是实例一标曲酶量：0.002-0.024u荧光定量pcr仪测定数据图；
[0050]
图2是实例一kofu酶预估活性为4u/ul荧光定量pcr仪测定数据图；
[0051]
图3是实例一的标准曲线的制定图；
[0052]
图4是实例二标曲酶量：0-0.018u荧光定量pcr仪测定数据图；
[0053]
图5是实例二批次2酶预估活性为4u/ul、6u/ul和8u/ul荧光定量pcr仪测定数据图；
[0054]
图6是实例二的实验结果的标准曲线的制定图；
[0055]
图7是实例二实验结果的标曲酶量：0-0.018u的荧光定量pcr仪测定数据图；
[0056]
图8是实例二实验结果的批次2的kofu酶预估活性为4u/ul、6u/ul和8u/ul的荧光定量pcr仪测定数据图；
[0057]
图9是实例二的实验结果的标准曲线的制定图二；
[0058]
图10是实例三的第一次图谱的标曲酶量：0-0.018u的荧光定量pcr仪测定数据图；
[0059]
图11是实例三的第一次图谱的批次3的kofu酶预估活性为6u/ul和8u/ul荧光定量pcr仪测定数据图；
[0060]
图12是实例三的实验结果的标准曲线的制定图；
[0061]
图13是实例三的第二次图谱的标曲酶量：0-0.018u的荧光定量pcr仪测定数据图；
[0062]
图14是实例三的第二次图谱的批次3的kofu酶预估活性为4u/ul、6u/ul和8u/ul荧光定量pcr仪测定数据图；
[0063]
图15是实例三的实验结果的标准曲线的制定图二；
[0064]
图16是实例四一种实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活检测的新方法批间差图。
具体实施方式
[0065]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0066]
质检方法：通过等温延伸实验，检测酶活力浓度，用对照酶的信号增加值和酶量作标准曲线，计算待测酶的活力浓度。
[0067]
仪器：roche lc480 pcr仪、移液器、离心机、混匀震荡器。
[0068]
试剂：kapa hifi dna聚合酶(品牌：kapa，货号：kk2502)为对照酶(约1u/ul)，、待测酶溶液、1
×
等温延伸测活buffer、10
×
等温延伸测活buffer、mgcl2(250mm)、灭菌水、引物m13r(100um)、sybr green i(100
×
)、dntps(25mm each)、m13ssdna。
[0069]
实施例2-5中待测酶或自产待测酶为苏州译酶生物科技有限公司(简称译酶)生产的dna聚合酶，货号为：eb005
[0070]
实施例1：
[0071]
1.1 10
×
等温延伸测活buffer组成见表1：
[0072]
表1
[0073][0074][0075]
将10
×
等温延伸测活buffer分均分0.5ml/tube，置于-20℃长期保存，有效期1个月，每次使用1tube。
[0076]
1.2操作步骤
[0077]
用作曲线的hifi对照酶作7个梯度(酶量为0/0.002/0.004/0.008/0.012/0.016/0.018u)，待测酶kofu作4个梯度(酶量为0.004/0.008/0.012u/0.016u)，每个反应体系体积为25ul(mix 20ul+酶/1
×
等温延伸测活buffer 5ul)，做3管重复。
[0078]
1)稀释酶溶液
[0079]
①
稀释对照酶，见表2。
[0080]
表2
[0081]
[0082][0083]
②
稀释待测kofu酶
[0084]
先将待测kofu酶用1
×
等温延伸测活buffer稀释到1.00u/ul，酶的取液体积≥5ul。再稀释到0.0008、0.0016、0.0024、0.0032u/ul，稀释操作同对照酶的稀释(见表3)。
[0085]
表3
[0086][0087]
2)配制等温延伸反应mix(20ul/份)
[0088]
组成见表4，对照酶(需24份)加1批待测酶(需12份)共配制40管，震荡离心。等温延伸反应mix置于-20℃保存时，可长期保存；4℃保存时，应在12小时内使用。
[0089]
表4
[0090]
[0091][0092]
3)加样
[0093]
①
使用白色96孔pcr板(roche lc480型荧光定量pcr仪专用)作为反应管。
[0094]
②
先将5ul的稀释待测酶或对照酶(0.0016至0.0080u/ul)分装到对应的反应孔中，做三管重复，然后向每个反应孔中加入20ul的mix。其中酶终浓度为0时，加入5ul的1
×
等温延伸测活buffer。
[0095]
④
因为酶加到体系中反应就会开始，所以应控制加样完成到上机反应的时间，时间应小于5min；操作人员手部避免触碰反应管底部。
[0096]
4)封膜，震荡10s，2000rpm离心1min。
[0097]
5)等温延伸反应
[0098]
使用仪器lc480荧光定量pcr仪，参考《roche lc480 pcr仪作业指导书》，
[0099]
酶活检测：设定反应条件(74℃，30s)，62循环，反应体系设为25ul，荧光选择sybr green i，每个循环收集一次信号，编辑反应孔的名称，保存文件并命名，开始反应。
[0100]
6)数据处理
[0101]
①
输出反应的信号值
