对SARS冠状病毒2具有免疫原性的组合物、其制备方法和用途与流程

对sars冠状病毒2具有免疫原性的组合物、其制备方法和用途
1.本国际专利申请要求2020年2月10日提交的美国临时专利申请号：62/972,616和2020年6月11日提交的美国临时专利申请号：63/037,645的权益，其全部内容通过引用并入以用于所有目的。
技术领域
2.本发明总体上属于含有一种或多种来自sars-cov-2的抗原的活减毒嵌合病毒、包括含有嵌合sars-cov-2抗原的病毒的免疫原性组合物以及使用此类组合物诱导对sars-cov-2的免疫应答的方法的领域。
3.发明背景
4.自2019年12月以来出现的一新型冠状病毒最初被世界卫生组织(who)命名为新型冠状病毒(ncov)2019。该病毒现已重命名为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2或sars-cov-2。其引起的疾病称为covid-19(冠状病毒病2019)。迄今为止，全世界有超过1130万例的实验室确诊感染，其中约1％-4％的病例死亡，这取决于年龄和可能具有不同临床护理可用性的地理位置。sars-cov-2已在全球传播，导致世界卫生组织于2020年3月12日宣布由sars-cov-2引起了大流行。后续的流行存在两种可能：(1)在目前实施的大规模干预措施后，sars-cov-2将从人类中消失；(2)sars-cov-2可能成为一种普通感冒病毒，并像其他人类冠状病毒一样继续在人类中传播。目前的情况表明，sars-cov-2从人类中消失的可能性很小。人类将如何与这种病毒共存已成为现实。自2002/2003年sars冠状病毒以来，存在三种冠状病毒跨越物种障碍并感染人类。有理由相信，未来可能会出现其他来自动物来源的冠状病毒并感染人类。需要快速响应和有效的疫苗来应对当前由sars-cov-2引起的大流行和未来新出现的冠状病毒。此外，人类对sars-cov-2没有预先存在的免疫力，因此存在这种病毒可能会在全球范围内导致显著的流动性和死亡率的担忧。迫切需要用于预防由这种sars-cov-2引起的感染或减轻由其引起的发病率或死亡率的疫苗。
5.开发具有提供广泛交叉保护活性的特性的针对sars-cov-2的有效疫苗的新策略是必要的。
6.发明概述
7.本发明的一个目的是提供安全有效的活减毒冠状病毒。
8.本发明的另一个目的是提供生成活减毒冠状病毒疫苗的方法。
9.本发明的另一个目的是提供在哺乳动物中引发针对冠状病毒的免疫应答的方法。
10.对本说明书中包含的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论不应被视为承认任何或所有这些事项构成在与本技术的每个权利要求的优先权日期之前存在的与本公开相关的领域中的现有技术基础的一部分或公知常识。
11.在整个说明书中，词语“包含”或变体如“包括”或“含有”将被理解为暗示包含所陈述的元素、整数或步骤，或元素组、整数组或步骤组，而非排除任何其他元素、整数或步骤，或元素组、整数组或步骤组。
12.提供了针对sars-cov-2的免疫原性组合物、制备和使用方法。提供了包括表达一
种或多种sars-cov-2抗原(本文中为cov2ag)的活减毒嵌合病毒的组合物，提供了其制备和使用方法。嵌合病毒建立在活减毒流感病毒(laiv)的骨架上，其包括病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)的缺失(delns1)。由delns1活减毒流感病毒(laiv)产生并表达cov2ag的嵌合病毒株在本文中通常称为delns1-sars-cov-2-cov2ag，其中取决于所表达的cov-2ag，具体的嵌合病毒名称不同。例如，在嵌合病毒表达sars-cov-2的rbd的情况下，该嵌合病毒是delns1-sars-cov-2-rbd cov2ag。优选的嵌合疫苗株包括ca04-delns1-sars-cov-2-rbd；hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd毒株。特别优选的laiv骨架是传代适应株a/加利福尼亚/04/2009(a/ca/04/2009；ca04)病毒，其包括病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)的缺失(在本文中为ca04-delns1)，并且优选地包括位于np(d101n)和nep(e95g)基因中的两个适应性突变。laiv和delns1-sars-cov-2-cov2ag优选地在低温如低于37℃的温度下复制，更优选地在30℃至33℃下复制，最优选地在约33℃下复制。在一些实施方案中，所公开的delns1-sars-cov-2-cov2ag的特征在于，与其在33℃下在mdck细胞中的复制相比，其于37℃下在mdck细胞中的复制很差。在特别优选的实施方案中，突变的delns1-sars-cov-2-cov2ag能够在疫苗生产系统例如鸡蛋或mdck细胞中以与相同毒株的野生型流感病毒相当的水平复制。一种特别优选的delns1-sars-cov-2-cov2ag毒株基于ca04-delns1，其经转化以表达sars-cov-2的受体结合结构域(rbd)，该嵌合病毒在本文中称为ca04-delns1-sars-cov-2-rbd。
13.还公开了制备表达一种或多种sars-cov-2抗原的嵌合病毒的方法。嵌合病毒株包括laiv，其包括病毒毒力元件ns1蛋白的缺失和允许突变株在疫苗生产系统如鸡蛋和mdck细胞中生长的适应性突变(即delns1-sars-cov-2-cov2ag毒株)。这些方法包括(a)生成laiv(其包括ns1编码区的缺失)、delns1例如ca04-delns1；(b)在delns1例如ca04-delns1中表达来自sars-cov-2的抗原(即cov2ag)，通过转染ca04-delnsi以表达代替缺失的ns1的冠状病毒抗原，从而生成嵌合病毒，即本文的delns1-sars-cov-2-cov2ag；(b)拯救delns1-sars-cov-2-cov2ag；和(c)在一个或多个疫苗生产细胞中对拯救的病毒进行传代，直到病毒滴度稳定，以获得delns1-sars-cov-2-cov2ag毒株。示例性冠状病毒抗原结构域包括受体结合结构域(rbd)。
14.所公开的方法优选地包括反向遗传学。在一些优选的实施方案中，将含有缺失的ns1片段(delns1)并表达选定的冠状病毒抗原和其他七个衍生自流感病毒株的基因组片段的质粒转染到293t/mdck细胞混合物中。拯救的病毒在mdck细胞中传代，直到病毒滴度稳定，其中病毒滴度保持三次连续传代没有有意义的变化。如本文所用，没有有意义的变化是指包括没有变化或没有统计学上显著变化的变化。
15.还提供了药物组合物。药物组合物包括公开的免疫原性delns1-sars-cov-2-cov2ag，如根据所公开的方法产生的ca04-delns1-cov2ag。药物组合物通常包括有效量的病毒，以在对有需要的受试者施用时诱导受试者的免疫应答。药物组合物可以包括另外的药剂例如佐剂以增强免疫应答。在一些实施方案中，药物组合物不包括佐剂。在一个实施方案中，组合物包括有效量的嵌合ca04-delns1-cov2ag。
16.还提供了通过将药物组合物施用于有需要的受试者来治疗受试者的方法。这些方法可以是疫苗方案。因此，在一些实施方案中，向受试者施用组合物以提供针对sars-cov-2的预防性或治疗性保护。根据本文公开的方法生成的公开的嵌合ca04-delns1-cov2ag通过
皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)、经口或鼻内施用；或通过注射或吸入施用于有需要的哺乳动物。在其他方面，毒株鼻内施用。将含有嵌合delns1-cov2ag的组合物施用于需要针对流感感染的保护性免疫的哺乳动物。
附图说明
17.图1a和1b显示了delns1-mers-rbd和delns1-mers-n laiv的构建。
18.图2a-2c经接种的dpp4转基因小鼠对mers冠状病毒致死性攻击(2mld
50
)的保护。
19.图3a-3c经接种的dpp4转基因小鼠对mers冠状病毒致死性攻击(10mld
50
)的保护。
20.图4a和4b显示了mers冠状病毒的受体结合结构域(seq id no:1)(图4a)和sars-cov-2的受体结合结构域(seq id no:2)(图4b)的序列。
21.图5显示了sars-cov-2到delns1 laiv载体中的克隆。
22.图6是显示delns1-sars-cov-2-rbd疫苗株中的ns片段和rbd插入的验证的印迹。
