化合物和其药学用途1.相关申请的交叉引用2.本技术要求于2020年2月8日提交的美国临时专利申请第62/971,972号、于2020年2月15日提交的美国临时专利申请第62/977,219号、和于2020年4月23日提交的美国临时专利申请第63/014,448号以及于2020年9月8日提交的美国专利申请第17/014,774号的优先权的权益，所述专利申请中的每个专利申请特此通过引用整体并入。
背景技术：
：：3.病毒是一种仅在宿主生物体的活细胞内复制的小型感染原。病毒可以感染所有类型的生命形式，从动物和植物到微生物，包含细菌和古细菌。虽然不在受感染的细胞内或在感染细胞的过程中，但病毒以独立颗粒或病毒粒子的形式存在，由以下组成：(i)遗传物质，即编码病毒所作用的蛋白质结构的dna或rna长分子；(ii)蛋白外壳，衣壳，其可以包围和保护遗传物质；以及在某些情况下的(iii)脂质外包膜。4.抗病毒药物是一类旨在治疗病毒感染的药物。由于人体能够通过自身免疫力抵抗大多数病毒，这些药物靶向一些特定的致命的和危及生命的疾病，所述疾病要么是身体自身无法抵抗的，要么是难以战胜的。研究人员致力于开发抗病毒药物的“合理的药物设计”策略，这试图在病毒生命周期的每个阶段(例如，在进入细胞前、进入抑制、脱壳抑制)，即在病毒合成、组装和释放阶段期间攻击病毒。5.冠状病毒，作为冠状病毒科和冠状病毒亚科的成员，是一种含有长度在26个到32个千碱基的范围内的单链正义rna基因组的包膜病毒。已在包含鸟类、蝙蝠、猪、啮齿动物、骆驼和人在内的若干种脊椎动物宿主中鉴定了冠状病毒。人可以从其它哺乳动物宿主获取冠状病毒。人冠状病毒感染是人上呼吸道有害疾病的主要原因之一。除了编码结构蛋白之外，冠状病毒基因组的大部分被转录并被翻译成多蛋白，所述多蛋白编码对病毒复制和基因表达必不可少的蛋白质。功能性多肽通过大量的蛋白水解加工从多蛋白中释放出来，这是冠状病毒生命周期的关键步骤之一。在不进行蛋白水解的情况下，病毒就无法包装。这主要是通过33.1-kda主蛋白酶(mpro)实现的，其也被称为3c样蛋白酶(3clpro)。6.冠状病毒科的成员包含具有不同系统发育起源(thelancet.com；doi.org/10.1016/s0140-6736(20)30251-8)和导致不同程度的死亡率和发病率的病毒株。如此，对冠状病毒感染的治疗因引起感染的特定毒株而异。目前为止，还没有经批准的用于治疗任何冠状病毒的抗病毒药物。由于关键残基的保守性和其功能重要性，认为3clpro可以作为设计普遍存在的抗冠状病毒感染药物的重要靶标。技术实现要素：7.本公开基于意外的观察结果，即具有本文所描述的式(i)结构的示例性化合物成功地抑制了sars-cov-2的3clpro蛋白酶活性，并抑制了细胞中的sars-cov-2复制。进一步地，观察到与具有少量没食子酰基部分的式(i)化合物相比，具有大量没食子酰基部分的式(i)化合物显示出更好的针对sars-cov-2的3clpro的抑制活性。此外，示例性式(i)化合物(例如，snb01)在口服施用于动物模型中后显示存在于肺组织中。本文所报告的所有发现表明，式(i)化合物将预期有效抑制如sars-cov-2等冠状病毒，并且因此缓解由冠状病毒感染造成的病状。8.因此，本公开的一个方面的特征在于一种抑制冠状病毒和/或治疗冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括一种或多种式(i)化合物：[0009][0010]或其药学上可接受的盐。在式(i)中：[0011]环x是5元或6元单环，所述单环任选地具有选自由n、o、p和s组成的组的一个或两个杂原子；[0012]r1、r2、r3、r4、r5和r6中的至少一个独立地具有下式：[0013]并且剩余r1、r2、r3、r4、r5和r6各自独立地选自由以下组成的组：[0014]、-oh、-cooh、cooh、以及不存在；[0015]n和o独立地为0或1；[0016]m和p独立地为1、2、3、4或5。[0017]所述式(i)化合物具有2个到35个没食子酰基部分，包含端值。[0018]在一些实施例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6可以未经取代。在其它实施例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6可以被1个、2个、3个、4个或5个取代基取代。示例性取代基包含但不限于c1-3烷基、卤素、-cf3、-cn、-no2、-sh、-oh、-s(c1-3烷基),-nh2、nh(c1-3烷基)、n(c1-3烷基)2和-o(c1-3烷基)。在其它实施例中，一个或多个r1、r2、r3、r4、r5和r6可以不存在。r1、r2、r3、r4、r5和r6中的至少一个存在。[0019]在一些实施例中，环x是6元单环，所述单环任选地具有n、o、p和/或s中的一个或两个杂原子。在一些实例中，环x是具有一个杂原子，例如n、o、p或s的6元单环。在具体实例中，环x的所述杂原子为o。在其它实例中，环x可以是具有两个杂原子的6元单环，所述杂原子可以是n、o、p或s。所述两个杂原子可以相同。可替代地，所述两个杂原子可以不同。[0020]在一些实施例中，环x是5元单环，所述单环任选地具有n、o、p和/或s中的一个或两个杂原子。在一些实例中，环x是具有一个杂原子，例如n、o、p或s的5元单环。在具体实例中，环x的所述杂原子为o。在其它实例中，环x可以是具有两个杂原子的5元单环，所述杂原子可以是n、o、p或s。所述两个杂原子可以相同。可替代地，所述两个杂原子可以不同。[0021]在一些实例中，环x是在一些实例中，环x是在一些实例中，环x是[0022]在一些实施例中，r1、r2、r3、r4、r5和r6中的每一个可以独立地具有下式：[0023][0024][0025]在一些实施例中，所述式(i)化合物具有(ia)结构，其中r1、r2、r3、r4、r5和r6中的每一个可以独立地具有下式：[0026][0027]其中n、m、o和p如本文所定义。在一些实例中，所述式(ia)化合物可以具有(ib)结构。示例性化合物包含但不限于α5g、β5g、α10g、β10g、α15g、β15g、α20g、β20g、α25g或β25g。[0028]在一些实施例中，所述式(i)化合物具有结构，其中r1、r2、r3、r4、r5和r6中的每一个可以独立地具有下式：[0029][0030]n、m、o和p如本文所定义。[0031]在一些实施例中，所述式(i)化合物可以具有结构其中r1可以为为为并且r2可以为-cooh或示例性化合物包含苯酚3g、苯酚5g、苯酚7g、化合物14、化合物18和化合物149。[0032]在一些实施例中，所述式(i)化合物可以具有结构(例如，(ie-1))，其中r1、r2和r3中至少一个为中至少一个为中至少一个为并且剩余r1、r2和r3各自独立地为各自独立地为示例性化合物包含间苯三酚6g、间苯三酚9g、间苯三酚12g、间苯三酚15g、间苯三酚21g或化合物103。[0033]在一些实施例中，所述式(i)化合物可以具有结构，其中r1和r2中的每一个独立地为每一个独立地为示例性化合物包含间苯二酚10g或间苯二酚14g。[0034]在一些实施例中，所述式(i)化合物可以具有结构，其中r1、r2、r3和r4中的每一个独立地为独立地为独立地为示例性化合物包含化合物117、119、121、123、126或128。[0035]在一些实施例中，所述式(i)化合物可以具有结构，其中r1、r2、r3和r4中的每一个独立地为示例性化合物包含化合物134、136、138、140、142、144、146或148。[0036]在一些实施例中，用于本文所公开的任何方法的所述组合物可以包括式(i)化合物的混合物，其中每个混合物含有2个到35个(例如，4个到35个)没食子酰基部分。[0037]在一些实施例中，所述组合物中约1-25％的所述式(i)化合物具有5个没食子酰基部分。可替代地或者另外地，所述组合物中约10-40％的所述式(i)化合物具有6-7个没食子酰基部分。可替代地或者另外地，所述组合物中约20-85％的所述式(i)化合物具有8-12个没食子酰基部分。[0038]在一些实施例中，用于本文所公开的任何方法的所述组合物可以包括式(i)化合物的基本上同质群体。在式(i)化合物的此基本上同质群体中，大多数式(i)化合物是相同的，即具有相同数量的没食子酰基部分，所述数量在2个-35个的范围内，包含端值。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有5个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有6个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有7个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有8个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有9个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有10个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有11个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有12个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有13个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有14个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有15个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有16个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有17个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有18个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有19个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有20个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有21个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有22个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有23个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有24个没食子酰基部分。在一些实例中，所述基本上同质群体中大多数式(i)化合物具有25个没食子酰基部分。在一些实例中，基本上同质群体中大多数式(i)化合物中具有数量在26-30个范围内的没食子酰基部分。在一些实例中，基本上同质群体中大多数式(i)化合物中具有数量在31-35个范围内的没食子酰基部分。[0039]在一些实施例中，所述式(i)化合物为并且r1、r2、r3、r4和r5中没有一个不存在(即，都存在)。在一些实例中，用于本文所公开的任何方法的所述组合物中约1-25％的式(ia)化合物具有5个没食子酰基部分。可替代地或者另外地，所述组合物中约10-40％的所述式(ia)化合物具有6-7个没食子酰基部分。可替代地或者另外地，所述组合物中约20-85％的所述式(ia)化合物具有8-12个没食子酰基部分。[0040]在一些实施例中，用于本文所公开的任何方法的所述组合物中的所述式(i)化合物具有如本文所公开的式(i)(ia)结构。在此类组合物中，约1-8％的所述式(ia)化合物具有5个没食子酰基部分，约15-35％的所述式(ia)化合物具有6-7个没食子酰基部分，并且约60-80％的所述式(ia)化合物具有8-12个没食子酰基部分。[0041]在一些实施例中，用于本文所公开的任何方法的所述组合物可以为营养保健组合物。在一些实施例中，所述组合物可以为保健食品。在一些实施例中，所述组合物可以为医疗食品。在其它实施例中，所述组合物可以是药物组合物。本文所公开的任何组合物都可以放置在医疗装置中。实例包含但不限于用于施用于所述受试者的吸入器、雾化器、鼻喷雾剂和汽化气溶胶装置。[0042]在一些实施例中，所述冠状病毒感染是由冠状病毒引起的感染。实例包含sars-cov-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、229eα冠状病毒、nl63α冠状病毒、oc43β冠状病毒和hku1β冠状病毒。在具体实例中，所述冠状病毒为sars-cov-2。[0043]在一些实施例中，所述化合物或所述组合物通过口服施用、通过注射、通过局部施用或通过吸入施用于所述受试者。[0044]在一些实施例中，所述受试者是人受试者。在一些实施例中，连续地或以每五分钟一次到每三个月一次的频率向所述受试者施用所述组合物。在一些实施例中，在用一种或多种另外的抗病毒剂的同时、在用其之前或之后治疗所述人受试者。[0045]在一些实施例中，所述一种或多种另外的抗病毒剂可以包括病毒进入抑制剂、病毒脱壳抑制剂、病毒逆转录酶抑制剂、病毒蛋白合成抑制剂、病毒蛋白酶抑制剂、病毒聚合酶抑制剂、病毒整合酶抑制剂、干扰素或其组合。[0046]示例性病毒进入抑制剂包含但不限于马拉韦罗(maraviroc)、恩夫韦地(maraviroc)、伊巴珠单抗(ibalizumab)、福斯特沙韦(fostemsavir)、普乐沙福(plerixafor)、表没食子儿茶素没食子酸酯、韦克利韦洛克(vicriviroc)、阿拉韦罗(aplaviroc)、马拉韦罗、曲金刚胺、硝唑尼特(nitazoxanide)、乌米那韦(umifenovir)和普达菲洛(umifenovir)。[0047]示例性病毒脱壳抑制剂包含但不限于金刚烷胺、金刚乙胺和普拉康纳利(pleconaril)。[0048]示例性病毒逆转录酶抑制剂包含但不限于齐夫多定(zidovudine)、地达诺新(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩替卡韦(entecavir)、特鲁瓦达(truvada)、奈韦拉平(nevirapine)、雷特格韦(raltegravir)和替诺福韦酯(tenofovirdisoproxil)。[0049]示例性病毒蛋白酶抑制剂包含但不限于膦沙那韦(fosamprenavir)、利托那韦(ritonavir)、阿扎那韦(atazanavir)、奈非那韦(nelfinavir)、茚地那韦(indinavir)、沙奎那韦(saquinavir)、沙奎那韦、泛昔洛韦(famciclovir)、福米韦森(fomivirsen)、洛匹那韦(lopinavir)、利巴韦林(ribavirin)、达鲁那韦(darunavir)、奥司他韦(oseltamivir)和替拉那韦(tipranavir)。示例性[0050]病毒聚合酶抑制剂包含但不限于鹅膏毒素、利福霉素、阿糖胞苷、非达霉素、万寿菊菌毒素(tagetitoxin)、膦甲酸钠、碘苷、喷昔洛韦(penciclovir)、索非布韦(sofosbuvir)、三氟尿苷、伐昔洛韦(valacyclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、阿糖腺苷和瑞德西韦(remdesivir)。[0051]示例性病毒整合酶抑制剂包含但不限于拉替拉韦(raltegarvir)、埃替拉韦(elvitegravir)、度鲁特韦(dolutegravir)、比克替拉韦(bictegravir)和卡博特韦(cabotegravir)。[0052]示例性干扰素包含但不限于i型干扰素、ii型干扰素、iii型干扰素和聚乙二醇干扰素α-2a。[0053]在其它方面，本公开提供了一种用于治疗冠状病毒感染的气溶胶分配器。