一种石蜡包埋组织样本细胞核提取试剂盒的制作方法

1.本实用新型涉及细胞核提取试剂，尤其涉及一种石蜡包埋组织样本细胞核提取试剂盒。


背景技术：

2.石蜡包埋组织样本是目前最常见的肿瘤病理组织样本，为了对肿瘤性质进行诊断，病理学家通常会从石蜡包埋组织样本中提取dna或rna进行分子生物学分析，如单核苷酸多态性分析、dna倍性分析、rna表达量分析等。现有研究显示dna倍性与患者的预后有关联，现有的dna倍性分析方法主要是通过流式细胞术进行，但是流式细胞术检测获得的dna倍性定量只是一个数量上的结果，无法对动态的成因给出解释，也无法进一步解释同样倍数危险程度却可能不同。而事实上细胞核染色质排列紊乱、方向发生改变、增粗、出现裂纹等等都是dna倍性发生改变的原因，也都对肿瘤的预后有不小的影响。因此，在通过肿瘤细胞dna变化来评估肿瘤预后时，仅仅关注dna倍性是不够的，dna形态结构的变化也应纳入考量范围。此外，用于流式细胞术分析的样本只需要提取dna即可，而想要保留完整的dna形态结构则还需要保留完整的细胞核结构，因此，需要一种可提取完整细胞核的成套试剂和耗材，以便快速、流畅地完成石蜡包埋组织样本中细胞核的提取。


技术实现要素：

3.为实现上述目的，本实用新型提供了一种石蜡包埋组织样本细胞核提取试剂盒，包括盒体、蛋白裂解酶试剂瓶、缓冲液试剂瓶、洗脱剂a试剂瓶、洗脱剂b试剂瓶、洗脱剂c试剂瓶、洗脱剂d试剂瓶、固定液试剂瓶，以及具有七个卡位槽的固定部件，所述固定部件可拆卸或不可拆卸地设置于盒体内，前述七个试剂瓶分别被七个所述卡位槽所固定。
4.进一步，其中洗脱剂a为二甲苯，洗脱剂b为无水乙醇或85%以上乙醇溶液，洗脱剂c为65%~84%乙醇溶液，洗脱剂d为蒸馏水，固定液为福尔马林。
5.本实用新型所述乙醇溶液为乙醇的水溶液，其百分比浓度为乙醇的体积百分比。
6.优选地，蛋白裂解酶试剂瓶和洗脱剂a试剂瓶为棕色玻璃试剂瓶，其它为白色或乳白色塑料试剂瓶。
7.进一步，所述蛋白裂解酶保存于-20
±
5℃。
8.优选地，所述蛋白裂解酶为枯草杆菌蛋白酶，所述细胞缓冲液为pbs，所述福尔马林为3-6%的甲醛溶液。
9.优选地，所述蛋白裂解酶试剂瓶容量最小，所述缓冲液试剂瓶容量最大，洗脱剂b、洗脱剂c和洗脱剂d试剂瓶的容量相等，洗脱剂a试剂瓶的容量是其它洗脱剂试剂瓶容量的两倍，固定液试剂瓶的容量大于洗脱剂b试剂瓶的容量。
10.在一些实施方式中，缓冲液试剂瓶的卡位槽单独设置一列，其余六个试剂瓶的卡位槽呈两行三列设置；其中优选地，蛋白裂解酶试剂瓶的卡位槽和洗脱剂a试剂瓶卡的位槽排一列，洗脱剂b试剂瓶、洗脱剂c试剂瓶、洗脱剂d试剂瓶和固定液试剂瓶的卡位槽分占两
行两列。
11.在进一步的实施方式中，蛋白裂解酶试剂瓶的卡位槽和洗脱剂a试剂瓶的卡位槽的一边为缓冲液试剂瓶的卡位槽，另一边为洗脱剂b试剂瓶、洗脱剂c试剂瓶、洗脱剂d试剂瓶和固定液试剂瓶的卡位槽，这样所述蛋白裂解酶试剂瓶被设置在固定部件上偏中间的位置，方便操作人员拿到试剂盒后直接取出蛋白裂解酶试剂瓶，置于-20
±
5℃保存，且两个玻璃试剂瓶置于中间位置可更好地避免碰撞。由于缓冲液是七种试剂中用量最大的，因此将体积最大、重量最重的缓冲液试剂瓶单独设置，其对应的另一边四种试剂分散摆放，避免试剂盒因轻重不平均，在运输或储存过程中出现倾倒等现象，导致试剂外溢。
12.在另一些实施方式中，为了进一步平衡两边的重量，可以将洗脱剂中重量最重的洗脱剂a试剂瓶与固定液试剂瓶一列设置在缓冲液试剂瓶的对应边，中间设置另三种洗脱剂试剂瓶和蛋白裂解酶试剂。
13.优选地，所述试剂瓶为广口瓶，即试剂瓶去掉瓶盖后，开口处的直径不小于瓶体直径的80%，以便于试剂的倾倒。
14.优选地，所述固定部件由轻质的抗震材料制成，用于防撞、防移位且方便拿取，其材料可选自泡沫塑料、空心纸板、海绵等。