[0102]
②
选取第31min的rn值，减去起始信号值r1，得到δrn，计算δrn平均值和标准偏差。
[0103]
③
以对照酶每个浓度梯度的δrn平均值为x，对应的酶量mu为y，做单项式曲线，得到公式y＝kx+b，r2﹥0.99。
[0104]
④
将待测酶的δrn平均值作为x带入公式中，计算得y即对应的酶量mu，再除以1000将酶量单位换算成u，然后除以理论酶量(u)，得到1u/ul待测酶的实际浓度(u/ul)，计算其平均值。
[0105]
⑤
将4.6.4得到的浓度平均值
×
稀释到1u/ul的稀释倍数，得到待测酶母液相对于taq的浓度(u/ul)。
[0106]
实施例2等温延伸测活方法建立及测试kofu批次1酶活
[0107]
2.1稀释对照酶：kapa对照酶hifi(1u/ul)，品牌：kapa，货号：kk2502。
[0108]
表5
[0109][0110]
2.2稀释待测酶:自产对照酶kofu(0.73mg/ml)，20200515#1p1c1d1，预估活性(4u/ul)，译酶，货号：eb005。
[0111]
表6
[0112][0113]
2.3配制等温延伸反应mix(20ul/份)
[0114]
表7
[0115][0116]
将10
×
等温延伸测活buffer分均分0.5ml/管，置于-20℃长期保存，有效期1个月，每次使用1管。
[0117]
表8
[0118][0119][0120]
2.4加样
[0121]
1)使用白色96孔pcr板(roche lc480型荧光定量pcr仪专用)作为反应管。
[0122]
2)先将5ul的稀释待测酶或对照酶(0.0016至0.0080u/ul)分装到对应的反应孔中，做三管重复，然后向每个反应孔中加入20ul的mix。其中酶终浓度为0时，加入5ul的1
×
等温延伸测活buffer。
[0123]
3)封膜，在离心机上，2500rpm离心3min(离心机用之前先遇冷，离心时注意配平)。
[0124]
4)荧光定量pcr设定程序：
[0125]
设定反应条件(74℃，30s)，62循环，反应体系设为25ul，荧光选择sybr green i。
[0126]
荧光定量pcr仪测定数据：图谱(标曲酶量：0.002-0.024u，kofu酶预估活性为4u/ul)：详见于图1，图2。
[0127]
标准曲线的制定：详见于图3。
[0128]
表9
[0129]
酶量0.0160.0120.0080.0040.0020荧光值175.733859.520341.647225.758110.8980-0.3092荧光值2 56.654243.059022.924710.9567-0.7866
荧光值371.246257.159244.643321.772811.0175-0.0878荧光值ave(t)73.4957.7843.1223.4910.96-0.39
[0130]
表10
[0131][0132][0133]
表11
[0134][0135]
实施例3：等温延伸测活方法测试kofu批次2酶活
[0136]
3.1稀释对照酶：kapa对照酶hifi(1u/ul)
[0137]
表12
[0138][0139]
3.2稀释待测酶:自产对照酶kofu(0.75mg/ml)，20200515#1p2c1d1，预估活性(4u/ul)
[0140]
表13
[0141][0142]
3.3稀释待测酶:自产对照酶kofu(0.75mg/ml)，20200515#1p2c1d1，预估活性(6u/ul)
[0143]
表14
[0144][0145]
3.4稀释待测酶:自产对照酶kofu(0.75mg/ml)，20200515#1p2c1d1，预估活性(8u/ul)
[0146]
表15
[0147][0148]
3.5配制等温延伸反应mix(20ul/份)
[0149]
表16
[0150][0151]
3.6加样
[0152]
1)使用白色96孔pcr板(roche lc480型荧光定量pcr仪专用)作为反应管。
[0153]
2)先将5ul的稀释待测酶或对照酶(0.0016至0.0080u/ul)分装到对应的反应孔中，做三管重复，然后向每个反应孔中加入20ul的mix。其中酶终浓度为0时，加入5ul的1
×
等温延伸测活buffer。
[0154]
3)封膜，在离心机上，2500rpm离心3min(离心机用之前先遇冷，离心时注意配平)。
[0155]
4)荧光定量pcr设定程序：
[0156]
设定反应条件(74℃，30s)，62循环，反应体系设为25ul，荧光选择sybr green i。
[0157]
3.7荧光定量pcr仪测定数据，详见于图4，图5。
[0158]
3.8实验结果
[0159]
1)标准曲线的制定，详见于图六，图7，图8。
[0160]
表17
[0161]
酶量00.0020.0040.0080.0120.0160.018荧光值174.291569.614859.027937.328620.196111.3362-0.2546荧光值278.143174.081456.032538.120721.991210.7073-0.0375荧光值382.436176.234554.506737.809825.876710.76700.8743荧光值ave(t)78.2973.3156.5237.7522.6910.940.19