所述气溶胶分配器可以包括容器，在所述容器中放置包括本文所公开的所述式(i)化合物中的任一种或所述式(i)化合物的所述混合物的组合物。所述式(i)化合物或其混合物悬浮于液体推进剂中。示例性气溶胶分配器包含但不限于吸入器、雾化器、鼻喷雾剂或汽化气溶胶装置。在一些实施例中，所述组合物包括微粒，所述微粒包括所述一种或多种式(i)化合物，并且任选地其中所述微粒的质量中值直径(d50)为约1μm到5μm。[0054]在本公开的范围内，还包括如本文所公开的用于抑制冠状病毒和/或治疗冠状病毒感染(例如，由sars-cov-2引起的感染)的包括一种或多种式(i)化合物的组合物，以及用于制造用于治疗所述冠状病毒感染的药物的此类组合物。[0055]在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点从以下附图和若干个实施例的详细说明以及还从所附权利要求书中将变得显而易见。附图说明[0056]图1是示出在3μm浓度下2019-ncov3clpro响应于示例性式(i)化合物的蛋白酶活性的图表。[0057]图2示出了在1μm浓度下示例性式(i)化合物针对2019-ncov3clpro的抑制活性。[0058]图3示出了在如指示的不同浓度下snb01对sars-cov-2的3clpro的抑制作用。将snb01(1-30μm)与3clpro(1μm)和荧光肽底物(dabcyl-tsavlqsgfrkm-edans，10μm)在37℃下一起温育，然后通过流动相为0.1％三氟乙酸和乙腈的c18柱进行hplc分离。通过510nm处的uv吸光度检测到两个蛋白水解片段(如箭头所示)。观察到剂量依赖性抑制模式。[0059]图4示出了snb01对sars-cov-2的3cl蛋白酶活性的抑制。每个数据表示如通过荧光酶促测定测量的snb01对3clpro的抑制的平均百分比。应用通过graphpad7.0拟合的可变斜率、四个参数、s型模型来测定ic50。[0060]图5示出了snb01在补充有10％fbs的dmem中培养并温育24小时的veroe6细胞中的细胞毒性。发现cc50为大约210.60μm。[0061]图6示出了snb01在补充有2％fbs的dmem中培养并温育24小时的veroe6细胞中的细胞毒性。dmso媒剂的最终浓度为1％(v/v)。发现cc50为大约52.460μm。[0062]图7a和7b包含示出如在veroe6细胞系统的上清液中测定的snb01相对于瑞德西韦针对sars-cov-2感染的抑制活性的图。图7a：示出snb01的抑制活性的图表。ec50＝0.585μm；ec90＝8.307μm；ec99＝12.900μm的snb01。图7b：示出瑞德西韦(左)和ec99＝15.000μm的抑制活性的图表。ec50、ec90和ec99使用非对称(五参数)逻辑剂量应答曲线从非线性回归中进行内插，如下文实例7中所描述。[0063]图8a和8b示出了如在veroe6细胞系统的细胞层中观察到的snb01相对于瑞德西韦针对sars-cov-2的抑制活性。图8a：示出snb01的抑制活性的图表。ec50＝0.515μm；ec90＝10.540μm；ec99＝19.130μm。图8b：示出瑞德西韦的抑制活性的图表。ec99＝15.000μm。ec50、ec90和ec99使用非对称(五参数)逻辑剂量应答曲线从非线性回归中进行内插，如下文实例7中所描述。[0064]图9示出了snb01和sars-cov-2病毒3clpro的非变性page(native-page)。3clpro显示出多于一个条带(最右侧泳道)。在复合之后，条带以snb01依赖性方式变得模糊，其中snb01含量越高，复合物的迁移率越高(左边五个泳道)。[0065]图10示出了β-10g和sars-cov-2病毒3clpro的非变性page。3clpro和β-10g的复合影响了其迁移率。随着β-10g含量的增加，条带以剂量依赖性方式偏移。[0066]图11示出了β-15g和sars-cov-2病毒3clpro的非变性page。3clpro和β-15g的复合影响了其迁移率。随着β-15g含量的增加，条带以剂量依赖性方式偏移。[0067]图12示出了没食子酸和sars-cov-2病毒3clpro的非变性page。3clpro的条带未发生偏移，这表明其未与没食子酸(ga)复合。[0068]图13示出了通过itc分析的snb01与sars-cov-2病毒3clpro之间的相互作用。上图示出了量热数据。下图揭示了热量积分随snb01/3clpro摩尔比的变化。[0069]图14示出了snb01处理的小鼠的体重变化。小鼠接受每天口服施用snb01或双蒸馏水作为媒剂对照，持续6周。另外，小鼠通过标准饲料供应随意喂食。通过实验测量体重。数据以平均值±sem的形式呈现(n＝10)。pre，口服施用之前；post，口服施用完成之后。**p《0.01，双尾斯图登氏t测试(student'st-test)。[0070]图15a和15b示出了大鼠血浆中的snb01的标准曲线。图15a：峰面积比与在1.25到20μg/ml范围内的浓度的线性回归。图15b：峰面积比与在0.078到1.25μg/ml范围内的浓度的线性回归。[0071]图16示出了在禁食条件下在单次口服施用snb01之后，第1组(·，1000mg/kg)、第2组(△，750mg/kg)和第3组(◆，350mg/kg)的snb01(μg/ml)的平均浓度-时间曲线。[0072]图17示出了在禁食条件下在口服施用snb01(1000mg/kg)之后，第1组(·，单剂量)和第4组(△，14天重复剂量)的snb01(μg/ml)的平均浓度-时间曲线。数据以平均值±sem的形式呈现。[0073]图18示出了在单次口服施用snb01(1000mg/kg)之后，第1组(·，禁食)和第5组(△，喂食)的snb01(μg/ml)的平均浓度-时间曲线。数据以平均值±sem的形式呈现。[0074]图19示出了啮齿动物肺部中的snb01的标准曲线。啮齿动物肺部中的snb01的峰面积比与浓度的线性回归在1.56到25μg/ml的浓度范围内拟合。[0075]图20示出了表35中列出的示例性式(i)化合物的化学结构。具体实施方式[0076]本公开至少部分基于以下意外发现：式(i)化合物显示出针对sars-cov-2的3clpro蛋白酶的抑制活性，并且因此将预期有效治疗如sars-cov-2等冠状病毒引起的感染。此外，相对于具有少量没食子酰基部分(例如，5g)的那些对应物，具有大量没食子酰基部分(例如，10g)的呈α形式或β形式的式(i)化合物(例如，式(ib)化合物)显示出更好的抑制活性。因此，本公开提供了抑制冠状病毒增殖和/或治疗由如sars-cov-2等冠状病毒引起的感染的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用包括一种或多种式(i)化合物的组合物和用于预期治疗的试剂盒。[0077]由于关键残基的保守性和其功能重要性，设想的是，3clpro是用于治疗冠状病毒感染，例如由如本文所公开的任何冠状病毒株引起的感染的重要靶标。因此，本文提供了用于治疗冠状病毒感染的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者(例如，患有由冠状病毒引起的感染的人患者)施用有效量的本文所公开的任何组合物，所述组合物包括一种或多种式(i)化合物。此类化合物预期抑制3clpro活性，由此有益于治疗冠状病毒感染。[0078]本文中阐述了本公开的一个或多个实施例的细节。本公开的其它特征、目的和优点将根据具体实施方式、实例和权利要求书变得显而易见。[0079]定义[0080]下文更详细地描述了特定官能团和化学术语的定义。根据元素周期表(periodictableoftheelements)，cas版本，化学和物理手册(handbookofchemistryandphysics)，第75版，内封面来标识化学元素，以及通常如本文所描述定义具体官能团。另外，有机化学的一般原理以及具体的官能部分和反应性描述于thomassorrell,《有机化学(organicchemistry)》,索萨利托的大学科学书籍出版社(universitysciencebooks,sausalito),1999；smith和march，《march的高等有机化学(march'sadvancedorganicchemistry)》,第5版,纽约的约翰·威利父子公司(johnwiley&sons,inc.,newyork),,2001；larock，《综合有机转化(comprehensiveorganictransformations)》,纽约的vch出版社公司(vchpublishers,inc.,newyork),1989；以及carruthers,《有机合成的一些现代方法(somemodernmethodsoforganicsynthesis)》,第3版,剑桥的剑桥大学出版社(cambridgeuniversitypress,cambridge),1987中。本公开不旨在以任何方式受到本文所描述的示例性列表的取代基的限制。[0081]本文所描述的化合物可以包括一个或多个不对称中心，以及因此可以以各种异构体形式存在，例如对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所描述的化合物可以呈单独对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或者可以呈立体异构体的混合物，包含外消旋混合物和富集的一种或多种立体异构体的混合物的形式。异构体可以通过本领域技术人员已知的方法，包含手性高压液相色谱法(hplc)以及手性盐的形成和结晶从混合物中分离；或者优选的异构体可以通过不对称合成来制备。参见例如jacques等人,《对映体、外消旋体和拆分(enantiomers,racematesandresolutions)》(纽约的威利国际科学出版公司(wileyinterscience,newyork),1981)；wilen等人,《四面体(tetrahedron)》33:2725(1977)；eliel,《碳化合物的立体化学(stereochemistryofcarboncompounds)》(纽约的麦克劳-希尔出版公司(mcgraw-hill,ny),1962)；以及wilen,《拆分剂和光学拆分表(tablesofresolvingagentsandopticalresolutions)》第268页(e.l.eliel编辑,印地安纳州诺特丹的圣母大学出版社(univ.ofnotredamepress,in),1972)。本公开另外涵盖本文所描述的化合物，作为基本上不含其它异构体的单独的异构体，以及替代地作为各种异构体的混合物。[0082]当列出一个值范围时，旨在涵盖所述范围内的每个值和子范围。例如，“c1-6”旨在涵盖c1、c2、c3、c4、c5、c6、c1-6、c1-5、c1-4、c1-3、c1-2、c2-6、c2-5、c2-4、c2-3、c3-6、c3-5、c3-4、c4-6、c4-5和c5-6。[0083]在某些实施例中，本公开中采用的烷基、烯基和炔基含有1-20个脂肪族碳原子。在某些其它实施例中，本公开中采用的烷基、烯基和炔基含有1-10个脂肪族碳原子。在又其它实施例中，本公开中采用的烷基、烯基和炔基含有1-8个脂肪族碳原子。在仍其它实施例中，本公开中采用的烷基、烯基和炔基含有1-6个脂肪族碳原子。在又其它实施例中，本公开中采用的烷基、烯基和炔基含有1-4个碳原子。因此，示例性脂肪族基团包含但不限于例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-ch2-环丙基、乙烯基、烯丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、-ch2-环丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、-ch2-环戊基、正己基、仲己基、环己基、-ch2-环己基部分等，其可以再次带有一个或多个取代基。烯基包含但不限于例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。代表性炔基包含但不限于乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。[0084]术语“烷基”是指具有1个到10个碳原子(“c1-10烷基”)的直链或支链饱和烃基的基团或饱和的碳环。在一些实施例中，烷基具有1个到9个碳原子(“c1-9烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1个到8个碳原子(“c1-8烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1个到7个碳原子(“c1-7烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1个到6个碳原子(“c1-6烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1个到5个碳原子(“c1-5烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1个到4个碳原子(“c1-4烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1个到3个碳原子(“c1-3烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1个到2个碳原子(“c1-2烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1个碳原子(“c1烷基”)。在一些实施例中，烷基具有2个到6个碳原子(“c2-6烷基”)。c1-6烷基的实例包含甲基(c1)、乙基(c2)、丙基(c3)(例如，正丙基、异丙基)、丁基(c4)(例如，正丁基、叔丁基、仲丁基、异丁基)、戊基(c5)(例如，正戊基、3-戊基、戊烷基、新戊基、3-甲基-2-丁基、叔戊基)和己基(c6)(例如，正己基)。烷基的另外实例包含正庚基(c7)、正辛基(c8)等。除非另有说明，否则烷基的每个实例独立地未经取代(“未经取代的烷基”)或被一个或多个取代基(例如，卤素，如f或-oh)取代(“经取代的烷基”)。在某些实施例中，烷基是未经取代的c1-10烷基(如未经取代的c1-6烷基，例如，-ch3)。在某些实施例中，烷基是经取代的c1-10烷基(如经取代的c1-6烷基或经取代的c1-3烷基，例如，-cf3或-ch2oh)。[0085]术语“单环”是指单个环，其中环上的原子选自由c、n、o、p和s组成的组。在一些实施例中，“单环”是具有3个到10个碳原子的碳环(c3-10碳环)。在一些实施例中，“单环”是具有3-10个原子的杂环，包含来自由n、o、p和s组成的组的至少一个原子。在一些实施例中，“单环”是在一些实施例中，“单环”是[0086]在一些实施例中，“碳环基”是具有3个到10个环碳原子的单环饱和的碳环基(“c3-10环烷基”)。在一些实施例中，环烷基具有3个到8个环碳原子(“c3-8环烷基”)。在一些实施例中，环烷基具有3个到6个环碳原子(“c3-6环烷基”)。在一些实施例中，环烷基具有5个到6个环碳原子(“c5-6环烷基”)。在一些实施例中，环烷基具有5个到10个环碳原子(“c5-10环烷基”)。c5-6环烷基的实例包含环戊基(c5)和环己基(c5)。c3-6环烷基的实例包含前述c5-6环烷基以及环丙基(c3)和环丁基(c4)。c3-8环烷基的实例包含前述c3-6环烷基以及环庚基(c7)和环辛基(c8)。除非另有说明，否则环烷基的每个实例独立地未经取代(“未经取代的环烷基”)或具有一个或多个取代基的取代的(“经取代的环烷基”)。在某些实施例中，环烷基是未经取代的c3-10环烷基。在某些实施例中，环烷基是经取代的c3-10环烷基。[0087]“杂环基”或“杂环”是指具有环碳原子和1个到4个环杂原子的3元到10元非芳香族环体系的自由基，其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷和硅(“3元-10元杂环基”)。在含有一个或多个氮原子的杂环基中，在化合价允许时，连接点可以是碳原子或氮原子。