23.图7显示了delns1-sars-cov-2-rbd活减毒病毒感染的mdck细胞中sars-cov-2rbd的表达。
24.图8显示了对ace2转基因小鼠中由sars-cov-2感染引起的疾病的保护。
25.发明详述
26.i.定义
27.材料
28.公开了可以用做、可以结合用于、可以用于制备的材料、组合物和组分，或者是公开的方法和组合物的产物。这些材料和其他材料在本文中公开，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的每种不同的单独和集体组合和排列的具体参考，但每种都在本文中具体考虑和描述。例如，如果公开和讨论了适体，并且讨论了可以对包括该适体的许多分子或组合物进行的许多修饰，则具体考虑适体的每个组合和排列以及可能的修饰，除非有明确相反的说明。因此，如果公开了一类分子a、b和c以及一类分子d、e和f和组合分子a-d的实例，那么即使每个分子没有单独列举，每个分子也都单独和集体考虑。因此，在该示例中，a-e、a-f、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e和c-f的组合中的每个都被具体考虑并且应该被认为从a、b和c；d、e和f；和示例组合a-d的公开中公开。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑和公开。因此，例如，a-e、b-f和c-e的子组被具体考虑并且应该被认为从a、b和c；d、e和f；和示例组合a-d的公开中公开。此外，如上所考虑和公开的材料、组合物、组分等中的每一个也可以具体且独立地包括或排除在此类材料的任何组、子组、列表、集合等中。这些概念适用于本技术的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个都可以通过所公开方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来执行，并且每个这样的组合都被具体考虑并且应该视为已公开。
29.如本文所用，术语“佐剂”是指增强免疫应答的化合物或混合物。
30.如本文所用，“减毒”是指削弱疾病因子(病原体)的程序。减毒病毒是减弱的、较不活跃的病毒。针对病毒性疾病的疫苗可以由减毒、毒性较低的病毒株制备，这种病毒能够刺激免疫应答并产生免疫力，但不引起疾病或引起不太严重的疾病。可以使用本领域技术人员已知的方法通过病原体的化学处理、辐射或遗传修饰来实现减毒。减毒可能导致降低的
增殖、对宿主细胞的附着或降低的毒素的产生或强度。
31.如本文所用，术语“老年人”是指年龄超过65岁的受试者。
32.如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗疾病状态的一种或多种症状或以其他方式提供期望药理作用的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，如受试者相关变量(例如年龄、免疫系统健康等)、疾病和受试者的年龄。
33.如本文所用，术语“基因”是指核酸(例如，dna或rna)序列，其包括产生多肽、rna(例如，包括但不限于mrna、trna和rrna)或前体所必需的编码序列。多肽、rna或前体可由全长编码序列或其任何部分编码。该术语还涵盖结构基因的编码区和位于编码区5’端和3’端附近与任一端的距离为约1kb的序列，使得该基因对应于全长mrna的长度。术语“基因”涵盖基因的cdna和基因组形式，其可以由dna或rna构成。基因的基因组形式或克隆可以含有由称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核rna(hnrna)的基因片段；内含子可以含有调节元件如增强子。内含子从核或初级转录本中去除或“剪除”；因此，内含子不存在于信使rna(mrna)转录本中。mrna在翻译过程中起作用以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
34.术语“免疫原性组合物”或“组合物”是指该组合物可以诱导免疫应答并因此具有抗原性。“免疫应答”是指免疫系统的任何反应。这些反应包括生物体免疫系统响应抗原的活性的改变，并且可以涉及例如抗体产生、细胞介导免疫的诱导、补体激活或免疫耐受性的发展。
35.术语“经鼻施用”是指任何形式的施用，其中活性成分被推进或以其他方式引入受试者的鼻道中，以使其接触鼻腔的呼吸道上皮细胞，从该上皮细胞吸收到体循环中。经鼻施用还可以涉及接触嗅觉上皮，其位于鼻腔顶部的中央鼻中隔和每个主要鼻道的侧壁之间。紧邻嗅觉上皮的鼻腔区域没有气流。因此，通常必须采用专门的方法来实现跨嗅觉上皮的显著吸收。
36.术语“口腔”、“肠内”、“经肠”、“经口”、“非肠胃外”、“非肠胃外地”等是指通过沿消化道的途径或方式将化合物或组合物施用于个体。组合物的“经口”施用途径的实例包括但不限于从口中吞咽液体或固体形式的疫苗组合物、通过鼻空肠或胃造口管施用疫苗组合物、疫苗组合物的十二指肠内施用和直肠施用，例如使用释放本文所述的活细菌疫苗株的栓剂。
37.如本文所用的术语“哺乳动物”包括人类和非人类，并且包括但不限于人类、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。
38.术语“局部施用”是指将药剂应用于皮肤外表面或粘膜(包括鼻、肺和嘴的表面膜)，使得药剂穿过皮肤外表面或粘膜并进入下层组织。局部施用可导致药剂有限地分布到皮肤和周围组织，或者当药剂通过血流从治疗区域去除时导致药剂的全身分布。在优选的形式中，药剂通过透皮递送，例如使用透皮贴剂来递送。透皮递送是指药剂穿过皮肤(角质层和表皮)的扩散，皮肤作为一种屏障，很少有药剂能够穿透。相比之下，真皮是可渗透的以吸收许多溶质和药物，因此局部施用更容易通过以刮擦或其他方式剥离表皮以暴露真皮的皮肤。可以通过将活性剂与油性载体(例如，乳膏、润肤剂、渗透促进剂等，如例如在remington's pharmaceutical sciences,current edition,gennaro等人编中所描述的)在应用于皮肤之前组合(称为涂抹的过程)，来增强通过完整皮肤的吸收。
39.如本文所用，术语“肽”是指由化学结合在一起的氨基酸组成的一类化合物。通常，氨基酸通过酰胺键(conh)化学结合在一起；然而，氨基酸也可以通过本领域已知的其他化学键结合在一起。例如，氨基酸可以通过胺键结合。如本文所用的肽包括氨基酸的寡聚体和小肽和大肽，包括多肽。
40.如本文所用“，嵌合病毒”是指包括来自多于一种病毒株类型的病毒rna的病毒珠。
41.如本文所用，与对应的野生型或亲本多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽序列相比，“变体”、“突变体”或“突变的”多核苷酸或多肽含有至少一种多核苷酸或多肽序列改变。突变可以是天然的、故意的或偶然的。突变包括替换、缺失和插入。
42.ii.组合物
43.提供了包含活减毒嵌合病毒的免疫原性组合物，该嵌合病毒基于含有ns1片段缺失(delns1)的delns1活减毒流感病毒(laiv)，其经工程改造以表达来自新型冠状病毒的一种或多种抗原(本文为cov2ag)。嵌合的sars-cov-2病毒可以包括在用于施用的制剂、载剂中，并且在一些实施方案中与佐剂组合。佐剂可以用作载剂。在一些实施方案中，含有所公开的嵌合病毒株的免疫原性组合物不包括佐剂。在特别优选的实施方案中，组合物不包括全长sars-cov-2刺突蛋白或完整的sars-cov-2。
44.所公开的嵌合病毒株基于delns1活减毒流感病毒(laiv)平台，该平台能够从delns1 laiv基因组的ns片段的ns1位置表达外源抗原。组合物是免疫原性的，因为它们可用于引发针对laiv编码的一种或多种cov2ag的免疫应答。由于ns1片段编码区的缺失(delns1)和适应性突变(am)，laiv具有增加的安全性，从而改善了其在疫苗生产系统中的生长。具有基于传代适应的a/ca/04/2009(ca04)病毒的这些突变组合的优选嵌合流感/cov2ag病毒在本文中称为ca04-delns1-cov2ag。
45.a.活减毒嵌合病毒
46.所公开的嵌合病毒可以包含各种含有缺失的ns1片段(delns1)的laiv骨架，其经工程改造以表达一种或多种来自新型冠状病毒的抗原(本文为cov2ag)。由delns1活减毒流感病毒(laiv)产生并表达cov2ag的所得嵌合病毒在本文中通常称为delns1-sars-cov-2-cov2agcov2ag。
47.(i)laiv骨架