15.在一些实施方式中，固定部件由脆性抗震材料（如泡沫塑料）制成，固定部件可拆卸，其横截面外轮廓与盒体横截面内轮廓的形状大小相同或比其略小（缝隙小于1 mm），略小的轮廓使固定部件容易放入盒体，但不易发生位移；七个所述卡位槽的直径分别与其对应试剂瓶的直径相同或略大（缝隙小于1 mm），略大的直径使试剂瓶易放入卡位槽，但不易发生位移。
16.在一些实施方式中，固定部件由柔性的可变形材料（如海绵）制成，固定部件的横截面外轮廓与盒体横截面内轮廓的形状大小相同或比其略大（可变形材料完全抵住盒体，但不发生肉眼可见的形变），七个所述卡位槽的直径分别与其对应试剂瓶的直径相同或略小（可变形材料完全抵住盒体，但不发生肉眼可见的形变），使盒体与固定部件之间、固定部件与试剂瓶之间可通过挤压力、摩擦力来达到相对固定的目的。
17.在一些实施方式中，所述固定部件的高度不超过最高的试剂瓶高度的三分之一或四分之一，这样便于试剂瓶的拿取。在另一些实施方式中，所述固定部件的高度超过最矮的试剂瓶高度的三分之二，这样使试剂瓶不易脱出卡位槽。
18.可选地，所述卡位槽为通孔或凹槽。
19.优选地，所述试剂盒内的底面还设置有抗震底垫，该抗震底垫的材料可与固定部件相同或不同。
20.优选地，所述固定部件为双层结构。
21.在一些实施方式中，所述固定部件的高度为2~5 cm。
22.在一些实施方式中，所述固定部件为双层结构，设置于盒体内的底部，且上层和下层都具有七个相互对应的作为卡位槽的通孔，这种设计可方便地分别取出七种试剂瓶，双层结构较单层结构（包括厚度与双层结构相同的单层结构）在运输过程中不易脱出卡位槽。
23.在另一些实施方式中，所述固定部件为双层结构，上层具有七个作为卡位槽的通孔，下层具有七个对应的作为卡位槽的凹槽，下层可作为底垫使用，同时也起到固定试剂瓶的作用。
24.由于医院需要做细胞核分析诊断的病理切片数量较大，因此本试剂盒在设计包装规格时既要考虑拿取方便，又要考虑尽可能地满足样本数量，试剂盒中的试剂量可用于5份、10份、15份、20份、25份或30份病理切片样本的提取，相应地，蛋白裂解酶的试剂储量优选为20~45 iu、50~75 iu、80~105 iu、110~135 iu、140~165 iu或170~195 iu，缓冲液的试剂储量优选为110~130 ml、230~250 ml、350~370 ml、470~490 ml、590~610 ml或710~730 ml，洗脱剂a的试剂储量优选为45~55 ml、90~110 ml、135~160 ml、180~210 ml、225~260 ml或275~320 ml，洗脱剂b/c/d的试剂储量优选为22~28 ml、45~55 ml、67~80 ml、90~105 ml、112~130 ml或137 ~160 ml。
25.优选地，本实用新型所述试剂盒除了蛋白裂解酶以外的试剂的保存温度为10~30℃。
26.进一步，本实用新型提供的石蜡包埋组织样本细胞核提取试剂盒还包括括筛网、滤纸、磁力搅拌子、黑色卡纸、玻璃瓶、载玻片、离心管、铝箔纸中的一种或多种；其中，所述筛网的孔径优选为50~70 μm，所述滤纸的孔径优选为10~30 μm，可用于细胞涂片离心机。
27.优选地，所述筛网为尼龙筛网，所述筛网的形状优选为圆形。
28.优选地，所述玻璃瓶的内截面直径为1-1.5 cm。
29.优选地，所述磁力搅拌子的长度为0.2~0.5 cm，宽度为0.08~0.2 cm。
30.优选地，所述离心管的数量是所述玻璃瓶数量的两倍。
31.优选地，所述滤纸的形状为圆形。
32.进一步，本实用新型提供了一种包括上述试剂盒的石蜡包埋组织样本细胞核提取套装，该套装还包括耗材盒，所述耗材盒的最底层设置有抗震底垫，其上放置有筛网、滤纸、磁力搅拌子、黑色卡纸、玻璃瓶、载玻片、离心管、铝箔纸中的一种或多种。
33.优选地，所述耗材盒内还设置有抗震顶垫，该顶垫放置于耗材盒内容物的上层，一方面起到抗震作用，另一方面可防止盒内物品从开口处掉出。