杂环基可以是单环(“单环杂环基”)或稠合、桥连或螺环体系，如双环体系(“双环杂环基”)，并且可以是饱和的或部分不饱和的。杂环基双环体系可以在一个或两个环中包含一个或多个杂原子。“杂环基”还包含环体系，其中如上文所定义的杂环基环与一个或多个碳环基稠合，其中连接点在碳环基或杂环基环、或环体系上，其中如上文所定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合，其中连接点在杂环基环上，并且在此类情况下，环成员的数量一直表示杂环基环体系中的环成员的数量。除非另有说明，否则杂环基的每个实例独立地任选地被取代，即未经取代(“未经取代的杂环基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的杂环基”)。在某些实施例中，杂环基是未经取代的3元-10元杂环基。在某些实施例中，杂环基是经取代的3元-10元杂环基。[0088]在一些实施例中，杂环基是具有环碳原子和1-4个环杂原子的5元-10元非芳族环体系，其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷和硅(“5元-10元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基是具有环碳原子和1-4个环杂原子的5元-8元非芳族环体系，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5元-8元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基是具有环碳原子和1-4个环杂原子的5元-6元非芳族环体系，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5元-6元杂环基”)。在一些实施例中，5元-6元杂环基具有选自氮、氧和硫的1-3个环杂原子。在一些实施例中，5元-6元杂环基具有选自氮、氧和硫的1-2个环杂原子。在一些实施例中，5元-6元杂环基具有选自氮、氧和硫的一个环杂原子。[0089]含有一个杂原子的示例性3元杂环基包含但不限于氮杂乙烯基、环氧乙烷基、硫杂丙环基。含有一个杂原子的示例性4元杂环基包含但不限于氮杂环丁基、氧杂环丁基和硫杂环丁基。含有一个杂原子的示例性5元杂环基包含但不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,-5-二酮。含有两个杂原子的示例性5元杂环基包含但不限于二氧戊环基、氧硫杂环戊烷基、二硫杂环戊烷基和噁唑烷-2-酮。含有三个杂原子的示例性5元杂环基包含但不限于三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。含有一个杂原子的示例性6元杂环基包含但不限于哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和噻烷基。含有两个杂原子的示例性6元杂环基包含但不限于哌嗪基、吗啉基、二噻烷基和二噁烷基。含有两个杂原子的示例性6元杂环基包含但不限于三嗪基。含有一个杂原子的示例性7元杂环基包含但不限于氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和噻吩基。含有一个杂原子的示例性8元杂环基包含但不限于氮杂环庚烷基、氧杂环己基和硫代环辛基。与c6芳基环(在本文中也称为5,6-双环杂环)稠合的示例性5元杂环基包含但不限于二氢吲哚基、异二氢吲哚基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、苯并噁唑啉酮基等。与芳基环(在本文中也称为6,6-双环杂环)稠合的示例性6元杂环基包含但不限于四氢喹啉基、四氢异喹啉基等。[0090]“芳基”是指具有在芳环体系中提供的6-14个环碳原子和零个杂原子的单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳环体系(例如，具有在环阵列中共用的6个、10个或14个π电子)的自由基(“c6-14芳基”)。在一些实施例中，芳基具有六个环碳原子(“c6芳基”；例如，苯基)。在一些实施例中，芳基具有十个环碳原子(“c10芳基”；例如，萘基，如1-萘基和2-萘基)。在一些实施例中，芳基具有十四个环碳原子(“c14芳基”；例如，蒽基)。“芳基”还包含环体系，其中如上文所定义的芳基环与一个或多个碳环基或杂芳基稠合，其中连接基团或连接点在芳基环上，并且在此类情况下，碳的编号继续表示芳基环体系中碳原子的编号。除非另有说明，否则芳基的每个实例独立地任选地被取代，即，未经取代(“未经取代的芳基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的芳基”)。在某些实施例中，芳基是未经取代的c6-14芳基。在某些实施例中，芳基是经取代的c6-14芳基。[0091]作为二价桥连基团的烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基进一步使用后缀-ene，例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚碳环基、亚杂基、亚芳基和亚杂芳基来指代。[0092]“芳烷基”是烷基和芳基的子集，并且是指由任选地经取代的芳基取代的任选地经取代的烷基。在某些实施例中，芳烷基为任选地经取代的苯甲基。在某些实施例中，芳烷基为苯甲基。在某些实施例中，芳烷基为任选地经取代的苯乙基。在某些实施例中，芳烷基为苯乙基。在一些实施例中，芳烷基是杂芳基和芳基的子集，任选地由烷基连接。[0093]“杂芳基”是指具有在芳环体系中提供的环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元单环或双环4n+2芳环体系(例如，具有在环阵列中共享的6个或10个π电子)的自由基，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-10元杂芳基”)。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，在化合价允许时，连接点可以是碳或氮原子。杂芳基双环体系可以包含一个或两个环中的一个或多个杂原子。“杂芳基”包含环体系，其中如上所定义的杂芳基环与一个或多个碳环基或杂环基稠合，其中连接点在杂芳基环上，并且在所述情况下，环成员的编号继续表示杂芳基环体系中环成员的编号。“杂芳基”还包含环体系，其中如上所定义的杂芳基环与一个或多个芳基稠合，其中连接点在芳基或杂芳基环上，并且在此类情况下，环成员的编号表示稠合多环(芳基/杂芳基)环体系中环成员的编号。双环杂芳基中一个环不含有杂原子(例如，吲哚基、喹啉基、咔唑基等)，连接点可以在任一环上，即，带有杂原子的环(例如，2-吲哚基)或不含有杂原子的环(例如，5-吲哚基)。[0094]在一些实施例中，杂芳基是具有在芳环体系中提供的环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元芳环体系，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-10元杂芳基”)。在一些实施例中，杂芳基是具有在芳环体系中提供的环碳原子和1-4个环杂原子的5-8元芳环体系，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-8元杂芳基”)。在一些实施例中，杂芳基是具有在芳环体系中提供的环碳原子和1-4个环杂原子的5元-6元芳环体系，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5元-6元杂芳基”)。在一些实施例中，5元-6元杂芳基具有选自氮、氧和硫的1-3个环杂原子。在一些实施例中，5元-6元杂芳基具有选自氮、氧和硫的1-2个环杂原子。在一些实施例中，5元-6元杂芳基具有选自氮、氧和硫的1个环杂原子。除非另有说明，否则杂芳基的每个实例独立地任选地被取代，即，未被取代(“未经取代的杂芳基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的杂芳基”)。在某些实施例中，杂芳基是未经取代的5元-14元杂芳基。在某些实施例中，杂芳基是经取代的5元-14元杂芳基。[0095]含有一个杂原子的示例性5元杂芳基包含但不限于吡咯基、呋喃基和噻吩基。含有两个杂原子的示例性5元杂芳基包含但不限于咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。含有三个杂原子的示例性5元杂芳基包含但不限于三唑基、恶二唑基和噻二唑基。含有四个杂原子的示例性5元杂芳基包含但不限于四唑基。含有一个杂原子的示例性6元杂芳基包含但不限于吡啶基。含有两个杂原子的示例性6元杂芳基包含但不限于哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。含有三个或四个杂原子的示例性6元杂芳基分别包含但不限于三嗪基和四嗪基。含有一个杂原子的示例性7元杂芳基包含但不限于氮杂环庚烯基、氧杂环庚烯基和噻吩基。示例性5,6-双环杂芳基包含但不限于吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并恶二唑、苯并噻唑基、苯并异噻唑、苯并噻二唑基、吲嗪基和嘌呤基。示例性6,6-双环杂芳基包含但不限于萘啶基、哌啶基、喹啉基、异喹啉基、喹啉基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。[0096]“不饱和的”或“部分不饱和的”是指包含至少一个双键或三键的基团。“部分不饱和的”环体系进一步旨在涵盖具有多个不饱和位点的环，但不旨在包含芳族基团(例如，芳基或杂芳基)。同样，“饱和的”是指不含有双键或三键，即含有所有单键的基团。[0097]除非另有明确规定，在化合价允许时本文所描述的原子、部分或基团可以是未经取代的或经取代的。术语“任选地取代的”是指经取代或未经取代的。[0098]除非另外明确指定，否则基团是任选地经取代的。术语“任选地取代的”是指经取代或未经取代的。在某些实施例中，烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基基团是任选地经取代的(例如，“经取代的”或“未经取代的”烷基、“经取代的”或“未经取代的”烯基、“经取代的”或“未经取代的”炔基、“经取代的”或“未经取代的”碳环基、“经取代的”或“未经取代的”杂环基、“经取代的”或“未经取代的”芳基或“经取代的”或“未经取代的”杂芳基)。通常，术语“经取代的”，无论之前是否有术语“任选地”，意指基团(例如，碳或氮原子)上存在的至少一个氢被可允许的取代基，例如在取代后产生稳定的化合物，例如不会自发进行转化(如通过重排、环化、消除或其它反应)的化合物的取代基替代。除非另有说明，否则“经取代的”基团在所述基团的一个或多个可取代的定位上具有取代基，并且当任何给定结构中的多于一个的定位被取代时，所述取代基在每个定位上相同或不同。可以设想，术语“经取代的”包含用有机化合物的全部可允许的取代基、导致稳定的化合物的形成的本文所描述的取代基中的任何取代基的取代。本公开设想任何和全部这样的组合以便获得稳定的化合物。为了本公开的目的，杂原子如氮可以具有氢取代基和/或如本文所描述的满足杂原子的化合价并导致形成稳定部分的任何合适的取代基。在某些实施例中，取代基是碳原子取代基。在某些实施例中，取代基是氮原子取代基。在某些实施例中，取代基是氧原子取代基。在某些实施例中，取代基是硫原子取代基。[0099]“卤代”或“卤素”是指氟(氟代，-f)、氯(氯代，-cl)、溴(溴代，-br)或碘(碘代，-i)。[0100]术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏应答等，并与合理的利益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐在是本领域中熟知的。例如，berge等人在通过引用并入本文的《药物科学杂志(j.pharmaceuticalsciences)》,1977,66,1-19中详细描述了药学上可接受的盐。[0101]本文所描述的化合物的药学上可接受的盐包含衍生自适当的无机酸和有机酸和碱的盐。药学上可接受的无毒的酸加成盐的实例是与无机酸，如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或与有机酸，如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸形成或通过使用本领域中已知的其它方法，如离子交换形成的具有氨基的盐。其它药学上可接受的盐包含己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自适当碱的盐包含碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和n+(c1-4烷基)4-盐。代表性碱金属或碱土金属盐包含钠、锂、钾、钙、镁等。另外的药学上可接受的盐包含在适当时使用抗衡离子如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。[0102]术语“溶剂化物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂缔合的化合物形式。此物理缔合可以包含氢键合。常规的溶剂包含水、甲醇、乙醇、乙酸、二甲亚砜(dmso)、四氢呋喃(thf)、二乙醚等。本文所描述的化合物可以例如以结晶形式制备，并且可以是溶剂化的。合适的溶剂化物包含药学上可接受的溶剂化物，并且进一步包含化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物两者。在某些情况下，溶剂化物将能够分离，例如，当一种或多种溶剂分子掺入在结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离的溶剂化物。代表性溶剂化物包含水合物、乙醇化物和甲醇化物。[0103]还将理解，具有相同的分子式但原子键合的性质或序列或原子在空间中的排列不同的化合物被称为“异构体”。原子空间布置不同的异构体被称为“立体异构体”。[0104]彼此非镜像的立体异构体被称为“非对映异构体”，并且作为彼此不叠置的镜像的那些被称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心时，例如，其与四个不同的基团结合，一对对映体是可能的。对映体可以表征为其不对称中心的绝对构型，并通过cahn和prelog的r-和s-测序规则来描述，或通过分子旋转偏振光平面并被指定为右旋或左旋(即，分别为(+)或(-)-异构体)的方式来描述。手性化合物可以作为单独的对映异构体或作为其混合物存在。含有等比例对映体的混合物被称为“外消旋混合物”。[0105]术语“抑制(inhibition)”、“抑制(inhibiting)”、“抑制(inhibit)”或“抑制剂(inhibitor)”指化合物相对于媒剂减少、减缓、停止或阻止细胞中特定生物过程活性的能力。[0106]当化合物、药物组合物、方法、用途或试剂盒被称为“选择性”、“特异性”或“竞争性”结合第一蛋白时，所述化合物以比结合不同于第一蛋白的第二蛋白的结合亲和力更高的结合亲和力(例如，不小于约2倍、不小于约5倍、不小于约10倍、不小于约30倍、不小于约100倍、不小于约1,000倍或不小于约10,000倍)结合第一蛋白。当化合物被称为“选择性”、“特异性”或“竞争性”调节(例如，增加或抑制)蛋白质的活性时，所述化合物以不同于第一蛋白的至少一种蛋白质的活性在更大程度上(例如，不小于约2倍、不小于约5倍、不小于约10倍、不小于约30倍、不小于约100倍、不小于约1,000倍或不小于约10,000倍)调节蛋白质的活性。[0107]术语“异常活性”是指偏离正常活性的活性。术语“增加的活性”是指高于正常活性的活性。[0108]术语“组合物”和“调配物”可互换使用。