48.用于制备所公开的嵌合sars-cov-2的骨架病毒优选地是活减毒的甲型流感病毒株。示例性毒株包括ca04、a/wsn/33和a/pr/8/34。在本文中作为示例的hk4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd可以构建在ca04-delns1的内部基因骨架中，其中ha和na衍生自毒株a/hk/4801/2014(h3n2)或a/hk/2019(h1n1)。
49.(a)ca04-delns1
50.优选的laiv骨架是公开于公开号20190125858中的突变流感病毒，其通过引用并入本文。简而言之，冷适应流感病毒ca04-delns1基于2009h1n1流感病毒株，因此，包括那些包括以下的病毒：毒力因子活性缺失，在没有毒力因子活性的情况下赋予在37℃下复制的第一组的一个或多个突变，以及赋予在低于35℃的温度下复制的第二组或第三组的一个或多个突变。毒力因子活性的缺失可以包括毒力因子基因的至少部分的缺失。这种缺失可以是延伸超出突变病毒的ns1区段的核苷酸57至528的ns1基因的至少部分的缺失。
51.第一组的一个或多个点突变赋予复制能力，并且可以位于突变h1n1流感病毒的m
区之外(例如，h1n1流感病毒基因组中的g346a(蛋白质序列中的d101n)突变)。
52.第二组的一个或多个突变可以包括一个或多个点突变，如h1n1流感病毒基因组中的t261g(蛋白质序列中的l79v)或a310g(蛋白质序列中的e95g)突变，已被发现支持冷适应delns1病毒复制的位置。所公开的突变流感病毒还可以包括赋予在低于35℃的温度下复制的第三组的一种或多种突变。这些可以包括与第二组突变(如h1n1流感病毒基因组中的t261g或a310g突变)不同的一个或多个点突变。相对于35℃或更低的温度，在37℃或更高的温度下，突变的流感病毒可显示出降低的复制能力。
53.(b)a/wsn/33-delns1和a/pr/8/34-delns1
54.laiv骨架还可以衍生自zheng等人，j.virol.，89:10273
–
10285(2015)中描述的a/wsn/33和a/pr/8/34毒株。这些病毒株包括ns1基因的缺失，以及在病毒rna(vrna)的m片段的3’非编码区(ncr)中的适应性替换a14u(在delns1病毒几次传代后获得)，其显著增强了delns1病毒的复制。m-a14u替换支持pr8 delns1病毒在vero和mdck细胞中的复制，而没有此替换的pr8 delns1病毒无法繁殖。
55.(ii)cov2ag
56.尽管sars-cov和sars-cov-2之间存在相似之处，但两者之间存在遗传变异，并且引发针对sars-cov的免疫应答的表位是否对sars-cov-2有效尚不清楚。
57.优选的cov2ag是sars-cov-2的受体结合结构域(rbd)，从而产生本文中称为delns1-sars-cov-2-rbd的嵌合病毒。delns1-sars-cov-2-rbd laiv平台包括关键毒力元件ns1被敲除的显著特征，但delns1-sars-cov-2-rbd laiv仍然可以在疫苗生产系统(鸡蛋或mdck细胞)中复制。当sar-cov-2的受体结合结构域(rbd)插入病毒基因组的ns1位点时，rbd在感染了delns1-sars-cov-2-rbd laiv的细胞中稳定表达。
58.使用rbd作为抗原可以最大限度地减少使用全长刺突蛋白或全病毒引起的潜在抗体依赖性增强病理，如sars冠状病毒所示。因此，在优选的实施方案中，抗原不是sars-cov-2的全长刺突蛋白。rbd可以进一步优化以覆盖一种以上的冠状病毒株，以防止未来出现的冠状病毒。delns1-sars-cov-2-rbd嵌合病毒可以诱导中和抗体和t细胞免疫。可以生成具有流感表面蛋白的ha和na的不同组合的各种疫苗种子。可以通过改造具有缺失ns1片段的流感病毒以表达rbd来产生delns1-sars-cov-2-rbd嵌合病毒。所得的嵌合病毒包括但不限于ca04-delns1-sars-cov-2-rbd；hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd。这些都是delns1-sars-cov-2-cov2agcov2ag，其中cov2agcov2ag部分是rbd。
59.ca04-delns1-ncov-rbd的全基因组序列保存在genbank中，genbank登录号为mt227009-mt227016。如本文所述制备的ca04-delns1-ncov-rbd疫苗种子于2020年4月7日保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，地址为10801university boulevard,manassas,va20110usa，专利保藏号为pta-126682。所公开的嵌合病毒可用于制备活减毒疫苗，该疫苗包括下文制剂中公开的delns1-sars-cov-2-cov2agcov2ag。
60.b.佐剂
61.所公开的laiv可以与其他免疫调节剂，包括佐剂共同施用。有用的佐剂包括但不限于以下列出的一种或多种：
62.含矿物质的佐剂组合物包括矿物盐，如铝盐和钙盐。示例性无机盐包括氢氧化物
(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等或不同无机化合物的混合物(例如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地具有过量的磷酸盐)，其中化合物采用任何合适的形式(例如，凝胶、结晶、无定形等)，并且优选吸附到盐上。含矿物质的组合物也可以配制成金属盐颗粒(wo/0023105)。本发明的组合物中可以包括铝盐，使得al
3+
的剂量为每剂0.2至1.0mg。
63.适合用作本发明佐剂的油乳剂佐剂可以包括角鲨烯-水乳剂，如mf59(5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，使用微流化器配制成亚微米颗粒)。参见例如,wo90/14837,podda,vaccine 19:2673-2680,2001。用于组合物中的额外佐剂是亚微米水包油乳剂。用于本文的亚微米水包油乳剂的实例包括角鲨烯/水乳剂，其任选含有不同量的mtp-pe，如含有4-5％w/v角鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)和/或0.25-1.0％司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)的亚微米水包油乳剂，以及任选地，n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺酰-l-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-s
‑‑
n-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(mtp-pe)，例如称为“mf59”的亚微米水包油乳液(国际公开号wo90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325，其通过整体引用并入本文)。mf59可以含有4-5％w/v角鲨烯(例如，4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温80和0.5％w/v司盘85，并任选含有各种量的mtp-pe，使用微流化器如110y型微流化器(microfluidics,newton,ma)配制成亚微米颗粒。例如，mtp-pe可以以约0-500μg/剂、或0-250μg/剂、或0-100μg/剂的量存在。亚微米水包油乳剂、其制备方法和用于组合物的免疫刺激剂如胞壁酰肽，详细描述于国际公开号wo90/14837和美国专利号6,299,884和6,451,325中。
64.弗氏完全佐剂(cfa)和弗氏不完全佐剂(ifa)也可以用作本发明的佐剂。