34.在一些实施方式中，所述耗材盒至少包括离心管、玻璃瓶、载玻片、筛网、滤纸和磁力搅拌子。所述离心管靠盒体的一侧叠放在耗材盒的抗震底垫上，所述玻璃瓶再叠放在所述离心管上；离心管优选为15 ml离心管，5支一个包装，至少两个包装，玻璃瓶优选为10 ml容量，也是5只一个包装。所述筛网、滤纸和磁力搅拌子分别包装并靠盒体的另一侧放置，所述载玻片可叠放在所述玻璃瓶上或竖直放置于所述筛网、滤纸和磁力搅拌子的一侧。
35.在进一步的一些实施方式中，所述玻璃瓶上还铺设有抗震垫，用来隔离所述玻璃瓶和所述载玻片。
36.在进一步的另一些实施方式中，所述载玻片具有独立的抗震包装，所述独立的抗震包装可以是海绵、泡沫塑料、气泡膜包装袋等。
37.在进一步的又一些实施方式中，所述耗材盒内设置有三个隔间，一侧的隔间内放置离心管和玻璃瓶，中间的隔间内放置载玻片，另一侧的隔间内放置筛网、滤纸和磁力搅拌子。
38.进一步，本实用新型所述试剂盒或所述套装还包括使用说明书。
39.进一步，本实用新型所述试剂盒或所述套装可与细胞核染色试剂联合使用，特别适用于数字图像分析中的dna倍性分析和/或染色质构型分析。
40.进一步，本实用新型所述试剂盒或所述套装特别适用于数字病理扫描分析系统的
细胞核扫描分析。优选地，所述数字病理扫描分析系统具有可通过训练机器学习算法从而对图像进行分析的功能。
41.在本实用新型的一种较佳实施方式中，所述试剂盒或所述套装的使用方法包括如下步骤：
42.1）切片：制备40~60 μm厚的石蜡包埋组织切片，或者含有2000-20000个细胞核的石蜡包埋组织切片；切片不可过薄或过厚，过薄碎片多，过厚则脱蜡不易彻底；切片的数量优选为两张或以上；
43.2）脱蜡：依次用洗脱剂a、洗脱剂b、洗脱剂c和洗脱剂d浸泡脱蜡或洗涤；优选在截面直径1-1.5 cm的小玻璃瓶中进行，既保证样品都能浸没在洗脱剂中，又能尽量减少洗脱剂的用量，浸泡脱蜡和洗涤过程中都用铝箔纸盖住瓶口孵育一段时间；洗脱剂a为二甲苯，用其进行浸泡脱蜡的次数为至少两次；洗脱剂b和c均为乙醇溶液，且洗脱剂b的浓度高于洗脱剂c，洗脱剂d为蒸馏水，在洗脱剂a进行脱蜡完成以后，依次用洗脱剂b、c、d进行洗涤，每次洗涤完需吸出前一种洗脱剂，然后加入后一种洗脱剂；其中，洗脱剂d分两次加入；
44.3）酶消化：用蛋白裂解酶将细胞核消化出来；优选的消化温度为22~27℃，消化时间为60~90分钟；所用的酶为新鲜配制的蛋白酶裂解液，其浓度为3~8 iu/ml；蛋白酶裂解液在进行消化之前，保存在37
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1℃的环境下；
45.4）过滤：用50~70 μm孔径的筛网过滤去除杂质；过滤后离心收集沉淀，优选全程通过黑色比色卡观察离心管内的组织，确保组织不流失；之后用缓冲液重悬沉淀；
46.5）细胞离心涂片：通过细胞涂片离心机制作细胞核数量为1000-1500个的细胞核单层涂片；细胞在显微镜高倍视野下间隔以1-3个细胞为宜。良好的单层细胞核，细胞核不应重叠；
47.6）固定：使用固定液固定。
48.本实用新型的石蜡包埋组织样本细胞提取试剂盒用于石蜡包埋组织切片样本的预处理，使样本中的细胞核从组织和细胞中释放出来。以便于使用体外诊断试剂或仪器对石蜡包埋组织细胞核中的dna物质进行检测。石蜡包埋组织样本中细胞核的释放，需要经过脱蜡、漂洗、消化，将石蜡、细胞质和蛋白质洗脱释放，纯化得到单个细胞核，并以细胞核单层形式平铺到载玻片上，最后得到的涂片可用于扫描形成细胞核单层图像，然后进行分析。
49.本实用新型的石蜡包埋组织样本细胞提取试剂盒结构简单、布局合理、取用方便，固定部件可拆卸，试剂瓶不易脱出移位，且按照医院病理科的使用习惯来确定包装规格，方便大批样本的同时操作，还提供了试剂盒与耗材的套装，医生可根据实际需要进行选择。