[0109]可以设想，施用的“受试者”、“个体”或“患者”是指人(即，任何年龄段的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童或青少年)或成人受试者(例如，年轻的成人、中年成人或高龄成人)或非人动物。“受试者”可以是人，但也包含其它哺乳动物，特别是那些可用作人疾病实验室模型的哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔子、狗等。“患者”是指需要治疗疾病的人受试者。在某些实施例中，受试者是患有中枢神经系统(cns)障碍、肥胖症、糖尿病或高血脂症或处于其风险中的人。[0110]术语“施用(administer)”、“施用(administering)”或“施用(administration)”是指在受试者体内或其身体上植入、吸收、摄取、注射、吸入或以其它方式引入本文所描述的化合物或其组合物。[0111]“口服施用(oraladministration)”或“口服施用(adminidertedorally)”是通过口腔摄入物质的施用途径。许多药物都是口服的，因为其具有全身效应，通过血液流动到达身体的不同部位。[0112]术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指逆转、缓解、延迟如本文所描述的疾病的发作或抑制其进展。在一些实施例中，可以在疾病的一种或多种体征或症状已经发展或已经观察到之后施用治疗。在其它实施例中，可以在不存在疾病的体征或症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状发作之前对易感受试者施用治疗(例如，根据症状史和/或根据暴露于病原体)以延迟或预防疾病发生。症状消退后，也可以继续治疗，例如延迟或预防复发。[0113]“注射”是使用针(通常是皮下注射针)和注射器将药物注入到人体的行为。注射是一种通过胃肠外施用，即通过消化道之外的途径施用递送药物的技术。胃肠外注射包含静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和贮库注射。[0114]通过“局部施用”进行施用是指将药物施涂在身体表面，例如施涂到皮肤或粘膜表面，如阴道、阴茎、眼睛和耳朵等。局部药物通常要避免与口腔接触，并且不得食用。局部施用可以包含但不限于软膏、乳膏、凝胶、糊剂、泥敷剂、局部粉末和药用膏药。[0115]“吸入”施用是指通过呼吸道，通常通过口腔或鼻腔吸入，以气体、气溶胶或细粉末的形式施用物质，以获得局部或全身效果。[0116]口腔吸入：吸入药物可以快速吸收，并在局部和全身发挥作用。吸入器装置的正确技术对于达到正确的剂量是必要的。一些药物可能会产生难闻的味道或刺激口腔。通常，在口腔吸入后，以粉末颗粒形式呈现的肺递送剂量仅20-50％将沉积在肺中。剩余的50-70％未沉积的气溶胶颗粒在呼气时立即从肺部清除。》8μm的吸入性粉末颗粒在结构上易于通过惯性冲击沉积在中央气道和传导气道(传导区)中。直径介于3μm与8μm之间的吸入性粉末颗粒往往通过沉淀大量沉积在肺的过渡区中。直径《3μm的吸入性粉末颗粒在结构上易于通过扩散主要沉积在外周肺的呼吸区域中。沉积在上气道和中央气道的颗粒很少被全身吸收，因为其将通过粘液纤毛清除以高效且快速的方式被去除。[0117]鼻腔吸入：通过吸食物质进行吸入可能是将药物递送到脑的最快速方式，因为物质直接行进到脑而不会在全身循环中被稀释。对精神药物依赖的严重程度往往会随着药物递送的加快而增加。[0118]术语“持续”是指根据医学或治疗需要在一定时间段内不间断施用，例如但不限于有泵或无泵输注、呼吸疗法、吸入疗法。[0119]减轻靶疾病/病症包含延迟疾病的发展或进展或者降低疾病严重程度。减轻疾病不一定需要治愈效果。如本文所使用的，“延迟”靶疾病或病症的发展意指推迟、阻碍、减缓、放缓、稳定和/或延缓疾病的进展。这一延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或正在治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或者延迟疾病的发作的方法是降低在给定时间帧内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或与不使用所述方法相比在给定时间帧内降低症状的程度的方法。这种比较通常是基于临床研究，使用足以给出统计学上显著的结果的许多受试者。[0120]疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或后续进展。疾病的发展可以是可检测到的并且可以使用如本领域熟知的标准临床技术进行评估。然而，发展还指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包含发生、复发和发作。如本文所使用的，靶疾病或病症的“发作”或“发生”包含初始发作和/或复发。[0121]为了实现本文所描述的任何预期治疗效果，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者施用有效量的本文组合物。[0122]术语“病状”、“疾病”和“病症”可互换使用。[0123]本文所描述的化合物的“有效量”是指足以引发期望的生物应答，即治疗病状的量。如所属领域的技术人员应了解，本文所描述的化合物的有效量可以取决于例如以下的因素而变化：所要生物端点、化合物的药物动力学、正在治疗的病状、施用模式以及受试者的年龄和健康。在某些实施例中，有效量是治疗有效量。在某些实施例中，有效量是预防性治疗量。在某些实施例中，有效量是单剂量的本文所描述的化合物的量。在某些实施例中，有效量是以多剂量的本文所描述的化合物的组合量。[0124]本文所描述的化合物的“治疗有效量”为足以在病状治疗中提供治疗效益或使一种或多种与病状相关的症状延迟或最小化的量。治疗有效量的化合物意指单独的或与其它疗法组合的治疗剂的量，所述量在治疗病状时提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以涵盖改善整体疗法、减少或避免病状的症状、体征或原因和/或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。[0125]本文所描述的化合物的“预防有效量”是足以预防病状或与所述病状相关的一种或多种症状或预防其复发的量。预防有效量的化合物意指单独的或与其它疗法组合的治疗剂的量，所述量在预防病状时提供预防益处。术语“预防有效量”可以涵盖改善整体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。[0126]术语“保健食品”或“保健食品产品”是指用于滋养人类和动物，用于改善基本行为功能、多动、焦虑、抑郁、自杀意念和/或行为、感觉运动门控、疼痛阈值、记忆和/或认知功能、体重或用于促进治疗本文所描述的靶疾病中的任何靶疾病的任何类型的液体和固体/半固体材料。术语“营养组合物”是指含有食品来源的组分并且除了食品中发现的基本营养价值之外还赋予额外健康益处的组合物。[0127]术语“医疗食品产品”是指调配为肠内消耗或施用的食品产品，包含通常在医师的指导下用于靶疾病(如本文所描述的那些疾病)的具体饮食管理的食品产品。“医疗食品产品”组合物可以指为需要治疗的患者(例如，患有疾病的人类患者或需要使用所述产品作为主要活性剂用于通过具体膳食管理来减轻疾病或病状的人类患者)专门调配和加工(与以自然状态使用的天然存在的食物相反)。[0128]i.式(i)化合物[0129]本公开涉及一种治疗冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括一种或多种式(i)化合物：[0130][0131]或其药学上可接受的盐。环x可以是5元或6元单环，所述单环任选地可以包含一个或两个杂原子，如n、o、p或s。在r1-r6中，至少一个为式中，至少一个为式并且剩余r1-r6中的每一个独立地是-oh、-cooh、oh、oh、或者不存在。[0132]式(i)的任何化合物可以具有2个到35个没食子酰基，包含端值(例如，4-35个，包含端值)。在一些实施例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6中的一个存在于式(i)化合物中的环x中。在一些实施例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6中的两个存在于式(i)化合物中的环x中。在一些实施例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6中的三个存在于式(i)化合物中的环x中。在一些实施例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6中的四个存在于式(i)化合物中的环x中。在一些实施例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6中的五个存在于式(i)化合物中的环x中。在一些实施例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6全部存在于式(i)化合物中的环x中。[0133]在一些实例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6中的每一个可以未经取代。在其它实例中，r1、r2、r3、r4、r5或r6中的每一个可以被选自由以下组成的组的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代：c1-3烷基、卤素、-cn、-no2、-sh、-s(c1-3烷基)、-nh2、nh(c1-3烷基)、n(c1-3烷基)2和-o(c1-3烷基)；其中n和o独立地为0或1；m和p独立地为1、2、3、4或5。[0134]在一些实施例中，环x可以是6元单羧酸环，例如在其它实例中，环x可以是6元单杂环。在一些实例中，单杂环含有一个n原子。在一些实例中，单杂环含有一个o原子。在一些实例中，单杂环含有一个p原子。在一些实例中，单杂环含有一个s原子。实例包含[0135]在一些实施例中，环x可以是具有两个杂原子的6元杂环，所述杂原子可以是o、n、s或p。在一些实例中，所述两个杂原子相同。在其它实例中，所述两个杂原子不同。在一些实例中，所述两个杂原子都是n。在一些实例中，所述两个杂原子是n和o。[0136]在一些实施例中，环x可以是5元单羧酸环。在其它实例中，环x可以是5元单杂环。在一些实例中，单杂环含有一个n原子。在一些实例中，单杂环含有一个o原子。在一些实例中，单杂环含有一个p原子。在一些实例中，单杂环含有一个s原子。实例包含[0137]在一些实施例中，环x可以是具有两个杂原子的5元杂环，所述杂原子可以是o、n、s或p。在一些实例中，所述两个杂原子相同。在其它实例中，所述两个杂原子不同。在一些实例中，所述两个杂原子都是n。在一些实例中，所述两个杂原子是n和o。[0138]在一些实施例中，r1、r2、r3、r4、r5和r6中的一个或多个(在适用的情况下)具有下式：[0139][0139]在一些情况下，这些基团未经取代。在其它情况下，这些基团中的一个或多个可以被选自由以下组成的组的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代：c1-3烷基、卤素、-cn、-cf3、-no2、-sh、-s(c1-3烷基)、-nh2、nh(c1-3烷基)、n(c1-3烷基)2、-oh和-o(c1-3烷基)；其中n和o独立地为0或1；m和p独立地为1、2、3、4或5。[0140]在一些实例中，r1、r2、r3、r4、r5和r6中的一个或多个(在适用的情况下)可以具有下式：[0141][0142][0143]在一些实施例中，式(i)化合物可以含有所有r1-r6连接的环x。在其它实施例中，式(i)化合物可以含有环x，其中不存在r1-r6中的一个或多个，但r1-r6中的至少一个连接所述环x。在一些实施例中，本文所公开的式(i)化合物可以含有2-35个没食子酰基部分，包含端值。例如，式(i)化合物可以含有4-35个没食子酰基部分。[0144]在一些实例中，式(i)化合物为具有式(i)(ia)结构的化合物，其中r1、r2、r3、r4和r5均存在，并且如本文所定义。式(ia)化合物可以呈任何立体构型(例如，呈α形式或呈β形式)，或含有具有不同立体构型的化合物的混合物。例如，式(ia)化合物可以具有(ib)结构，其中r1、r2、r3、r4和r5均存在，并且如本文所定义。式(ia)化合物(例如，式(ib)化合物)可以具有4-35个没食子酰基部分，例如，6-35个没食子酰基部分；8-35个没食子酰基部分、10-35个没食子酰基部分、15-35个没食子酰基部分、20-35个没食子酰基部分、25-35个没食子酰基部分或30-35个没食子酰基部分。在一些情况下，式(ia)化合物(例如，式(ib)化合物)可以具有≥15个没食子酰基部分。示例性式(ia)化合物(例如，式(ib)化合物)包含α5g、β5g、α10g、β10g、α15g、β15g、α20g、β20g、α25g或β25g。参见下文表1和表34中的结构。[0145]在一些实例中，式(i)化合物为具有(ic)结构的化合物，其中r1、r2、r3、r4、r5和r6中的每一个如本文所定义。在一些情况下，r1、r2、r3、r4、r5和r6全部存在。在一些情况下，r1、r2、r3、r4、r5和r6中的五个存在。在一些情况下，r1、r2、r3、r4、r5和r6中的四个存在。在一些情况下，r1、r2、r3、r4、r5和r6中的三个存在。在一些情况下，r1、r2、r3、r4、r5和r6中的两个存在。在一些情况下，r1、r2、r3、r4、r5和r6中的一个存在。式(ic)化合物可以具有4-35个没食子酰基部分，例如，6-35个没食子酰基部分；8-35个没食子酰基部分、10-35个没食子酰基部分、15-35个没食子酰基部分、20-35个没食子酰基部分、25-35个没食子酰基部分或30-35个没食子酰基部分。在一些情况下，式(ia)化合物(例如，式(ib)化合物)可以具有≥15个没食子酰基部分。[0146]在一些实例中，式(i)化合物为具有(id)结构的化合物。在式(id)中，r1可以为和r3可以为可以为[0148]在一些情况下，式(ie)化合物可以具有(ie-1)的结构，其中r1-r3中的每一个如本文所定义。[0149]式(ie)(即，ie-1)化合物可以具有4-35个没食子酰基部分，例如，6-35个没食子酰基部分；8-35个没食子酰基部分、10-35个没食子酰基部分、15-35个没食子酰基部分、20-35个没食子酰基部分、25-35个没食子酰基部分或30-35个没食子酰基部分。在一些情况下，式(ie)化合物可以具有≥15个没食子酰基部分。[0150]在一些情况下，式(ie)(即，ie-1)中的r1、r2和r3全部为[0151][0151](例如，上文提供的那些实例)。此类式(id)化合物也称为间苯三酚ng化合物，其中g表示没食子酰基部分，并且n表示没食子酰基部分的数量。实例包含间苯三酚6g、间苯三酚9g、间苯三酚12g、间苯三酚15g或间苯三酚21g(参见下文表1和表34)。在一些情况下，r1、r2和r3中的一个为例如，化合物103(参见表35和图20)。[0152]在一些实例中，式(i)化合物为具有结构的化合物，其中r1和r2各自独立地为地为(例如，上文提供的那些实例)。式(if)化合物可以具有4-35个没食子酰基部分，例如，6-35个没食子酰基部分；8-35个没食子酰基部分、10-35个没食子酰基部分、15-35个没食子酰基部分、20-35个没食子酰基部分、25-35个没食子酰基部分或30-35个没食子酰基部分。在一些情况下，式(if)化合物可以具有≥10个没食子酰基部分。此类化合物也称为间苯二酚ng化合物，其中g表示没食子酰基部分，并且n表示没食子酰基部分的数量。实例包含下表1中列出的间苯二酚10g和间苯二酚14g。[0153]在一些情况下，式(i)化合物为具有(ig)结构的化合物，其中r1、r2、r3和r4中的一个或多个独立地为中的一个或多个独立地为中的一个或多个独立地为(例如，本文提供的那些实例)。