[0162]
表18
[0163][0164]
表19
[0165][0166][0167]
3.9实验结果
[0168]
1)标准曲线的制定，详见于图9。
[0169]
表20
[0170]
酶量0.0180.0160.0120.0080.0040.0020荧光值171.828466.521246.833736.279616.57888.20491.0724荧光值274.471169.281248.626733.900915.33946.1921-0.3865荧光值379.180364.707746.784234.985016.37146.90170.1928荧光值ave(t)75.1666.8447.4135.0616.107.100.29
[0171]
表21
[0172][0173][0174]
表22
[0175][0176]
实施例4：等温延伸测活方法测试kofu批次3酶活
[0177]
4.1稀释对照酶：kapa对照酶hifi(1u/ul)
[0178]
表23
[0179][0180]
4.2稀释待测酶:自产对照酶kofu(0.75mg/ml)，20200515#1p3c1d1，预估活性(4u/ul)
[0181]
表24
[0182][0183]
4.3稀释待测酶:自产对照酶kofu(0.75mg/ml)，20200515#1p3c1d1，预估活性(6u/ul)
[0184]
表25
[0185][0186]
4.4稀释待测酶:自产对照酶kofu(0.75mg/ml)，20200515#1p3c1d1，预估活性(8u/ul)
[0187]
表26
[0188][0189]
4.5配制等温延伸反应mix(20ul/份)
[0190]
表27
[0191][0192]
4.6加样
[0193]
1)使用白色96孔pcr板(roche lc480型荧光定量pcr仪专用)作为反应管。
[0194]
2)先将5ul的稀释待测酶或对照酶(0.0016至0.0080u/ul)分装到对应的反应孔中，做三管重复，然后向每个反应孔中加入20ul的mix。其中酶终浓度为0时，加入5ul的1
×
等温延伸测活buffer。
[0195]
3)封膜，在离心机上，2500rpm离心3min(离心机用之前先遇冷，离心时注意配平)。
[0196]
4)荧光定量pcr设定程序：
[0197]
设定反应条件(74℃，30s)，62循环，反应体系设为25ul，荧光选择sybr green i。
[0198]
4.7荧光定量pcr仪测定数据
[0199]
第一次图谱，详见于图10，图11(标曲酶量：0-0.018u，批次3的kofu酶预估活性为6u/ul和8u/ul)。
[0200]
4.8实验结果
[0201]
标准曲线的制定，详见于图12。
[0202]
表28
[0203]
酶量00.0020.0040.0080.0120.0160.018荧光值174.291569.614859.027937.328620.196111.3362-0.2546荧光值278.143174.081456.032538.120721.991210.7073-0.0375荧光值382.436176.234554.506737.809825.876710.76700.8743荧光值ave(t)78.2973.3156.5237.7522.6910.940.19
[0204]
表29
[0205][0206]
表30
[0207][0208][0209]
4.9实验结果
[0210]
标准曲线的制定，详见于图15。
[0211]
表31
[0212]
酶量0.0180.0160.0120.0080.0040.0020荧光值171.828466.521246.833736.279616.57888.20491.0724荧光值274.471169.281248.626733.900915.33946.1921-0.3865荧光值379.180364.707746.784234.985016.37146.90170.1928荧光值ave(t)75.1666.8447.4135.0616.107.100.29
[0213]
表32
[0214][0215]
表33
[0216][0217]
表34
[0218][0219][0220]
实施例5：一种实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活检测的新方法批间差，详见于图16
[0221]
表35
[0222][0223]
结论：
[0224]
所以本发明是一种实时检测kofu dna高保真聚合酶酶活检测的新方法，可以建立酶活测试的标准曲线，实现r2＞0.98，可以准确测定kofu dna聚合酶的活性，实现批内差＜10％，批间差＜10％，偏差＜10％，本方法操作简便，重复性好，是一种非常可靠的kofu dna高保真聚合酶酶活检测的新方法
[0225]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0226]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0227]
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