65.皂苷佐剂制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是一类异源甾醇糖苷和三萜糖苷，存在于多种植物的树皮、叶、茎、根甚至花中。来自皂树(quillaia saponaria molina)树皮的皂苷作为佐剂已被广泛研究。皂苷也可以从菝葜(smilax ornata)、满天星(gypsophilla paniculata)和皂草(saponaria officianalis)中商业获得。皂苷佐剂制剂可以包括纯化的制剂，如qs21，以及脂质制剂，如免疫刺激复合物(iscom；见下文)。皂苷组合物已使用高效薄层色谱(hplc)和反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化。已经确定了使用这些技术的特定纯化级分，包括qs7、qs17、qs18、qs21、qh-a、qh-b和qh-c。qs21的生产方法公开于美国专利号5,057,540中。皂苷制剂还可以包含甾醇，如胆固醇(参见wo96/33739)。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为iscom的独特颗粒。iscom通常还包括磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可以在iscom中使用。例如，iscom可以包括quil a、qha和qhc中的一种或多种。iscom描述于ep0109942、wo96/11711和wo96/33739中。任选地，iscom可以不含额外的去污剂。参见wo00/07621。可在barr等人，“iscoms and other saponin based adjuvants”，advanced drug delivery reviews 32：247-27，1998中找到开发基于皂苷的佐剂的描述。也参见sjolander等人,"uptake and adjuvant activity of orally delivered saponin and iscom vaccines",advanced drug delivery reviews 32:321-338,1998。
66.病毒体和病毒样颗粒(vlp)也可以用作佐剂。这些结构通常含有一种或多种来自病毒的蛋白质，任选地与磷脂组合或配制。它们通常是非致病性的、非复制性的并且通常不含有任何天然病毒基因组。病毒蛋白可以从整个病毒中重组产生或分离。这些适用于病毒
体或vlp的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(如ha或na)、乙型肝炎病毒(如核心或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头瘤病毒、hiv、rna-噬菌体、qb-噬菌体(如外壳蛋白)、ga-噬菌体、fr-噬菌体、ap205噬菌体和ty的蛋白(如逆转录转座子ty蛋白pl)。
67.可用作佐剂的细菌或微生物衍生物包括：(i)肠杆菌脂多糖(lps)的无毒衍生物；(ii)脂质衍生物，(iii)免疫刺激性寡核苷酸和adp-核糖基化毒素及其解毒衍生物，(iv)adp-核糖基化毒素及其解毒衍生物。lps单磷酰脂质a(mpl)和3-o-脱酰基mpl(3dmpl)的无毒衍生物的示例。3dmpl是具有4、5或6个酰化链的3de-o-酰化单磷酰基脂质a的混合物。ep 0 689 454中公开了3de-o-酰化单磷酰基脂质a的“小颗粒”形式的实例。这种3dmpl的“小颗粒”足够小，可以通过0.22微米的膜进行无菌过滤(参见ep 0 689454)。其他无毒lps衍生物包括单磷酰基脂质a模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸衍生物，例如rc-529(johnson等人，bioorg med chem lett,9:2273-2278,1999)。脂质a衍生物的实例可以包括来自大肠杆菌的脂质a衍生物，如om-174。om-174描述于例如meraldi等人,vaccine 21:2485-2491,2003；以及pajak等人,vaccine 21:836-842,2003中。免疫刺激性寡核苷酸序列的实例含有cpg基序(含有后跟鸟苷并通过磷酸键连接的未甲基化胞嘧啶的序列)。细菌双链rna或含有回文或多聚(dg)序列的寡核苷酸也已被证明具有免疫刺激性。
68.cpg可以包括核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰并且可以是双链或单链的。任选地，鸟苷可以用类似物如2
’‑
脱氧-7-脱氮鸟苷代替。类似物替换的实例参见kandimalla等人,"divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern:design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles",nucleic acids research 31:2393-2400,2003；wo02/26757和wo99/62923。cpg寡核苷酸的佐剂作用在krieg,nature medicine(2003)9(7):831-835；mccluskie等人，fems immunology and medical microbiology(2002)32:179-185；wo98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199中进一步讨论。cpg序列可以针对toll样受体(tlr9)，如基序gtcgtt或ttcgtt。参见kandimalla等人,"toll-like receptor 9:modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic cpg dnas",biochemical society transactions(2003)31(part 3):654-658。cpg序列可以特异性地诱导th1免疫应答，如cpg-aodn，或者其可以更特异性地诱导b细胞应答，如cpg-b odn。cpg-a和cpg-b odn在blackwell等人,j.immunol.170:4061-4068,2003；krieg,trends in immunology 23:64-65,2002以及wo01/95935中进行了讨论。在一些方面，可以构建cpg寡核苷酸，使得5’端可用于受体识别。任选地，两个cpg寡核苷酸序列可以连接在它们的3’端以形成“免疫聚体(immunomer)”。参见例如,kandimalla等人,bbrc306:948-95,2003；kandimalla等人,biochemical society transactions 31:664-658,2003；bhagat等人,"bbrc 300:853-861,2003以及wo03/035836。细菌adp-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。例如，毒素可以衍生自大肠杆菌(即大肠杆菌耐热肠毒素(lt))、霍乱(ct)或百日咳(ptx)。去毒的adp-核糖基化毒素作为粘膜佐剂描述于wo95/17211中，作为肠胃外佐剂描述于wo98/42375中。在一些方面，佐剂可以是解毒的lt突变体，如lt-k63、lt-r72和ltr192g。adp-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别是lt-k63和lt-r72，作为佐剂的用途可以在以下
参考文献中找到，这些文献中的每一个都通过整体引用具体并入本文：beignon等人,infection and immunity 70:3012-3019,2002；pizza等人,vaccine 19:2534-2541,2001；pizza等人,int.j.med.microbiol 290:455-461,2003；scharton-kersten等人,infection and immunity 68:5306-5313,2000；ryan等人,infection and immunity 67:6270-6280,2003；partidos等人,immunol.lett.67:09-216,1999；peppoloni等人,vaccines 2:285-293,2003；以及pine等人,j.control release 85:263-270,2002。
69.生物粘合剂和粘膜粘合剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂可以包括酯化透明质酸微球(singh等人，j.cont.rel.70:267-276,2001)或粘膜粘合剂，如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可以用作本发明中的佐剂，例如在wo99/27960中公开的。
70.佐剂微粒：微粒也可以用作佐剂。微粒(即直径约100nm至约150μm，或直径200nm至约30μm，或直径约500nm至约10μm的颗粒)由可生物降解和/或无毒的材料形成(例如，聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)，设想具有聚(丙交酯-共-乙交酯)的微粒，其任选地被处理以具有负电荷表面(例如，使用sds)或正电荷表面(例如，使用阳离子去污剂如ctab)。