式(ig)化合物可以具有4-35个没食子酰基部分，例如，6-35个没食子酰基部分；8-35个没食子酰基部分、10-35个没食子酰基部分、15-35个没食子酰基部分、20-35个没食子酰基部分、25-35个没食子酰基部分或30-35个没食子酰基部分。在一些情况下，式(ig)化合物可以具有≥15个没食子酰基部分。在一些情况下，r1、r2、r3和r4全部存在于式(ig)中。在一些情况下，r1、r2、r3和r4中的三个存在于式(ig)中。在一些情况下，r1、r2、r3和r4中的两个存在于式(ig)中。在一些情况下，r1、r2、r3和r4中的一个存在于式(ig)中。式(ig)化合物可以是任何立体构型或不同立体构型的混合物。示例性式(ig)化合物包含下表35和图20所示的化合物117、119、121、123、126或128。[0154]在一些情况下，式(i)化合物为具有(ih)结构的化合物，其中r1、r2、r3和r4中的一个或多个独立地为中的一个或多个独立地为中的一个或多个独立地为(例如，本文提供的那些实例)。式(ih)化合物可以具有4-35个没食子酰基部分，例如，6-35个没食子酰基部分；8-35个没食子酰基部分、10-35个没食子酰基部分、15-35个没食子酰基部分、20-35个没食子酰基部分、25-35个没食子酰基部分或30-35个没食子酰基部分。在一些情况下，式(ih)化合物可以具有≥15个没食子酰基部分。在一些情况下，r1、r2、r3和r4全部存在于式(ih)中。在一些情况下，r1、r2、r3和r4中的三个存在于式(ih)中。在一些情况下，r1、r2、r3和r4中的两个存在于式(ih)中。在一些情况下，r1、r2、r3和r4中的一个存在于式(ih)中。式(ih)化合物可以是任何立体构型或不同立体构型的混合物。示例性式(ih)化合物包含下表35和图20所示的化合物134、136、138、140、142、144、146或148。[0155]在一些实施例中，任何式(i)化合物的群体用于本文所公开的方法中。在一些实例中，式(i)化合物可以具有式(ia)结构。在一些实例中，式(i)化合物可以具有式(ib)结构，其可以呈α形式、β形式或其组合。在一些实例中，式(i)化合物可以具有式(ic)结构。在一些实例中，式(i)化合物可以具有式(id)结构。在一些实例中，式(i)化合物可以具有式(ie)(例如，ie-1)结构。在一些实例中，式(i)化合物可以具有式(if)结构。在一些实例中，式(i)化合物可以具有式(ig)结构。在一些实例中，式(i)化合物可以具有式(ih)结构。[0156]在一些实例中，群体中约1-25％的式(i)化合物具有5个部分。在一些实例中，群体中约10-40％的式(i)化合物具有6-7个部分。在一些实例中，群体中约20-85％的式(i)化合物具有8-12个部分。在一些实施例中，式(i)化合物含有连接没食子酰基部分的中心环。[0157]在一些实施例中，群体中约1-25％的式(i)化合物具有5个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约4-15％的式(i)化合物具有5个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约4-10％的式(i)化合物具有5个没食子酰基部分。在一些实施例中，组合物中约4-8％的式(i)化合物具有5个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约1-4％的式(i)化合物具有5个没食子酰基部分。在一些实施例中，组合物中约10-40％的式(i)化合物具有6-7个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约20-35％的式(i)化合物具有6-7个没食子酰基部分。在一些实施例中，组合物中约25-35％的式(i)化合物具有6-7个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约28-33％的式(i)化合物具有6-7个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约15-28％的式(i)化合物具有6-7个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约15-20％的式(i)化合物具有6-7个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约20-85％的式(i)化合物具有8-12个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约55-85％的式(i)化合物具有8-12个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约55-75％的式(i)化合物具有8-12个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约55-65％的式(i)化合物具有8-12个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约75-85％的式(i)化合物具有8-12个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约78-83％的式(i)化合物具有8-12个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约63-75％的式(i)化合物具有8-12个没食子酰基部分。在一些实施例中，群体中约58-63％的式(i)化合物具有8-12个没食子酰基部分。[0158]在一些实施例中，本文所公开的式(i)化合物群体包括式(i)化合物的基本上同质群体，即，至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多)的式(i)化合物相同。群体中的式(i)化合物含有2-35个没食子酰基部分。在一些实例中，群体中的式(i)化合物可以具有介于4-35之间的任何数量的没食子酰基部分，例如，介于6-35之间、介于8-35之间、介于10-35之间、介于15-35之间、介于20-35之间、介于25-35之间或介于30-35之间的没食子酰基部分。在一些情况下，群体中的式(i)化合物可以具有≥15个没食子酰基部分。[0159]在一些实施例中，式(i)化合物的基本上同质群体可以具有的中心环(环x)。基本上同质群体中的大多数的式(i)化合物可以含有在2-35个范围内，例如5-15个范围内的某一总数的部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有5个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有6个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有7个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有8个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有9个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有10个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有11个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有12个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有13个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有14个部分。在一些实例中，群体中的大多数式(i)化合物含有15个部分。[0160]上文所公开的任何式(i)化合物可以具有(ib)结构，其中r1-r6中的每一个可以含有一个或多个没食子酰基部分。在一些情况下，中心环呈α形式。在其它情况下，中心环呈β形式。当式(i)化合物组合物含有式(i)化合物的混合物时，所述组合物可以含有呈α和β形式的化合物。[0161]任何式(i)化合物或其组合物可以通过例如化学合成或从合适的天然来源分离来制备。参见例如us10265336和us10105378，所述文献中的每个文献的相关公开内容出于本文引用的目的和主题通过引用并入本文。[0162]任何式(i)化合物或包括如本文所公开的此类化合物的群体也属于本公开的范围。[0163]ii.包括式(i)化合物的组合物和含有此类化合物的试剂盒[0164]本公开的一个方面涉及组合物，例如，药物组合物、保健食品产品，如营养组合物和医疗食品，其包括一种或多种式(i)化合物和载体，例如药学上可接受的载体和/或可食用载体。天然存在或非天然存在(合成)的此类载体可以赋予组合物中的式(i)化合物各种益处，例如，提高式(i)化合物的体外和/或体内稳定性、增强式(i)化合物的生物利用度、增加相关生物活性和/或减少副作用。合适的载体包含但不限于稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、缓冲剂、防腐剂或其组合。[0165](a)药物组合物[0166]本文所公开的一种或多种式(i)化合物可以与一种或多种合适的载体混合以形成本文所公开的组合物。[0167]在一些实施例中，本文所公开的组合物可以包括具有不同数量(例如，总共为2-35个，例如4-35个)的部分的式(i)化合物的混合物。在某些情况下，式(i)化合物的混合物可以总共具有4-15个没食子酰基部分。例如，组合物中至少60％的式(i)化合物具有6-12个在其它实例中，组合物中至少50％的式(i)化合物具有8-12个部分。在又其它实例中，组合物中≥98％的式(i)化合物具有4-12个部分。可替代地，组合物中≥97％的式(i)化合物具有5-12个部分。在一些实例中，组合物中≥90％的式(i)化合物具有6-12个部分。在其它实例中，或者组合物中≥60％的式(i)化合物具有8-12个部分。进一步地，在一些实例中，组合物中约1-25％的式(i)化合物具有5个部分，或组合物中约10-40％的式(i)化合物具有6-7个部分。在仍其它实例中，组合物中约20-85％的式(i)具有8-12个部分。[0168]在其它实施例中，本文所公开的组合物包括本文所公开的任何式(i)化合物的基本上同质群体。如本文所使用的，“式(i)化合物的基本上同质群体”是指大多数式(i)化合物相同的群体，即具有相同的环x和相同总数的部分的群体。例如，基本上同质群体中至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更多)的式(i)化合物相同。[0169]在一些实例中，本文所公开的组合物包括任何式(i)化合物的基本上同质群体，其大多数具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个部分。在一些情况下，式(i)化合物的基本上同质群体包括至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更多)相同的式(i)化合物，其部分的总数在6-30个、8-25个、10-25个或15-25个的范围内。参见上文公开。[0170]如本文所描述的组合物，例如，包括药学上可接受的载体的药物组合物可以用于治疗如本文所描述的任何靶疾病。药学上可接受的载体包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其它材料。美国专利第5,211,657号中具体描述了示例性药学上可接受的载体。此类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、兼容性载体和任选地其它治疗剂。当用于药物中时，盐应是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐并且不排除在本发明的范围外。此类药理学和药学上可接受的盐包含但不限于从合适的无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钡、氢氧化铁(ii)、氢氧化铁(iii)、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化铯或氢氧化锂)或合适的有机碱(例如，吡啶、甲胺、咪唑、苯并咪唑、组氨酸、磷腈碱或有机阳离子的氢氧化物，如氢氧化季铵和氢氧化鏻)制备的盐。同样，可以将药学上可接受的盐制备成碱金属或碱土金属盐，如锂盐、钠盐、钾盐或钙盐。[0171]如本文所描述的药物组合物可以包括呈冻干调配物或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。《雷明顿：药学科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)》,第20版,(2000),利平科特·威廉姆斯与威尔金斯公司(lippincottwilliamsandwilkins),k.e.hoover编辑。此类载体、赋形剂或稳定剂可以增强本文所描述的组合物中活性成分的一种或多种特性，例如生物活性、稳定性、生物利用度和其它药代动力学和/或生物活性。[0172]可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；苯甲酸酯、山梨酸酯以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如tweentm(聚山梨酯)、pluronicstm(非离子型表面活性剂)或聚乙二醇(peg)。[0173]在一些实例中，本文所描述的药物组合物包含肺相容性赋形剂。合适的此类赋形剂包含但不限于三氯一氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、一氯二氟乙烷、二氟乙烷、四氟乙烷、七氟丙烷、八氟环丁烷、纯净水、乙醇、丙二醇、甘油、peg(例如，peg400、peg600、peg800和peg1000)、山梨糖醇三油酸酯、大豆卵磷脂、卵磷脂、油酸、聚山梨醇酯80、硬脂酸镁和十二烷基硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、苯扎氯铵、氯化十六烷基吡啶、百里酚、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、edta、氢氧化钠、氨丁三醇、氨、hcl、h2so4、hno3、柠檬酸、cacl2、caco3、柠檬酸钠、氯化钠、edta二钠、糖精、薄荷醇、抗坏血酸、甘氨酸、赖氨酸、明胶、聚维酮k25、二氧化硅、二氧化钛、氧化锌、乳糖、乳糖一水合物、无水乳糖、甘露醇和葡萄糖。[0174]在其它实例中，可以以持续释放格式调配本文所描述的药物组合物。持续释放制剂的适合的实例包含固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质采用例如薄膜或微胶囊等成型制品的形式。持续释放基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、l-谷氨酸和7-乙基-l-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、如luprondepottm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)等可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。[0175]用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这通过例如无菌过滤膜过滤容易地实现。通常将治疗性组合物放置在具有无菌进口端的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶或手动进入的密封容器中。[0176]本文所描述的药物组合物可以呈单位剂型，如固体、溶液或悬浮液或栓剂，以用于通过吸入或吹入、鞘内、肺内或脑内途径、口服、肠胃外或直肠施用进行施用。