50.以下将结合附图对本实用新型的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本实用新型的目的、特征和效果。
附图说明
51.图1是实施例1中所述试剂盒的结构示意图；
52.图2是实施例2的固定部件和试剂瓶的正面结构示意图；
53.图3是实施例3中所述耗材盒的正面结构示意图；
54.图4是实施例4中所述耗材盒的正面结构示意图；
55.1-试剂盒盒体、2-试剂瓶、21-缓冲液试剂瓶、22-蛋白裂解酶试剂瓶、23-洗脱剂a
试剂瓶、24-洗脱剂b试剂瓶、25-洗脱剂c试剂瓶、26-洗脱剂d试剂瓶、27-固定液试剂瓶、3-固定部件、31-卡位槽、32-上层固定部件、33-下层固定部件、4-耗材盒盒体、41-抗震底垫、42-抗震顶垫、43-隔板、44-抗震垫、51-离心管、52-玻璃瓶、53-载玻片、531-抗震包装、54-黑色卡纸、55-尼龙筛网、56-滤纸、57-磁力搅拌子。
具体实施方式
56.下面详细描述本实用新型的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。
57.在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“中间”、“横截面”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或部件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。“多个”的含义是两个或两个以上，“多种”的含义是两种或两种以上，除非另有明确具体的限定。
58.实施例1
59.图1所示为本实用新型的一种实施方式，如图所示，石蜡包埋组织样本细胞核提取试剂盒包括盒体1、试剂瓶2、固定部件3，在固定部件3中设置有卡位槽31，卡位槽为开设在固定部件3内的七个圆形通孔，其中放置七个试剂瓶，左边第一个试剂瓶21最大，是细胞缓冲液试剂瓶，它单独排一列，靠近试剂瓶21的一列有两个试剂瓶，分别是蛋白裂解酶试剂瓶22和洗脱剂a试剂瓶23，它们都是棕色玻璃瓶，其中蛋白裂解酶试剂瓶22最小，放在靠近中间的位置，方便操作人员拿出试剂瓶放入-20
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5℃的冰箱中。再向右一列为洗脱剂b试剂瓶24和洗脱剂c试剂瓶25，最右边一列为洗脱剂d试剂瓶26和固定液试剂瓶27，由于一个样本可作出多片涂片，所以固定液的用量会大于洗脱剂的用量，所以固定液试剂瓶27也较洗脱剂试剂瓶大一些。图1中试剂瓶的摆放一方面从重量均衡来考虑，另一方面从实验步骤来考虑，洗脱剂a/b/c/d的试剂瓶摆放在一起，方便使用时按顺序拿出，固定液最后使用，所以摆放在最右边。本实施例试剂盒可供5份样本使用，较佳的各试剂瓶中试剂的储量为：缓冲液 120 ml、蛋白裂解酶 30 iu、洗脱剂a 50 ml、洗脱剂b 25 ml、洗脱剂c 25 ml、洗脱剂d 25 ml、固定液50 ml。
60.固定部件3可拆卸或不可拆卸地设置于盒体1内，其由泡沫塑料制成，外轮廓比盒体内轮廓略小，可拆卸时无论是装入还是拿出都较方便，且几乎不会在水平方向上移动，七个试剂瓶的卡位槽的直径比试剂瓶的直径略大，固定部件的高度为2~5 cm，使试剂瓶便于拿取，但又不容易从卡位槽中脱出。七个试剂瓶均为广口瓶，便于倾倒。
61.实施例2
62.本实用新型固定部件的另一种实施方式，如图2所示，其中固定部件3由上下两层组成，其中上层32内的卡位槽为圆形通孔，下层33内的卡位槽为圆形凹槽，下层既可以起到固定作用，又可以起到抗震作用，也可视为底垫，固定部件分两层的好处是：运输过程中如遇跳动，下层可抗震，上层会随试剂瓶一起发生向上的位移，但是由于卡位槽的作用使试剂