71.适合用作佐剂的脂质体制剂的实例描述于美国专利号6,090,406、美国专利号5,916,588以及ep 0 626 169中。
72.另外的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。wo99/52549。此类制剂可进一步包括与辛苯聚醇组合的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(wo01/21207)以及与至少一种额外的非离子表面活性剂如辛苯聚醇组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(wo 01/21152)。在一些方面，聚氧乙烯醚可以包括：聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚或聚氧乙烯-23-月桂基醚。
73.用作佐剂的pcpp制剂描述于，例如andrianov等人,biomaterials 19:109-115,1998.1998中。适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的实例可以包括n-乙酰基-胞壁酰-l-苏氨酰-d-异谷氨酰胺(thr-mdp)、n-乙酰基-去甲胞壁酰-1-丙氨酰-d-异谷氨酰胺(nor-mdp))和n-乙酰胞壁酰-1-丙氨酰-d-异谷氨酰胺酰-1-丙氨酸-2-(1
’‑2’‑
二棕榈酰-s
‑‑
n-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺mtp-pe)。适合用作本发明佐剂的咪唑喹诺酮化合物的实例可以包括咪喹莫特及其同系物，进一步描述于stanley,"imiquimod and the imidazoquinolones:mechanism of action and therapeutic potential"clin exp dermatol 27:571-577,2002以及jones,"resiquimod 3m",curr opin investig drugs 4:214-218,2003中。适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂可以包括细胞因子，如白介素(例如，il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
74.佐剂组合：在一些优选的实施方案中，佐剂以组合的形式使用。例如，佐剂组合物可以包括：皂苷和水包油乳剂(wo99/11241)；皂苷(例如，qs21)+无毒的lps衍生物(例如，3dmpl)(参见wo94/00153)；皂苷(例如，qs21)+无毒的lps衍生物(例如，3dmpl)+胆固醇；皂苷(例如，qs21)+3dmpl+il-12(任选地+甾醇)(wo98/57659)；3dmpl与例如qs21和/或水包油乳剂的组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；saf，含有10％角鲨烷、0.4％
u s a,97(11):6108-13；zheng等人,j.virol.89(20):10273-85以及dauber等人,j.virol.,78(4):1865-1872(2004)中，其材料和方法通过引用并入本文。如公开申请号20190125858中公开的，生成缺失ns1编码区的流感病毒的方法在本文中概括和总结。
83.i.生成去除ns1基因编码区的活减毒流感病毒(laiv)
84.laiv可以如本文实施例中所公开的进行构建，本文公开的方法以ca04-delns1为例。简而言之，构建了ns1缺失质粒。ns1缺失质粒的构建：合适的病毒株，例如2009h1n1 a/加利福尼亚/04/09(ca04)可用作构建delns1疫苗株的骨架。无ns1表达的质粒可通过反向pcr构建，引物如下：ca04-delns1-529f:gacatacttatgaggatgtc(seq id no:3)；ca04-delns1-56f:ctgaaagcttgacatggtgttg(seq id no:4)。这些引物可用于通过在56-529处删除内含子的反向遗传程序从加利福尼亚(ca)/04/09株构建ca4-delns1病毒。
85.引物5
’‑
gacatactgtgaggatgtcaaaaatg-3＝(ns-529f)和5＝-ctgaaagcttgac acagtgtttgg-3’(ns-56r)可用于构建a/wsn/33-delns1和a/pr/8/34-delns1。
86.ns1缺失质粒可根据先前报告中描述的方案构建(garcia-sastre,j.virology 252:324
–
330,1998)；zheng等人,j virol 89:10273
–
10285(2015)。简而言之，进行反向pcr以删除插入phw2000载体中的ns基因的内含子，并使质粒磷酸化和自连接。对于点突变，可以使用商业试剂盒，例如quikchange ii定点诱变试剂盒(stratagene)。
87.a.ca-04-delns1病毒的拯救
88.将九个质粒：phw2000-ca04-pb2、phw2000-ca04-pb1、phw2000-ca04-pa、phw2000-ca04-np、phw2000-ca04-ha、phw2000-ca04-na、phw2000-ca04-m、phw2000-ca04-delns1和pcx-ca04-ns1混合于一管中。每种含量为1μg。用混合质粒的转染在铺板于6孔板中的80％汇合的293t细胞中进行。在转染过程中，旧培养基被替换为不含青霉素和链霉素的1ml opti-mem。十六小时后弃去上清液，加入2ml含1μg/ml胰蛋白酶的mem。转染七十小时后，去除细胞碎片后收集上清液。
89.b.delns1病毒的传代
90.可以将200微升拯救的delns1病毒注射到9至10日龄的受精卵中，并在37℃培养箱中培养48小时。收集鸡蛋尿囊液并测量ha滴度。通过以1500g离心10分钟去除血细胞和其他碎片。将上清液转移到millipore 100k超滤器中，以3000g的速度离心10分钟。向过滤器中加入pbs至10ml以洗涤浓缩的病毒，并将悬浮液再次以3000g离心10分钟。用200微升所得病毒制剂接种9至10日龄的受精卵，重复该过程直到病毒ha滴度显著增加。
91.拯救的delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒可以在任何产生病毒的细胞中培养，直到病毒滴度稳定为止，例如当病毒滴度在mdck细胞和鸡蛋中至少连续传代3代保持不变时所证明。收集72小时后来自转染细胞的上清液并在mdck细胞中传代。
92.用于传代的优选细胞是mdck(madin-darby犬肾)细胞。然而，用于使用培养基培养病毒的细胞可以是可以在合成培养基中体外生长并且可以用于病毒繁殖的细胞。这些可以是例如bsc-1细胞、llc-mk细胞、cv-1细胞、cho细胞、cos细胞、鼠细胞、人细胞、hela细胞、293细胞、vero细胞、mdbk细胞、mdok细胞、crfk细胞、raf细胞、tcmk细胞、llc-pk细胞、pk15细胞、wi-38细胞、mrc-5细胞、t-fly细胞、bhk细胞、sp2/0细胞、ns0、perc6(人视网膜细胞)、鸡胚细胞或其衍生物、含胚卵细胞、含胚鸡蛋或其衍生物。
93.用于生产病毒的培养基可以是现有技术中已知的适用于病毒培养的任何培养基。
优选地，培养基是合成培养基。这可以是例如基础培养基，如改良伊格尔培养基mem、最低限度必需培养基mem、杜尔贝科改良伊格尔培养基d-mem、d-mem-f12培养基、william's e培养基、rpmi培养基及其类似物和衍生物。这些也可以是特种细胞培养和病毒生长培养基，如vp-sfm、optipro
tm sfm、aim培养基、hyq sfm4 megavir
tm
、ex-cell
tm vero sfm、episerf、provero、任何293或cho培养基及其类似物和衍生物。这些培养基可以补充现有技术中已知的适用于细胞和病毒培养的任何添加剂，例如动物血清及其级分或类似物、氨基酸、生长因子、激素、缓冲液、微量元素、胰蛋白酶、丙酮酸钠、维生素、l-谷氨酰胺和生物缓冲液。优选的培养基是添加l-谷氨酰胺和胰蛋白酶的optipro
tm sfm。
94.因此，所公开的方法包括将病毒培养有效量的时间以获得稳定的病毒滴度。在优选的实施方案中，拯救的病毒在产生病毒的细胞例如mdck细胞中传代一段时间，直到病毒滴度连续3次传代保持不变。该培养期可以在10-50代的范围内，优选地在33℃下超过20代。培养的时间和条件导致适应性突变，其允许laivb在疫苗生产系统(如鸡蛋或mdck)中复制。delns1-sars-cov-2-rbd的实例可以在疫苗生产细胞系mdck细胞中复制，以用于测试的病毒株。