[0177]为了制备固体组合物，可以将主要活性成分与药物载体，例如，常规压片成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和其它药物稀释剂，例如，水混合，以形成含有本发明化合物的均相混合物的固体预调配组合物或其药学上可接受的无毒盐。在称这些预调配组合物均相时，这意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效单位剂型，如粉末收集物、片剂、丸剂和胶囊剂。然后将这个固体预调配组合物细分成上述类型的单位剂型，所述单位剂型含有0.1到约5克本发明的活性成分。[0178]合适的表面活性剂具体地包含非离子剂，如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，tweentm20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如，spantm20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括介于0.05％与5％之间的表面活性剂，并且可以介于0.1％与2.5％之间。应当理解，如果有必要，可以添加其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的媒剂。[0179]可以使用如intralipidtm、liposyntm、infonutroltm、lipofundintm和lipiphysantm等可商购获得的脂肪乳剂来制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可替代地，活性成分可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成的乳剂中。应当理解，可以添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂通常将含有至多20％的油，例如，介于5％与20％之间。脂肪乳剂可以包括介于0.1与1.0μm之间、具体地0.1与0.5μm之间的脂肪滴，并且ph范围为5.5到8.0。[0180]在一些实例中，本文所描述的药物组合物包含脂质体组合物。脂质体通常是由层状相脂质双层人工制备的球形囊泡组合物。脂质体或脂质囊泡通常由富含磷脂酰胆碱的磷脂构成，并且还可能含有具有表面活性剂特性的混合脂链，如卵磷脂酰乙醇胺。优选地，脂质体组合物由一种或多种囊泡形成脂质构成，其选自双脂链脂质，如磷脂；甘油二酯；二脂糖酯；单一脂质，如鞘磷脂或鞘糖脂；甾族脂质；亲水性聚合物衍生脂质或其混合物。优选地，囊泡形成脂质包括一种或多种磷脂、一种或多种甾族脂质和一种或多种亲水性聚合物衍生脂质。可以用于脂质体组合物中的所述一种或多种磷脂包括形成双层囊泡结构的磷脂。可以使用的磷脂包含但不限于磷脂，如磷脂酰胆碱(pc)；磷脂酰乙醇胺(pe)；磷酯酰丝氨酸(ps)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰肌醇(pi)、鞘磷脂、磷脂酸(pa)、卵磷脂；磷脂酰胆碱脂质衍生物，如二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、卵磷脂酰胆碱(epc)、氢化卵磷脂酰胆碱(hepc)、部分氢化卵磷脂酰胆碱(phepc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、大豆磷脂酰胆碱(spc)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、二花生酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二花生酰磷脂酰胆碱(dape)和二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)等。[0181]用于吸入或吹入的药物组合物包含药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上文所列出的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，通过口服或鼻腔呼吸途径施用组合物，以产生局部或全身作用。在一些实施例中，组合物由粒度介于10nm与100mm之间的颗粒构成。[0182]可以通过使用气体来雾化优选地无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置中呼吸雾化溶液，或者雾化装置可以附着到面罩、帐篷、气管插管和/或间歇正压呼吸机(呼吸机)。可以从以适当方式递送调配物的装置优选地通过口服或鼻腔施用溶液、悬浮液或粉末组合物。[0183]在一些实施例中，本文的任何药物组合物可以进一步包括基于组合物的预期治疗用途的第二治疗剂。[0184](b)保健食品产品[0185]在一些实施例中，本文所描述的组合物可以是保健食品产品，其可以是用于滋养人和动物、用于治疗病毒感染或特别是冠状病毒感染的任何种类的液体和固体/半固体材料。保健食品产品可以是食品产品(例如，基于茶的饮料、果汁、软饮料、咖啡、牛奶、果冻、饼干、谷物、巧克力、小吃棒、草药提取物、乳制品(例如，冰淇淋和酸奶))、食品/膳食补充剂或营养调配物。[0186]本文所描述的保健食品产品可以包括一种或多种可食用载体，其赋予如本文所描述的产品中的组合物一种或多种益处。可食用载体的实例包含淀粉、环糊精、麦芽糊精、甲基纤维素、碳甲氧基纤维素、黄原胶和其水溶液。其它实例包含如本领域普通技术人员已知的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、像这类的材料和其组合。在一些实例中，本文所描述的保健食品产品可以进一步包含神经保护性食品，如鱼油、亚麻籽油和/或苯甲酸盐。[0187]在一些实例中，保健食品产品是营养组合物，所述营养组合物是指含有食品来源的组分并且除了食品中发现的基本营养价值之外还赋予额外健康益处的组合物。如本文所描述的营养药物组合物包括本文所描述的组合物以及促进良好健康和/或增强稳定性和生物活性的另外的成分和补充剂。[0188]营养组合物的作用可以是快速的或/和短期的，或者可以帮助实现如本文所描述的长期健康目标，例如改善健康状况，例如改善患有病毒感染或有病毒感染风险的人受试者的健康状况。营养组合物可以包含在可食用材料中，例如，作为膳食补充剂或药物调配物。作为膳食补充剂，可以包含另外的营养素，如维生素、矿物质或氨基酸。组合物也可以是饮料或食品产品，例如茶、软饮料、果汁、牛奶、咖啡、饼干、谷物、巧克力和小吃棒。如果需要，可以通过添加甜味剂如山梨糖醇、麦芽糖醇、氢化葡萄糖浆和氢化淀粉水解产物、高果糖玉米糖浆、蔗糖、甜菜糖、果胶或三氯蔗糖来使组合物变甜。[0189]本文所公开的营养组合物可以呈溶液的形式。例如，可以在介质如缓冲液、溶剂、稀释剂、惰性载体、油或奶油中提供营养调配物。在一些实例中，调配物存在于任选地含有非水性助溶剂如醇的水性溶液中。营养组合物也可以呈粉末、糊剂、胶状物、胶囊或片剂的形式。乳糖和玉米淀粉通常用作胶囊的稀释剂和片剂的载体。通常添加润滑剂，如硬脂酸镁，以形成片剂。[0190]可以将保健食品产品调配为适合的施用途径，例如口服施用。对于口服施用，组合物可以采取例如，通过常规手段用可接受的赋形剂如粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)制备的片剂或胶囊的形式。可以通过本领域众所周知的方法将片剂包覆。还包含棒和其它可咀嚼的调配物。[0191]在一些实例中，保健食品产品可以呈液体形式，并且所述一种或多种可食用载体可以是溶剂或分散介质，其包括但不限于乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)或其组合。可以例如通过以下来维持适当的流动性：使用包衣如卵磷脂；通过分散在载体如例如液体多元醇或脂质中来维持所需的粒度；使用表面活性剂，如例如羟丙基纤维素；或其组合。在许多情况下，将可取的是包含等渗剂，如例如糖、氯化钠或其组合。[0192]用于口服施用的液体调配物可以采取例如溶液、糖浆剂或混悬剂的形式，或者其可以呈现为干燥产品以在使用前用水或其它适合的媒剂构造。在一个实施例中，可以将液体调配物调配成与果汁一起施用。此类液体调配物可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒剂(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸酯或山梨酸酯)制备。[0193]本文所描述的保健食品产品可以进一步包括一种或多种第二治疗剂，包含本文所描述的那些。[0194](c)医疗食品产品[0195]本公开还提供了医疗食品产品的组合物，其用于改善在病毒感染期间或在有病毒感染风险期间的基本病状。医疗食品产品是调配成肠内消耗或施用的食品产品。此类食品产品通常在医师的监督下用于如本文所描述的那些靶疾病的具体膳食管理。在一些情况下，此类医疗食品组合物是为需要治疗的患者(例如，患有疾病的人类患者或需要使用所述产品作为主要活性剂用于通过具体膳食管理来减轻疾病或病状的人类患者)专门调配和加工(与以自然状态使用的天然存在的食物相反)。在一些实例中，本文所描述的医疗食品组合物不是医师将其简单推荐为整体饮食的一部分以管理症状或降低疾病或病状的风险的那些医疗食品组合物之一。[0196]包括一种或多种式(i)化合物或其盐和至少一种载体(例如，本文所描述的载体)的本文所描述的任何医疗食品组合物可以呈液体溶液的形式；粉末、棒、薄片、在适当的液体或适合的乳剂中的悬浮液，如下文详述的形式。可以是天然存在的或合成的(非天然存在的)所述至少一种载体将赋予组合物一种或多种益处，例如，稳定性、生物利用度和/或生物活性。本文所描述的载体的任何载体可以用于制备医疗食品组合物。在一些实施例中，医疗食品组合物可以进一步包括选自包含但不限于以下的组的一种或多种另外的成分：天然香料、人造香料、主要痕量和超痕量矿物质、矿物质、维生素、燕麦、坚果、调料、牛奶、蛋、盐、面粉、卵磷脂、黄原胶和/或甜味剂。可以将医疗食品组合物放置在适合的容器中，所述容器可以进一步包括至少一种另外的治疗剂，如本文所描述的那些治疗剂。[0197](d)试剂盒[0198]本公开还提供了用于改善基本医疗病状的试剂盒。此类试剂盒可以包含一个或多个容器，其包括如本文所描述的组合物，以及任选地还如本文所描述的第二治疗剂中的一种或多种。[0199]在一些实施例中，试剂盒可以包括根据本文所描述的任何方法使用的说明书。所包含的说明书可以包括例如对式(i)组合物的施用的描述，以及任选地对第二治疗剂的施用的描述，以改善病毒感染或有病毒感染风险的医疗病状。试剂盒可以进一步包括基于鉴定个体是否患有疾病或是否存在疾病风险来选择适于治疗的个体的描述。在仍其它实施例中，说明书包括向有病毒感染风险的个体施用本公开的一种或多种药剂的描述。[0200]关于使用式(i)组合物以实现预期治疗效果的说明书通常包含有关预期治疗的剂量、给药时间表和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘或qr代码上携带的说明书)也是可接受的。[0201]标签或包装插页可以表明组合物用于预期的治疗用途。可以提供说明书以用于实践本文所描述的任何方法。[0202]本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包含但不限于室、小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的密拉(mylar)或塑料袋)等。还设想了与具体装置，如吸入器、喷雾器、呼吸机、鼻腔施用装置(例如，雾化器)或输注装置(如微型泵)组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉输液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器也可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。[0203]计量剂量吸入器是一种以雾状物的形式向患者递送可以吸入的经测量的一定量药物的装置。将药物溶解或悬浮于低沸点溶剂中，储存在加压瓶中，将瓶子连接到压力开关。低沸点溶剂使加压瓶在室温下维持较高的内部气压。一旦按压开关，瓶子中的液体将定量释放，并且药物将以气溶胶的形式喷雾到空气中。药物被吸入气道中。[0204]在一些实施例中，计量剂量吸入器(mdi)的阀中的计量室的大小可以为25ul、50ul、75ul或100ul。[0205]在一些实施例中，mdi罐表面通过多种单体中的一种或多种单体的倍数改性以提高药物稳定性和药物递送。特别优选的涂层往往是纯全氟烷氧基亚烷基(pfa)以及聚四氟乙烯(ptfe)和聚醚砜(pes)的共混物。[0206]试剂盒可以任选地提供如缓冲液等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施例中，本发明提供了包括上文所描述的试剂盒的内容物的制品。[0207]iii.式(i)组合物的应用[0208]本公开提供一种药物组合物和方法，所述药物组合物和方法用于治疗受试者的某些病症、疾病和/或减轻其症状。[0209]在一些实施例中，本公开提供了一种能够有效抑制3c样蛋白酶(3clpro)的组合物和其在抑制、治疗、降低病毒载量和/或降低遭受病毒感染的患者的临床结果中的发病率或死亡率中的用途。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包括(1)一种或多种式(i)化合物或其药学上可接受的盐和(2)药学上可接受的载体；在一些实施例中，有效量是预防有效量(例如，有效抑制有需要的受试者的病毒3clpro的量，或者有效治疗或减少病毒载量和/或降低遭受病毒感染的受试者的临床结果中的发病率或死亡率的量)。[0210]在一些实施例中，要通过本文所公开的方法治疗的靶病毒感染是由冠状病毒属感染引起的肺炎，其可以包含新型冠状病毒(2019-ncov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)和中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)。在一些实施例中，要通过本文所公开的方法治疗的靶病毒感染由α冠状病毒株229e和nl63、β冠状病毒株oc43和hku1以及由来自其它哺乳动物向人的新型传播引起的共享3clpro的蛋白同源性和蛋白质水解功能的冠状病毒株引起。[0211]在又另一方面，本公开进一步提供了降低个体将患上具有临床后遗症的病理性冠状病毒感染的风险的方法。所述方法通常涉及施用治疗有效量的3clpro抑制剂组合物，所述组合物包括治疗有效量的本文组合物。[0212]确定如本文所描述的组合物的量是否达到治疗效果对于本领域技术人员而言将会是显而易见的。如本领域的技术人员所认识到的，有效量有所不同，这取决于正在治疗的特定病状、病状的严重程度、包含年龄、身体状况、大小、性别和体重在内的个体患者参数、治疗持续时间、同时疗法的性质(如果有的话)、具体施用途径、遗传因素和在健康从业者的知识和专业技能内的相似因素。这些因素是本领域普通技术人员熟知的，并且可以通过常规实验解决。通常优选使用个别组分或其组合的最大剂量，也就是说，根据合理的医学判断的最高安全剂量。[0213]如半衰期等经验性考虑通常将有助于确定剂量。施用频率和/或施用途径可以在治疗过程中确定并进行调整，并且通常但不一定是基于靶疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，如本文所描述的组合物的持续连续释放调配物可能是合适的。用于实现缓释的各种调配物和装置是本领域已知的。[0214]通常，取决于上述因素，对于任何组合物的施用，示例性每日剂量可以在约0.1μg/kg到3μg/kg、到30μg/kg、到300μg/kg、到3mg/kg、到30mg/kg、到100mg/kg、到300mg/kg、到1g/kg或更大的任何范围内。对于在若干天或更长时间内的重复施用，根据病状持续治疗，直至出现期望的症状抑制或直至达到足以减轻靶疾病或病症或其症状的治疗水平。