瓶之间不发生位移，回落时更容易回到原来的位置。上下两层固定部件的总高度为3~5 cm，在其它的实施方式中，底垫内也可以没有卡位槽。
63.实施例3
64.图3所示是本实用新型套装中的耗材盒的一个较佳实施例，其中耗材盒盒体4内设置有抗震底垫41和抗震顶垫42，通过隔板43将盒体内部分隔为两个空间，图中右边稍大的空间用于放置15 ml的离心管51、10 ml的玻璃瓶52和盖玻片53，且它们都以五个或十个为一个包装单位进行包装，如图所示，底垫41上放置两层离心管51，共10个离心管，其上设置一层抗震垫44，抗震垫上放置一层玻璃瓶52，共5个玻璃瓶，其上再放置第二层抗震垫44，最上层是载玻片53，载玻片共10片，5片叠一起，共两叠，图中载玻片53外还包裹有抗震包装531，该抗震包装可以为海绵、泡沫塑料、气泡膜包装袋等，该抗震包装主要是用于防护叠在一起的玻璃材质的载玻片碰撞时发生碎裂，也可防护载玻片与同样为玻璃材质的玻璃瓶相互碰撞，载玻片和玻璃瓶的玻璃材质可以为硼硅玻璃。此外，在一些实施例中，抗震包装531和抗震垫44可以二选一。在另一些实施例中，抗震底垫41上的第一层放置玻璃瓶，第一层抗震垫44上放置离心管51，其材质为聚丙烯，第二层抗震垫44上放置载玻片53，使两种玻璃材质的耗材分开，以免碰撞。
65.图3中左边稍小的空间用于放置黑色卡纸54、尼龙筛网55、滤纸56和磁力搅拌子57，黑色卡纸的数量为2张，尼龙筛网的数量为5张，滤纸的数量为10张，磁力搅拌子的数量为10个，每种耗材可分别包装在一个塑料袋中。尼龙筛网的孔径为50~70 μm，滤纸的孔径为10~30 μm。本实施例中的抗震顶垫用于防撞，同时用于防止耗材从盒口的缝隙中掉出。
66.实施例4
67.如图4所示，本实施例中的底垫41与顶垫42和实施例3中相同，区别在于该盒体内被隔板43分隔为三个空间。右边较大的空间用于存放离心管51和玻璃瓶52，两者之间通过抗震垫44来分隔，在某些实施例中抗震垫44也可以没有。左边较小的空间用于存放黑色卡纸54、尼龙筛网55、滤纸56和磁力搅拌子57，由于这些耗材不是易碎品，因此可以随意摆放，图中的位置只是示意。中间最小的空间用于摆放载玻片53，且该空间的大小与载玻片53的大小差不多，载玻片放在该空间内不易移动，可以再包装抗震包材，也可以不包装直接放置。
68.实施例5 石蜡包埋组织样本细胞核的提取
69.本实施例使用的试剂盒含有：
70.裂解酶（枯草杆菌蛋白酶）
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3 mg；
71.细胞缓冲液（pbs）
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120 ml；
72.洗脱剂a（二甲苯）
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50 ml；
73.洗脱剂b（95%乙醇）
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25 ml；
74.洗脱剂c（80%乙醇）
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25 ml；
75.洗脱剂d（蒸馏水）
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25 ml；
76.固定液（4%的甲醛水溶液）
ꢀꢀ
50 ml。
77.该试剂盒中试剂的量可供5份样品提取细胞核。该试剂盒可在2-8℃下运输，裂解酶保存于-20
±
5℃，其它试剂常温保存，试剂盒的有效期为18个月。
78.该试剂盒还可包括耗材：尼龙细胞筛网（孔径60 μm）5个、滤纸（孔径15 μm）5张、磁
力搅拌子10个、黑色卡纸2张、硼硅小玻璃瓶（10 ml）5个、硼硅载玻片10片、离心管（15 ml）10个。