95.c.sars-cov-2-cov2ag质粒的构建
96.可以制备包含sars-cov-2抗原的质粒，如此处示例的sars-cov-2-rbd。
97.phw2000-sars-cov-2-rbd-nep质粒的构建
98.包含sars-cov-2-rbd的质粒可以采用美国公开申请号2019/0125858中针对phw2000-mers-rbd-nep质粒公开的方法制备。
99.简而言之，为了生成表达sars-cov-2受体结合结构域(rbd)的重组ns1缺失流感病毒，可以构建phw2000-sars-cov-2-rbd-nep质粒。其具有开放阅读框，由ns1 n端的ca04、sars-cov-2rbd结构域、ptv1-2a切割位点、具有突变的n端ns1序列的ca04 nep组成。
100.sars-cov-2-rbd-ptv1-2a的序列通过pcr扩增并通过使用外切核酸酶iii进行连接独立克隆而插入到仅含有ca04 nep开放阅读框的phw2000-ca04-delns1中。转化后，从正确的克隆中提取质粒并随后测序以确认序列。
101.d.delns1-sars-cov-2cov2ag嵌合病毒的拯救
102.delns1-sars-cov-2cov2ag嵌合病毒的拯救在本文中以ca04-delns1-rbd病毒为例。这些方法适用于使用其他laiv骨架拯救嵌合病毒，例如hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd。
103.ca04-delns1-rbd病毒的拯救
104.将九个质粒：phw2000-ca04-pb2、phw2000-ca04-pb1、phw2000-ca04-pa、phw2000-ca04-np、phw2000-ca04-ha、phw2000-ca04-na、phw2000-ca04-m、phw2000-sars-cov-2-rbd-nep和pcx-ca04-ns1(每种含量1μg)混合后用于转染6孔板中80％汇合的293t细胞。在转染过程中，用1ml不含抗生素的opti-mem替换旧培养基。十六小时后弃去上清液并加入2ml含有1μg/ml胰蛋白酶的mem。转染七十小时后，去除细胞碎片后收集上清液。将上清液注入9至10日龄的受精卵中，并在37℃下孵育48小时。收集鸡蛋尿囊液，并通过离心清除。然后在mdck细胞中通过噬斑测定对病毒进行测序和滴定。
105.iv.使用方法
106.所公开的delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒可用于在有需要的受试者中有效
增加病毒滴度或引发免疫应答。在一些方面，受试者可以包括老年人(例如，》65岁)、幼儿(例如，《5岁)。使用佐剂制剂改善儿童免疫应答的方法公开于例如美国公开2017/0202955。
107.delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒株通常可以直接施用于有需要的哺乳动物，以增加哺乳动物中的病毒滴度并引发免疫应答。在一些实施方案中，受试者是小于5岁的幼儿。在其他实施方案中，受试者是小于两岁的幼儿。在实施方案中，组合物经鼻内施用。在其他实施方案中，受试者是老年人，并且受试者可以在5至65岁之间。
108.病毒通常以药物组合物的形式施用于有需要的患者。含有病毒的药物组合物可用于全身或局部施用。可以配制通过肠胃外(肌肉内(im)、腹膜内(ip)、静脉内(iv)或皮下注射(sc))或经黏膜(鼻、阴道、肺或直肠)施用途径施用的剂型。在最优选的实施方案中，免疫病毒通过鼻内或肌肉注射在外周递送，而治疗性病毒通过局部注射递送。
109.直接递送可以通过肠胃外注射(例如，皮下、腹膜内、皮内、静脉内、肌内或至组织的间质空间)或通过黏膜，如通过直肠、经口(例如，片剂、喷雾剂)、阴道、局部、透皮(参见例如，wo99/27961)或经皮(参见例如，wo02/074244和wo02/064162)、吸入、鼻内(参见例如，wo03/028760)、眼、耳、肺或其他黏膜施用。组合物也可以通过直接转移到皮肤表面来局部施用。可以在不使用任何装置的情况下或通过使用绷带或绷带样装置将裸露的皮肤与组合物接触来完成局部施用(参见例如，美国专利号6,348,450)。在一些方面，施用方式是肠胃外、黏膜、或黏膜和肠胃外免疫的组合。在其他方面，施用方式是肠胃外、黏膜、或黏膜和肠胃外免疫的组合，间隔1-3周总共1-2次疫苗接种。在相关方面，施用途径包括但不限于鼻内递送。
110.1.有效量
111.通常以有效量施用组合物以诱导针对一种或多种由嵌合病毒编码的sars-cov-2抗原的免疫应答。例如，有效量的病毒通常会产生抗体和/或激活的t细胞，从而杀伤或限制sars-cov-2的增殖或感染。
112.组合物通常可用于引发全身和/或黏膜免疫，例如引发增强的全身和/或黏膜免疫。例如，免疫应答可以通过诱导血清igg和/或肠iga免疫应答来表征。通常，针对流感感染的保护水平可以超过50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一方面，保护水平可以是100％。
113.本发明诱导的免疫应答可以是th1免疫应答和th2应答中的一种或两种。免疫应答可以是改善的或增强的或改变的免疫应答。免疫应答可以是全身免疫应答和黏膜免疫应答中的一种或两种。例如，免疫应答可以是增强的全身和/或黏膜应答。增强的全身和/或黏膜免疫反映在增强的th1和/或th2免疫应答中。例如，增强的免疫应答可以包括igg1和/或igg2a和/或iga产生的增加。在另一方面，黏膜免疫应答可以是th2免疫应答。例如，黏膜免疫应答可以包括iga产生的增加。
114.通常，激活的th2细胞会增强抗体的产生，因此在应对细胞外感染方面很有价值。激活的th2细胞通常可以分泌il-4、il-5、il-6和il-10中的一种或多种。th2免疫应答还可以导致igg1、ige、iga和/或记忆b细胞的产生，以进行将来的保护。一般而言，th2免疫应答可以包括与th2免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如il-4、il-5、il-6和il-10)的增加，或igg1、ige、iga和记忆b细胞产生的增加中的一种或多种。例如，增强的th2免疫应答可以包括igg1产生的增加。th1免疫应答可以包括以下一项或多项：ctl的增加、一种或多种与
th1免疫应答相关的细胞因子(如il-2、ifn-γ和tnf-α)的增加、激活的巨噬细胞的增加、nk活性的增加或igg2a产生的增加。例如，增强的th1免疫应答可以包括igg2a产生的增加。
115.delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒株可以单独使用，也可以与其他药剂联合使用，任选地与能够引发th1和/或th2应答的免疫调节剂一起使用。
116.2.剂量
117.精确剂量将根据多种因素而变化，如受试者相关变量(例如年龄、免疫系统健康等)和待治疗的受试者的年龄。考虑到接受者的治疗背景、年龄和一般健康状况，本领域技术人员可以确定合适的剂量。选择的剂量取决于期望的治疗效果、施用途径和期望治疗的持续时间。在确定用于预防施用的病毒的有效量时，医生可以评估病毒的循环血浆水平和/或针对抗原的现有抗体的产生。活性病毒也可以用噬斑形成单位(pfu)来衡量。噬斑形成单位可以定义为单层细胞培养中的细胞裂解区域(cpe)，在覆盖条件下由单个病毒颗粒感染引发。通常，将102和10
12
pfu之间的病毒剂量水平施用于人体。在不同的实施方案中，剂量范围为104至10
10
pfu、105至109pfu、106至108pfu或这些所述范围内的任何剂量。当要施用多于一种疫苗(即，联合疫苗)时，每种疫苗试剂的量可以在它们所描述的范围内。
118.病毒通常以液体混悬液的形式施用，体积在10μl至100μl之间，具体取决于施用途径。常用的疫苗体积范围为0.1ml至0.5ml。通常，与全身施用或输注相比，局部注射的剂量和体积会更低。
119.疫苗组合物可以单剂量或多剂量形式施用。疫苗可以在施用前数小时或数天与佐剂一起制备，适应于稳定缓冲液和合适的佐剂组合物的确定。通常，以多剂量局部施用的剂量将为100μl，而通过皮下、肌肉内、器官内、静脉内或鼻内施用的全身或区域施用可以是例如10至100μl。
120.v.试剂盒