示例性给药方案包括在适当的时间段内以适当的间隔施用一种或多种初始剂量。如有必要，可以在适当的时段内以适当的间隔向受试者给予多次维持剂量。然而，根据从业者希望实现的药代动力学衰变模式，其它剂量方案可能是有用的。例如，设想每天或每周给药一次到二十四次。在一些实施例中，可以使用的剂量在约3μg/mg到约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg、约3mg/kg、约30mg/kg和约300mg/kg)的范围内。在一些实施例中，给药频率可以在医学或治疗上需要的时间段内连续进行，每一小时、每两小时、每天四次、每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天一次、每周一次、每2周一次、每4周一次、每2个月一次、每3个月一次或给予仅一次。给药方案可以随时间而变化。[0215]在一些实施例中，对于正常体重的成年患者，可以施用的剂量在约0.3到500.00mg/kg/天(例如，0.5到400mg/kg/天、1-300mg/kg/天、5-300mg/kg/天或10-200mg/kg/天)的范围内。特定的给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定个体和所述个体的病史以及个别药剂的性质(如药剂的半衰期和本领域所熟知的其它考虑)。[0216]医学领域的普通技术人员已知的常规方法可以用于根据要治疗的病毒感染疾病的类型或疾病的部位向受试者施用组合物(例如，药物组合物、保健食品组合物、营养组合物或医疗食品组合物)。这种组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、颊、阴道或通过植入式储药器施用。如本文所使用的术语“肠胃外”包含皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。[0217]组合物可以通过肺递送系统施用，即将活性药物成分施用到肺中。肺递送系统可以是吸入器系统。在一些实施例中，吸入器系统是加压计量剂量吸入器、干粉吸入器或雾化器。在一些实施例中，吸入器系统具有垫片。[0218]在一些实施例中，加压计量剂量吸入器包含推进剂、助溶剂和/或表面活性剂。在一些实施例中，推进剂选自包括氟碳化合物的组，如三氯一氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、一氯二氟乙烷、二氟乙烷、四氟乙烷、七氟丙烷、八氟环丁烷。在一些实施例中，共溶剂选自包括纯净水、乙醇、丙二醇、甘油、peg400、peg600、peg800和peg1000的组。在一些实施例中，表面活性剂或润滑剂选自包括以下的组：山梨醇酐三油酸酯、大豆卵磷脂、卵磷脂、油酸、聚山梨醇酯80、硬脂酸镁和十二烷基硫酸钠。在一些实施例中，防腐剂或抗氧化剂选自包括以下的组：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、苯扎氯铵、氯化十六烷基吡啶、百里酚、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫酸氢钠、edta。在一些实施例中，ph调节或张力调节选自包括以下的组：氧化钠、氨丁三醇、氨、hcl、h2so4、hno3、柠檬酸、cacl2、caco3。[0219]在一些实施例中，干粉吸入器包含分散剂。在一些实施例中，分散剂或载体颗粒选自包括以下的组：乳糖、乳糖一水合物、无水乳糖、甘露醇、葡萄糖，其粒度为约1-100μm。[0220]在一些实施例中，雾化器可以包含助溶剂、表面活性剂、润滑剂、防腐剂和/或抗氧化剂。在一些实施例中，共溶剂选自包括以下的组：纯净水、乙醇、丙二醇、甘油、peg(例如，peg400、peg600、peg800和/或peg1000)。[0221]在一些实施例中，表面活性剂或润滑剂选自包括以下的组：山梨醇酐三油酸酯、大豆卵磷脂、卵磷脂、油酸、硬脂酸镁和十二烷基硫酸钠。[0222]在一些实施例中，防腐剂或抗氧化剂选自包括以下的组：苯甲酸钠、苯甲酸钾、苯甲酸钙、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、苯扎氯铵、氯化十六烷基吡啶、百里酚、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫酸氢钠、edta。[0223]在一些实施例中，雾化器进一步包含ph调节或张力调节，其选自包括以下的组：氧化钠、氨丁三醇、氨、hcl、h2so4、hno3、柠檬酸、cacl2、caco3。[0224]可注射组合物可以含有各种载体，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注法施用水溶性抗体，由此注入具有本文所描述的组合物的药物调配物和生理学上可接受的赋形剂。生理学上可接受的赋形剂可以包含例如5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液(ringer'ssolution)或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂，例如本文组合物的适当可溶性盐形式的无菌调配物可以溶解并施用于药物赋形剂中，如注射用水、cov3clpro和sarscovplpro序列(登录分别为1uk3_a和4mm3_b)与2019-ncov多蛋白orf1ab序列(登录：qho62111.1)进行比对。结果显示，2019-ncov3clpro的结构域定位于ser3264-gln3569处，并且sars-cov3clpro的蛋白质序列与2019-ncov3clpro的蛋白质序列96％相同。[0240]sars-cov3clpro的关键催化残基his41和cys144以及序列特征tyr160-met161-his162在2019-ncov3clpro中是保守的。[0241]2019-ncovplpro的结构域来自glu1564-lys1878，并且sars-cov-plpro的蛋白质序列和2019-ncovplpro的蛋白质序列83％相同。然而，sars-covplpro的催化三联体cys1651-his1812-asp1826和锌结合残基cys1729、cys1732、cys1764和cys1766在2019-ncovplpro中是保守的。因此，3clpro在整个冠状病毒家族中比plpro更保守，这表明3clpro在冠状病毒家族的化脓中起着重要作用。[0242]实例2：2019-ncov与其它人冠状病毒之间的冠状病毒3c样蛋白酶(3clpro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)结构域蛋白质序列的比较[0243]从genbank获得了mers-cov多蛋白orf1ab(登录：afs88944.1)、β冠状病毒oc43多蛋白orf1ab(登录：aar01012.1)和hku1多蛋白orf1ab(登号：azs52616.1)的蛋白质序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。为了比较2019-ncov3clpro与其它三种人冠状病毒株mers-cov、oc43和hku1之间的序列同源性，使用方法将2019-ncov3clpro序列(ser3264-gln3569)与mers-cov多蛋白orf1ab、oc43多蛋白orf1ab或hku1多蛋白orf1ab的蛋白质序列进行比对。2019-ncov3clpro与merscov、oc43和hku1之间的3clpro序列同一性分别为51％、48％和48％。然而，在所有经测试的冠状病毒株中，催化残基his41和cys144以及序列特征tyr160-met161-his162是保守的，这强调了3clpro的功能重要性。[0244]2019-ncov与其它三种冠状病毒(mers-cov、oc43和hku1)之间的plpro氨基酸序列同一性性也通过序列比对确定。使用blast方法将2019-ncovplpro序列(glu1564-lys1878)与merscov多蛋白orf1ab、oc43多蛋白orf1ab和hku1多蛋白orf1ab进行比对。结果表明，2019-ncovplpro与mers-cov、oc43和hku1之间的序列同一性分别为31％、29％和30％。然而，2019-ncovplpro的催化三联体cys1651-his1812-asp1826和锌结合残基cys1729、cys1732、cys1764和cys1766在冠状病毒株中是保守的。[0245]这些冠状病毒的序列同一性在3clpro中始终高于plpro，这表明3clpro在病毒复制中的重要性。这些结果表明3clpro可能是开发抗病毒候选药物的关键治疗靶标。[0246]实例3：2019-ncov与甲型流感病毒之间的蛋白质序列的比较[0247]为了研究2019-ncov与甲型流感病毒之间的同源性，从genbank获得了2019-ncov多蛋白orf1ab的蛋白质序列(登录：qho62111.1)、甲型流感病毒(h1n1)a/猪/韩国/61/2016的序列(登录：axu05463.1到axu05472.1)、a型禽流感病毒(h1n1)a/野生型鸟类/韩国/sk14/2014的序列(登录：anc28540.1到anc28551.1)和甲型流感(h7n9)病毒a/安徽/1/2013(登录：ago51387.1到ago51410.1)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。结果表明，2019-ncov多肽与任何甲型流感病毒蛋白之间均未发现显著同源性。[0248]实例4：测试化合物针对2019-ncov3cl蛋白酶(2019-ncov3clpro)的抑制活性[0249]通过测量由于荧光底物(dabcyl-ktsavlqsgfrkme-edans)的切割引起的荧光增强，在体外测定2019-ncov3clpro的蛋白水解活性。为了分析抑制潜力，将下表1中所示的各种化合物与含有20mmbis-tris缓冲液(ph7.0)、35nm2019-ncov3cl蛋白酶和6μm荧光底物的反应混合物混合。在某些时间点，使用荧光读板仪在538nm处测量在355nm处激发的酶促反应产生的荧光变化。使用以下等式计算在存在化合物的情况下的蛋白水解活性：[0250]蛋白酶活性(％)＝(荧光样品，300秒-荧光样品，0秒)/(荧光dmso，300秒-荧光dmso，0分钟)×100％。[0251]抑制活性(％)＝100％-蛋白酶活性。所有反应均在96孔板中一式二份进行。[0252]在这项测定研究中，分析了下表1(3μm的列)中列出的样品1-5、11-12、17-19。样品17和19的描述可以在us10265336和us10105378中找到，所述文献中的每个文献的相关公开内容出于本文所引用的目的和主题通过引用并入。在这些样品中，样品1、2和11在3μm浓度下表现出大约一半的最大抑制(ic50)，导致蛋白水解活性分别下降到52％、55％和48％。另外，样品3、4、5、12和17在3μm浓度下显示出针对2019-ncov3clpro的良好抑制活性，这是因为蛋白酶活性下降到0到15％(图1)。总之，样品3、4、5、12和17在3μm浓度下显示出针对2019-ncov3clpro的完全抑制活性，并且结果具有统计学意义。[0253]为了进一步研究化合物结构/组成与和针对2019-ncov3clpro的抑制活性之间的相关性，使用表1(1μm的列)中列出的1μm的每个样品进行了测定研究。[0254]在37℃下用48μl反应混合物(20mmbis-tris中的50nmsars-cov-2病毒3cl蛋白酶，ph7.4)预温育1μm的每个样品(2μl)，持续30分钟。然后，将50μl荧光肽底物(6μm)添加到混合物中并轻轻混合。在37℃下使用荧光读板仪在485nm处测量在360nm处激发的反应产生的4分钟内的荧光变化。使用以下等式计算在存在化合物的情况下的蛋白水解活性：[0255]蛋白酶活性(％)＝(荧光样品，4分钟-荧光样品，0分钟)/(荧光dmso，4分钟-荧光dmso，0分钟)×100％。[0256]抑制活性(％)＝100％-蛋白酶活性。所有反应均在96孔板中一式二份进行。[0257]结果如下表1(1μm的列)和图2所示。[0258]表1：示例性式(i)化合物针对2019-ncov3clpro的抑制活性[0259][0260][0261][0262][0263][0264]3'，seqidno:1)和3cl反向引物(5'-ctccggtattgagggacgc-3'，seqidno:2)，应用逆转录(rt)-pcr扩增sars-cov-23clpro的cdna。对经扩增的cdna产物进行测序、确认，并通过blast搜索示出与所报告的sars-cov-23clpro的100％同一性(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。[0281]为了表达蛋白质，将经扩增的cdna产物插入到pet42b载体中，并且随后转化到大肠杆菌菌株bl21中。将具有pet42b-sars-cov-23clpro的经转化的细胞在含有100μg/ml卡那霉素的luria-bertani(lb)琼脂平板上温育以供选择(37℃；14-16小时)。分离卡那霉素抗性克隆，并在250ml烧瓶中培养。当培养密度在600nm处达到0.8光密度时，通过在16℃下添加0.4mm异丙基-b-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白质表达。在22小时之后，通过离心和裂解采集经培养的细胞。最后，使用谷胱甘肽4b柱从细菌裂解物中纯化sars-cov-23clpro，然后与1％因子xa蛋白酶溶液温育以去除谷胱甘肽s-转移酶标签。在储存之前，在ph7.4的具有12mm三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、120mm氯化钠、0.1mm乙二胺四乙酸和2mm二硫苏糖醇的缓冲液中透析未经标记的3clpro。[0282]测试制品和对照样品的制备[0283]测试制品制备[0284]测试制品(snb01)是包括式(ib)化合物的混合物的组合物，其中r1-r5中的每一个都存在并在本文中阐述。snb01中约4-8％的式(ib)化合物具有5个没食子酰基部分，snb01中约28-33％的式(ib)化合物具有6-7个没食子酰基部分，并且snb01中约58-63％的式(ib)化合物具有8-12个没食子酰基部分。[0285]将5毫克(±10％)的测试制品(snb01)溶解于ddh2o中，以获得10mm储备溶液。下表2示出了用ddh2o的储备溶液的连续稀释液。snb01-1到snb01-12用于蛋白酶活性测定。[0286]表2：3clpro蛋白酶抑制测定中评估的样品[0287]样品体积(μl)ddh2o(μl)总体积(μl)浓度(μm)snb01-120801002000snb01-250501001000snb01-35050100500snb01-45050100250snb01-55050100125snb01-6505010062.5snb01-7257510015.62snb01-850501007.81snb01-950501003.90snb01-1050501001.95snb01-1150501000.97snb01-1250501000.48[0288]对照[0289]不含snb01的ddh2o用作阴性对照。[0290]3cl蛋白酶活性测定程序[0291]荧光肽底物用于监测3cl蛋白酶的蛋白水解反应。添加2μl可变浓度的测试制品样品(snb01-1到snb01-12)，并在37℃下与48μl反应混合物(含50nmsars-cov-2病毒3cl蛋白酶的20mmbis-tris，ph7.4)预温育30分钟。然后，将50μl荧光肽底物(6μm)添加到混合物中并轻轻混合。在37℃下，在荧光酶标仪上立即监测来自蛋白酶反应的荧光变化4分钟。荧光激发波长和发射波长分别为360nm和485nm。蛋白酶活性表示为荧光强度，并通过以下等式计算：[0292]抑制(％)＝1-[(荧光样品，4分钟-荧光样品，0分钟)/(荧光ddh2o，4分钟-荧光ddh2o，0分钟)]×100％。