79.细胞核提取的步骤如下：
80.一、切片
81.制备50 μm厚的石蜡包埋组织切片2片，切片不可过薄或过厚，过薄碎片多，过厚则脱蜡不易彻底。
82.二、脱蜡
83.2.1 将每个样本分别放入10 ml小玻璃瓶内，用电子移液器向每个样本中加入4 ml洗脱剂a，轻轻摇晃使组织充分浸润。用铝箔纸盖住瓶口孵育15分钟。
84.2.2 用胶头滴管除去洗脱剂a，动作要轻，避免吸出组织。
85.2.3 重复用电子移液器向每个样本中加入4 ml洗脱剂a，轻轻摇晃使组织充分浸润。用铝箔纸盖住瓶口孵育15分钟，然后用胶头滴管除去洗脱剂a。
86.2.4 用连续加样器加入4 ml洗脱剂b，转动玻璃瓶使组织充分浸润，孵育5分钟。
87.2.5 每个样品使用一个单独的胶头滴管移除洗脱剂b。
88.三、补液和漂洗
89.3.1 用连续加样器精准加入4 ml洗脱剂c并孵育5分钟。
90.3.2 更换枪头后用连续加样器精准加入2 ml洗脱剂d，间隔2分钟，再次加入2 ml洗脱剂d，等待2分钟。
91.3.3 将小玻璃瓶的内容物倾倒到15 ml离心管中，确保玻璃瓶内无组织残留且组织在离心管底部。
92.3.4 调节离心机降速设置为“3”、1500 rpm/min 离心10分钟，用黑色比色卡衬托离心管内的组织，轻柔弃去上清液，倒扣吸水纸上吸干水分，全程通过黑色比色卡观察离心管内的组织，确保组织不流失。
93.3.5 用连续加样器加入8 ml 细胞缓冲液。确保组织沉淀在离心管底部。调节离心机降速设置为“3”、1500 rpm/min 离心10分钟。用黑色比色卡衬托组织，先倒去上清液确保组织不流失，再用玻璃滴管小心吸去剩下的上清液，倒扣吸水纸上吸干水分。
94.四、酶消化和细胞核提取
95.4.1 取出裂解酶，加入6 ml细胞缓冲液混匀，配制0.5 mg/ml裂解酶溶液后室温放置。
96.4.2 把配制好的0.5 mg/ml裂解酶溶液放入恒温的37℃水浴箱中预热待用。
97.4.3 向15 ml离心管加入1 ml 0.5 mg/ml裂解酶溶液。再向样品中加入1-2个磁力搅拌子。在磁力搅拌器上室温（25℃）下消化1小时15分钟，若未消化好则等待5分钟，最多等待10 min，消化完成后使用涡旋仪混匀10秒钟。
98.4.4 加入8 ml在4℃预冷的细胞缓冲液，以阻止酶活性。
99.4.5 取新15 ml离心管，将60 μm筛网对称折叠2次，取圆锥型插入新管中。过滤样品通过60 μm筛网过滤到新管中。
100.4.6 调节离心机降速设置为“3”、2500 rpm/min离心20分钟，用黑色比色卡衬托离心管内的组织，轻柔弃去上清液，倒扣吸水纸上吸干水分，全程通过黑色比色卡观察离心管内的组织，确保组织不流失。
101.4.7 向15 ml离心管加入0.5-3 ml细胞缓冲液，取决于颗粒的大小。震荡吹打均匀。
102.五、制备细胞核单层载玻片
103.5.1 滤纸与载玻片编号标记，先将载玻片放入离心夹中，再放滤纸，最后放入漏斗夹好。向漏斗加入细胞核混悬液100 μl，调节细胞涂片离心机以“low”、600 rpm/min离心5分钟。离心完成时，取出载玻片。
104.5.2 镜检。根据细胞数目的多少，适当增减悬液的量再次涂片。细胞在显微镜高倍视野下间隔以1-3个细胞为宜。良好的单层细胞核，细胞核不应重叠。
105.5.3 细胞核单层载玻片显微镜镜检完成后使用固定液固定（试剂需浸泡没过核单层）至少15分钟。
106.以上详细描述了本实用新型的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本实用新型的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本实用新型的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。