121.还提供了包括公开的delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒株的试剂盒。该试剂盒可以包括含有合适的载剂、稀释剂或赋形剂的单独容器。此外，该试剂盒可以包括混合或组合成分和/或施用的说明。
122.组合物可以是液体形式或可以冻干。用于组合物的合适容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料(包括玻璃或塑料)制成。容器可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。
123.试剂盒可以进一步包括包含药学上可接受的缓冲液的第二容器，缓冲液如磷酸盐缓冲液、林格氏溶液或右旋糖溶液。其还可以含有对最终用户有用的其他材料，包括其他药学上可接受的配制溶液，如缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、和注射器或其他递送装置。试剂盒可以进一步包括包含佐剂的第三组分。
124.试剂盒还可以包括含有诱导免疫、预防感染或治疗感染的方法的书面说明的包装插页。包装插页可以是未经批准的包装插页草案，或者可以是食品和药物管理局(fda)或其他监管机构批准的包装插页。
125.本发明还提供了预填充有本发明组合物的递送装置。
126.组合物通常被配制成无菌的、基本等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(gmp)规定。
127.通过以下编号的段落可以进一步理解所公开的组合物和方法。
128.1.活减毒嵌合病毒，其包含(a)流感病毒基因组，其中所述流感病毒基因组包含毒力因子活性的缺失，和任选地，在缺乏所述毒力因子活性的情况下赋予在37℃下复制的第一组的一个或多个突变；和赋予在低于35℃的温度下复制的第二组的一个或多个突变，和(b)编码一种或多种sars-cov-2抗原(cov2ag)的一个或多个基因的插入。
129.2.段落1的减毒嵌合病毒，其中所述流感病毒基因组来自甲型流感病毒亚型h1n1或h3n2。
130.3.段落2的减毒嵌合病毒，其中所述流感病毒基因组来自选自下组的甲型流感病毒亚型h1n1或h3n2毒株：ca04(a/加利福尼亚/04/2009)；hk68(毒株a/香港/1/68)、4801(h3n2 a/hk/4801/2014)、h1n1(2019)；a/wsn/33和a/pr/8/34。
131.4.段落1-3中任一项的减毒嵌合病毒，其中所述毒力因子活性的缺失包括毒力因子基因的至少部分的缺失。
132.5.段落1-4中任一项的嵌合病毒，其中所述缺失包括延伸超出所述突变病毒的ns1区段的核苷酸57至528的非结构蛋白1(ns1)基因的至少部分的缺失。
133.6.段落1-5中任一项的嵌合病毒，其包含第一组的一个或多个突变，其中所述第一组的一个或多个突变包含赋予复制能力的第一组的一个或多个点突变。
134.7.段落1-5中任一项的嵌合病毒，其中所述第一组的一个或多个点突变位于突变流感病毒的m区之外。
135.8.段落3的嵌合病毒，其中所述流感病毒基因组来自a/加利福尼亚/04/2009流感毒株，并且所述第一组的一个或多个点突变中的至少一个是病毒基因组中的g346a突变。
136.9.段落1-8中任一项的嵌合病毒，其中与所述病毒在33℃下在mdck细胞中的复制相比，所述病毒在37℃下在所述mdck细胞中的复制较差。
137.10.段落1-7中任一项的嵌合病毒，其中所述第二组的一个或多个突变包含第二组的一个或多个点突变。
138.11.段落3的嵌合病毒，其中所述第一组的一个或多个突变包含在病毒rna的m区段的3’非编码区中的a14u替换。
139.12.段落1-9中任一项的嵌合病毒，其中所述第二组的一个或多个点突变中的至少一个成员选自流感病毒基因组中的t261g和a310g突变。
140.13.段落12的嵌合病毒，其包含赋予在低于35℃的温度下复制的第三组的一个或多个突变。
141.14.段落12的嵌合病毒，其中所述第三组的一个或多个突变包含与所述第二组的一个或多个点突变不同的第三组的一个或多个点突变，并且选自h1n1流感病毒基因组中的t261g和a310g突变。
142.15.段落1-13中任一项的嵌合病毒，其中所述一种或多种cov2ag是sar-cov-2受体结合结构域(rbd)。
143.16.段落1-15任一项的嵌合病毒，其选自ca04-delns1-sars-cov-2-rbd；hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd。
144.17.药物组合物，其包含有效量的段落1-16中任一项的嵌合病毒。
145.18.段落17的组合物，其进一步包含佐剂。
146.19.段落17或18中任一项的组合物，其适合经鼻施用。
147.20.在有需要的受试者中增加对sars-cov-2的免疫应答的方法，其包括向受试者施用段落1-13中任一项的组合物。
实施例
148.材料和方法
149.细胞和病毒
150.所有细胞系均从atcc获得。将人细胞维持在补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素(life technologies)的杜尔贝科基本必需培养基(dmem)中。将mdck细胞在添加有等量血清和抗生素的伊格尔基本必需培养基(mem)中培养。ca04-delns1 laiv根据本文和之前报道中描述的方案进行构建和拯救(wang等人,mbio,10(5):e02180-19(2019))。将病毒基因片段扩增并克隆到phw2000质粒中，得到八个phw2000质粒，将其转染到293t/mdck细胞混合物中。在mdck细胞或含胚鸡蛋中扩增拯救的病毒。ca04-delns1 laiv用作制备其他delns1-sars-cov-rbd laiv的骨架。
151.质粒的构建
152.质粒的构建遵循wang等人,mbio,10(5):e02180-19(2019)中描述的方案。如前所述构建ns1缺失质粒phw2000-delns1(zheng等人,j.virol.,89:10273-10285(2015))。使用质粒phw2000-ca04-ns(甲型流感病毒)进行反向pcr以删除ns1基因。然后使用标准方案对pcr产物进行凝胶纯化、磷酸化和自连接。ca04-dens1反向pcr的引物是5
’‑
gacatacttatgaggatgtc-3’(seq id no:3)(ca04-delns1-f)和5
’‑
ctgaaagcttgacatggtgttg-3’(seq id no:4)(ca04-delns1-r)(wang等人，mbio，10(5)：e02180-19(2019)。quikchange ii定点诱变试剂盒(agilent)用于生成点突变。通过将sars-cov-2的rbd区域克隆到ca04-delns1的缺失ns1的位点来制备phw2000-ca4-delns1-sars-cov2-rbd。在rbd和nep编码区之间插入蛋白酶切割基序2a(图1)。
153.hk68-delns1-sars-cov-2-rbd使用ca04-delns1的骨架与衍生自a/hk/01/1968(h3n2)的血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)构建。同样地，hk4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd在ca04-delns1的内部基因骨架中构建，其中ha和na衍生自毒株a/hk/4801/2014(h3n2)或a/hk/2019(h1n1)。
154.delns1病毒的生成和传代
155.将含有delns1片段和其他7个流感病毒基因组片段的八个phw2000质粒与ns1表达质粒一起转染到293t/mdck细胞混合物中并孵育过夜。去除dna混合物并添加补充有1μg/ml n-甲苯磺酰基-l-苯丙氨酸氯甲基酮(tpck)处理的胰蛋白酶(sigma)的mem。72小时后收集病毒上清液并指定为第0代(p0)病毒，随后在mdck细胞或含胚鸡蛋中传代。对于ca04-delns1病毒，拯救的病毒在37℃下在mdck细胞中传代10次，然后在30℃下再传代10次。ca04-delns1-sars-cov-2-rbd、hk68-delns1-sars-cov-2-rbd、hk4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd与上述类似地拯救和传代。
156.对于所有delns1-sars-cov-2rna laiv病毒，通过逆转录-pcr(rt-pcr)和测序证实了rbd的插入和ns1基因的缺失。
157.rt-pcr
158.delns1-ncov-rbd疫苗株中ns片段和rbd插入的验证
159.从delns1疫苗株(ca04-delns-sars-cov-2-rbd(本文也称为ca04-delns-ncov-rbd)、hk68-delns1-sars-cov-2-rbd(本文也称为hk68-delns1-ncov-rbd)、4801-delns1-sars-cov-2-rbd(本文也称为4801-delns1-ncov-rbd)和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd(本文也称为h1n1(2019)-delns1-ncov-rbd)中提取rna，随后在鸡蛋中传代。使用对sars-cov-2(本文也称为ncov)的ns片段和rbd特异的引物进行rt-pcr，并通过琼脂糖电泳分析pcr产物。从所有delns1疫苗株中观察到正确大小的pcr产物、ns和rbd。
160.验证delns1-ncov-rbd活减毒病毒感染的mdck细胞中sars-cov-2(ncov)rbd的表达。mdck细胞以0.1moi的ca04-delns-ncov-rbd、hk68-delns1-ncov-rbd、4801-delns1-ncov-rbd或h1n1(2019)-delns1-ncov-rbd感染，或模拟感染16小时。收获细胞裂解物并使用抗-np(对于病毒蛋白np)或抗-v5(对于用v5表位标记的rbd)通过蛋白质印迹进行分析。如结果所示，所有delns1疫苗株均表达rbd。
161.动物研究
162.将两组(每组六只)六至八周龄的雌性dpp4转基因小鼠麻醉，然后用含有5x105tcid
50
的mers-rbd-delns1、delns1-mers-n或对照(仅pbs)的25μl pbs分别鼻内接种两次，间隔四周。用mers冠状病毒攻击小鼠(500pfu＝10mld
50
；或100pfu＝2mld
50
)。监测小鼠的体重减轻和死亡率14天。
163.实施例1.delns1-mers-rbd和delns1-mers-n laiv疫苗株的构建
164.为了概念验证，将含有衍生自mers冠状病毒的rbd和n的基因片段克隆到ca04-delns1 laiv的ns片段中(wang等人,mbio 10(5):e12180-19(2019).)(图1a-b)。mers冠状病毒的受体结合结构域(rbd)的序列如图4a所示。
165.实施例2.经接种的dpp4转基因小鼠对mers冠状病毒致死性攻击(2mld
50
)的保护
166.表达人dpp4受体的转基因小鼠分别用delns1-mers-rbd、delns1-mers-n或对照(pbs)初次免疫两次，间隔四周。然后用致死剂量的mers冠状病毒(100pfu＝2mld
50
)攻击免疫的小鼠。监测小鼠的体重减轻和死亡率14天。数据显示在图2a和2b中。
167.实施例3.经接种的dpp4转基因小鼠对mers冠状病毒致死性攻击(10mld
50
)的保护
168.表达人dpp4受体的转基因小鼠分别用delns1-mers-rbd laiv、delns1-mers-n laiv或delns1 laiv初次免疫两次，间隔四周。然后用致死剂量的mers冠状病毒(500pfu＝10mld
50
)攻击免疫的小鼠。监测小鼠的体重减轻和死亡率14天。
169.数据显示在图3a和3b中。
170.实施例4.新型冠状病毒2019(sars-cov-2)在delns1 laiv载体中的克隆
171.sars-cov-2的受体结合结构域的序列显示在图4b中。
172.将含有来自sars-cov-2的rbd的基因片段克隆到ca04-delns1 laiv的ns片段中(wang等人,mbio 10(5):e12180-19(2019))，如图5所示。delns1-sars-cov-2-rbd疫苗株中ns片段和rbd插入的验证如图6所示。在鸡蛋中传代后，从delns1疫苗株ca04-delns-sars-cov-2-rbd、hk68-delns1-sars-cov-2-rbd、4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd中提取rna。使用对sars-cov-2的ns片段和rbd特异的引物进行rt-pcr，并通过琼脂糖电泳分析pcr产物。从所有delns1疫苗株中观察到正确大小的pcr产物、ns和rbd。
173.实施例5.sars-cov-2rbd在delns1-sars-cov-2-rbd活减毒病毒感染的mdck细胞中的表达
174.mdck细胞以0.1moi的ca04-delns-sars-cov-2-rbd、hk68-delns1-sars-cov-2-rbd、4801-delns1-sars-cov-2-rbd或h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd感染，或模拟感染16小时。收获细胞裂解物并使用抗-np(对于病毒蛋白np)或抗-v5(对于用v5表位标记的rbd)通过蛋白质印迹进行分析。结果表明，所有delns1疫苗株均表达rbd(图7)。
175.实施例6.保护ace2转基因小鼠免受sars-cov-2感染引起的疾病
176.向ace2转基因小鼠接种ca04-delns-sars-cov-2-rbd laiv一次或两次(相隔三周)。最后一次接种疫苗后三周，用1x10
5 tcid50的sars-cov-2或pbs(对照)对小鼠进行攻击。在病毒攻击后观察小鼠的体重变化(图8)。用ca04-delns-sars-cov-2-rbd laiv免疫的小鼠表现出较少的体重减轻(一剂)或没有体重减轻并在感染后三天体重增加(两剂)。
177.应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
178.必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个适体”包括多个这样的适体，提及“该适体”是提及本领域技术人员已知的一个或多个适体及其等同物，等等。
179.在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包含”和词语的变体，如“包括”和“含有”，意思是“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其他添加剂、成分、整数或步骤。
[0180]“任选”或“任选地”是指随后描述的事件、情况或材料可能会或可能不会发生或存在，并且描述包括事件、情况或材料发生或存在的实例以及不发生或不存在的实例。
[0181]
范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，除非上下文另有明确说明，否则还具体考虑和认为公开从一个特定值和/或到另一个特定值的范围。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一个具体考虑的实施方案，除非上下文另有明确说明，否则该实施方案应被视为公开。将进一步理解，每个范围的端点都显著相关于另一个端点且独立于另一个端点，除非上下文另有明确说明。应当理解，包含在明确公开的范围内的所有单个值和值的子范围也被具体考虑并且应该被认为是公开的，除非上下文另有明确说明。最后，应当理解，所有范围都将所列举的范围称为范围和从包括第一端点到包括第二端点的各个数字的集合。在后一种情况下，应当理解，可以选择任何单个数字作为该范围所指的数量、值或特征的一种形式。以这种方式，范围描述了从(包括)第一端点到(包括)第二端点的一组数字或值，从中可以选择集合的单个成员(即单个数字)作为范围所指的数量、值或特征。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施方案中的一些或全部，上述内容都适用。
[0182]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本方法和组合物的实践或测试，但特别有用的方法、装置和材料如所述。本文引用的出版物及其所引用的材料在此通过引用具体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类公开。不承认任何参考构成现有技术。参考文献的讨论说明了作者的主张，申请人保留质疑引用文件的准确性和相关性的权
利。将清楚地理解，尽管本文提到了许多出版物，但这种参考并不构成承认这些文件中的任何一个构成本领域公知常识的一部分。
[0183]
尽管对材料、组合物、成分、步骤、技术等的描述可以包括许多选项和替代方案，但这不应被解释为也不是承认此类选项和替代方案彼此等价，或者尤其是显而易见的选择。因此，例如不同部分的列表并不表明列出的部分彼此之间是显而易见的，也不是对等价或显而易见性的承认。