[0293]结果[0294]从这项研究获得的结果表明，如在蛋白酶酶促测定中观察到的，snb01对3clpro具有强效的抑制活性。测定snb01针对3clpro的50％抑制浓度(ic50)为约0.474μm(图4)。[0295]3c样蛋白酶(3clpro)在酶促水解病毒多蛋白以产生功能性病毒蛋白中起着关键作用。多蛋白的加工对sars-cov-2的复制和成熟至关重要。多蛋白含有至少14个切割位点(grum-tokars等人,2008)。由于这些位点的大多数蛋白水解加工是由3clpro进行的，因此抑制这种蛋白水解酶被认为是针对sars-cov-2感染的疗法的主要靶标。众所周知，3clpro在冠状病毒中是保守的。例如，sar-cov2的3clpro与正冠状病毒亚科共享大约40-50％的序列同一性，包含mers-cov(52.0％)、hcov-oc43(49.0％)、hcov-nl63(48.4％)、hcov-hku1(45.2％)和hcov-229e(41.9％)。此外，sar-cov2的3clpro与sars共享约96.1％的序列同一性。来自这些病毒的3clpro序列的序列可以在例如genbank中找到，例如sars-cov-2(yp_009742612.1)、sars-cov(np_828863)、mers-cov(yp_009047233.1)、hcov-nl-63(5gwy_b)、hcov-229e(2zu2_b)、hcov-oc43(yp_009555250)和hcov-hku1(yp_459936.1)，并且其活性二分体定位于组氨酸-41(his41)和半胱氨酸-145(cys145)两者中。另外，3clpro的多蛋白底物中的切割位点在sars-cov-2、sars-cov和如本领域已知的其它人冠状病毒中也共享高度同源性。因此，抑制3clpro可能是sars-cov-2感染患者的可靠治疗方法。[0296]本文所报告的结果表明，snb01通过抑制病毒复制中的关键半胱氨酸蛋白酶3clpro来抑制sars-cov-2复制。[0297]如与其它抗病毒候选物相比，snb01显示出显著较低的ic50值(0.4741μm)。目前为止，已经研究了若干种抗病毒药剂作为阻断sars3clpro的潜在抑制剂，并且其中一些药物已在临床开发中(表3)。例如，洛匹那韦-利托那韦组合治疗改善sars-cov感染患者的冠状病毒感染的临床结果，包含死亡率和插管率(chan等人,2003)。然而，洛匹那韦-利托那韦的组合疗法未能改善严重sars-cov-2患者的临床结果，包含死亡率(cao等人,2020)。除其它(沙奎那韦、奈非那韦和替拉那韦)外，这两种抗病毒化合物对3clpro没有强效抑制(参见表3)。其ic50均显示出大于100μm。发现表明，snb01可以是用于治疗冠状病毒感染(例如，由sars-cov-2引起的感染)和相关疾病(例如，covid-19)的有前景的候选物。[0298]表3：sars-cov-2的抗病毒候选药物的3c样蛋白酶的ic50[0299][0300]实例6：在吸入或口服施用之后示例性式(i)化合物的肺浓度和血浆浓度[0301](i)在单次吸入处理之后的肺单宁酸浓度和血浆单宁酸浓度[0302]将c57bl/6j小鼠放置于吸入200mg/ml的富集的单宁酸的雾化装置中，持续100分钟。在单宁酶处理之后，通过hplc测定单宁酸总量(商用单宁酶：167u/g，分析级e，德国默克基团(merckkgaa,germany)，下同)。下表4中呈现的数据表明，在吸入处理之后，单宁酸在血浆和肺两者中均具有良好的生物利用度。[0303]表4：在吸入单宁酸之后单宁酸在小鼠中的肺浓度和血浆浓度[0304]肺(μg/g)血浆(μg/ml)小鼠-24.318.16小鼠-44.347.69小鼠-63.665.78平均值4.107.21[0305](ii)在反复吸入之后的肺单宁酸浓度[0306]将c57bl/6j小鼠放置于雾化装置中，以每天吸入不同剂量并吸入持续14天的持续时间。在单宁酶处理之后，通过hplc测定富集的单宁酸的总量。下表5所示的结果表明，在反复吸入施用富集的单宁酸之后，单宁酸在肺中具有良好的生物利用度。[0307]表5：在反复吸入之后的肺单宁酸浓度[0308]肺(μg/g)3.13mg/kg(36mg/ml，60分钟)49.088.5mg/kg(200mg/ml，60分钟)45.069.36mg/kg(108mg/ml，60分钟)61.5112.75mg/kg(200mg/ml，60分钟)28.84[0309](iii)在单次口服施用之后的肺单宁酸浓度[0310]向斯普拉-道来大鼠(sprague-dawleyrat)口服施用1000mg/kg的富集的单宁酸。在单宁酶处理之后，通过hplc测定单宁酸的总量。如表6和7所示，在通过单次口服剂量施用或重复七天每日施用的口服施用之后，观察到单宁酸在肺中具有良好的生物利用度。[0311]表6：在单次口服剂量之后的肺单宁酸浓度[0312][0313]表7：在7天所报告的每日剂量之后的肺单宁酸浓度[0314][0315]实例7：snb01的细胞毒性和sars-cov-2杀病毒测定[0316]这项研究的目的是评估snb01针对sars-cov-2的细胞毒性和杀病毒活性。[0317]测试制品和媒剂对照制品[0318]测试制品[0319][0320]媒剂对照[0321]名称二甲基亚砜(dmso)规格500ml/瓶外观无色液体储存在室温下储存在密封容器中[0322]细胞系和sars-cov-2病毒的制备[0323]veroe6细胞系[0324]将veroe6细胞(atcc#crl-1586)在37℃下维持处于具有5％co2大气的加湿温育箱中的补充有10％胎牛血清(fbs，目录号10437028，赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))的达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem，目录号11995040，赛默飞世尔科技公司)中。用0.25％胰蛋白酶处理80-90％汇合的经培养的细胞以进行细胞分离和传代。将经处理的细胞与dmem培养基混合，并以1000rpm离心5分钟，以进行细胞分离和胰蛋白酶去除。在细胞计数之后，将veroe6细胞以每孔0.1ml104个细胞的密度分配到96孔微孔板中，并在实验前温育24小时。对于杀病毒测定，感染培养基具有2％fbs(choy等人,2020)。[0325]sars-cov-2病毒[0326]病毒从中国台湾疾病控制中心(centerfordiseasecontrol,taiwan,china)获得。[0327]测试制品和对照样品的制备[0328]细胞毒性测定的测试制品溶液[0329]在实验当天制备测试制品并将其保持处于室温下。在实验结束后，将剩余测试制品作为一般废物丢弃。[0330]将136.1mgsnb01溶解于dmso或双蒸馏水(ddh2o)中，以获得80mm储备溶液。用dmem培养基对8.59-8800μm溶液进行储备溶液的连续稀释，如下表8所示。具有系列浓度的测试制品被命名为snb01-1到snb01-11，以用于细胞毒性测试。媒剂(dmso或ddh2o)的最终浓度为1％。[0331]表8：细胞毒性测定中评估的样品[0332][0333]细胞毒性测定的媒剂对照[0334]在dmem培养基(含2％或10％fbs)中应用1％(v/v)的媒剂(dmso或ddh2o)作为媒剂对照。[0335]sars-cov-2杀病毒测定的测试制品溶液的制备[0336]在实验当天制备测试制品，并将其保持处于室温下。在实验结束之后，将剩余样品作为一般废物丢弃。[0337]将8.5mgsnb01溶解于dmso中以获得5mm储备溶液。用培养基进行连续稀释，以获得浓度在0.002到100μm范围内的含2％dmso的snb01的测试制品，如下表9所示。这些样品被标记为snb01-12到snb01-23，以用于基于细胞的sars-cov-2杀病毒测定。[0338]表9：sars-cov-2杀病毒测定中评估的样品[0339][0340]sars-cov-2杀病毒测定的阳性对照和媒剂对照[0341]最终浓度为15μm的瑞德西韦(目录号s8923，selleckchem)以及1％的dmso分别用作阳性对照和媒剂对照，瑞德西韦针对sars-cov-2感染具有抑制活性。[0342]细胞毒性和sars-cov-2杀病毒测定[0343]细胞毒性测定[0344]将veroe6细胞以104个细胞/孔的密度接种到96孔板上，然后在加湿的细胞培养温育箱中维持处于37℃和5％的co2。在24小时之后，移除培养基，然后将10μl测试制品(snb01-1到snb01-11)与100μl含2％fbs的dmem培养基混合，并添加到孔中的veroe6细胞中。在去除上清液的实验当天之前，将细胞温育另外24小时，然后添加含100μl培养基和10μlcck8溶液的110μl细胞计数溶液(目录号ck04-05，东仁分子技术公司(dojindomoleculartechnologies,inc.))并温育2小时。[0345]在形成甲瓒后测定细胞活力，并在sunrisetm吸光度酶标仪(目录号instsun-1，tecan)上以450nm的吸光度对所述细胞活力进行测量。[0346]sars-cov-2杀病毒测定[0347]接种veroe6细胞(104个细胞/100μl/孔)，并在96孔微孔板中温育，然后在含5％co2的加湿细胞培养温育箱中维持处于37℃。在24小时之后，用含有不同浓度的测试制品snb01-12到snb01-23的感染培养基(含2％fbs)刷新veroe6细胞的上清液。随后，将100μl含有2％fbs的sars-cov-2病毒培养基[感染复数(moi)＝0.01]添加到96孔微孔板的每个孔中，以在含有1％dmso和2％fbs的200μl培养基中达到0.001到50.00μm的测试制品的最终浓度。[0348]在病毒接种之后二十四小时，转移每个孔的上清液，并通过qiaamp病毒rna迷你试剂盒(目录号52906，凯杰公司(qiagen))进行rna提取，并使用trizoltm试剂(目录号15596026，赛默飞世尔科技公司)对每个孔的细胞层进行rna提取。使用用于qpcr的hiscriptiiqrtsupermix试剂盒(目录号r223，诺唯赞生物技术公司(vazymebiotech))完成cdna的逆转录。[0349]用sensifasttmhi-rox试剂盒(#bio-92006，bioline公司)在steponeplustm实时pcr系统(应用生物系统公司(appliedbiosystems))上使用两步定量pcr对sars-cov-2病毒基因组进行定量。使用正向(5'-gtgaratggtcatgtgtggcgg-3'；seqidno:3)和反向(5'-caratgttaaasacactattagcata-3'；seqidno:4)引物扩增sars-cov-2rdrp基因(cormanetal.,2020)。[0350]对用已知的病毒pfu(噬斑形成单位)的sars-cov-2cdna的连续稀释液进行相同的定量pcr，并用于绘制标准曲线，以对测试制品处理的细胞的病毒计数进行内插。sars-cov-2的杀病毒活性表示为抑制百分比，并使用以下等式计算：[0351]抑制(％)＝[1-(pfu样品/pfu媒剂平均值)]×100％。[0352]针对测试制品的对数浓度(x轴)绘制了样品抑制百分比(y轴)。用使用非对称(五参数)逻辑剂量应答曲线的非线性回归拟合浓度抑制图；ec50、ec90和ec99(分别抑制50％、90％和99％sars-cov-2病毒计数的浓度)由等式得出。[0353]结果[0354]细胞毒性测定[0355]当veroe6细胞维持处于补充有10％fbs的dmem中时，确定snb01(使用ddh2o作为媒剂)的50％细胞毒性浓度(cc50)为210.60μm(图5)。补充有2％fbs的dmem中的snb01(使用dmso作为媒剂)的cc50为52.46μm(图6)。[0356]sars-cov-2杀病毒测定[0357]从针对veroe6细胞中的sars-cov-2感染的snb01处理的上清液中测定的有效浓度(ec50、ec90和ec99)分别为0.585、8.307和12.900μm(图7a)。从细胞层测定的有效浓度(ec50、ec90和ec99)分别为0.515、10.540和19.130μm(图8a)。瑞德西韦在上清液和细胞层两者中表现出针对15μm的sars-cov-2的99％的抑制活性(ec99)(图7b；和图8b)。[0358]snb01的治疗指数在细胞中为101.9(cc50＝52.460μm/ec50＝0.515μm)，并且在上清液中为89.7(cc50＝52.460μm/ec50＝0.585μm)，而培养基中10％的fbs将进一步将细胞和上清液的治疗指数分别提高到408.9和360.0。[0359]从这项研究获得的结果表明，snb01针对sars-cov-2感染的效力与瑞德西韦针对sars-cov-2感染的效力相当(表8)。而且，作为sars-cov-23clpro抑制剂，snb01显示出的治疗指数明显优于洛匹那韦的治疗指数(1.906)和利托那韦的治疗指数(0.489)(表10)。另外，veroe6中snb01的cc50高达210.60μm(在10％fbs培养基中)，这为支持其临床开发提供了充足的安全裕度。[0360]表10：洛匹那韦、利托那韦和瑞德西韦针对sars-cov-2感染的治疗指数[0361][0362](moi，感染复数)[0363]总之，snb01显示出强效的ec50以及针对sars-cov-2的杀病毒活性的高治疗指数(cc50/ec50)，表明snb01将有效抑制sars-cov-2以及其它冠状病毒的感染，例如，那些在其3clpro蛋白酶中共享高序列同源性的冠状病毒，并且因此有效治疗与感染相关的疾病，例如，covid-19。在不受理论约束的情况下，本文所报告的结果表明snb01不仅可以抑制胞内病毒复制，而且还可以阻止病毒在胞外传播，由此产生优越的抗病毒效果。[0364]实例8：snb01与sars-cov-2病毒3cl蛋白酶的结合[0365]这项研究的目的是研究snb01与sars-cov-2病毒3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(3cl蛋白酶，3clpro)的结合。[0366]测试制品和对照制品[0367]测试制品[0368][0369]3,4-二羟基-5-(3,4,5-三羟基苯甲酰氧基)苯甲酸(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-三(3,4-二羟基-5-(3,4,5-三羟基苯甲酰氧基)苯甲酰氧基)-6-((3,4-二羟基-5-(3,4,5-三羟基苯甲酰氧基)苯甲酰氧基)甲基)噁烷-2-基酯(缩写为β-10g)被鉴定为snb01中的主要组分之一。在此实例中对此分子进行了评估。此外，还测试了合成类似物(2s,3r,4s,5r,6r)-6-(((3-((3,4-二羟基-5-((3,4,5-三羟基苯甲酰基)氧基)苯甲酰)氧基)-4,5-二羟基苯甲酰)氧基)甲基)四氢-2h-吡喃-2,3,4,5-四基四(3-((3,4-二羟基-5-((3,4,5-三羟基苯甲酰基)氧基)苯甲酰氧基)氧基)-4,5-二羟基苯甲酸酯)(缩写为β-15g)。β-15g的构象与β-10g的构象类似，但多五个没食子酸(ga)部分。还分析了单个没食子酰基部分(ga；西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich))作为对照。[0370]β-10g的结构和β-15g的结构提供于上表1中，并且ga的结构如下所示：[0371][0372]表11：媒剂对照[0373]名称：无菌双蒸馏水(ddw)ddw生产设备：barnsteadsmart2pure，赛默科技公司外观：无色透明液体储存：储存在密封容器中正当性：ddw将用于制备测试制品调配物，并且还用作测定中的媒剂对照。[0374]材料[0375]反应缓冲液[0376]称取适量的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)、氯化钠、乙二胺四乙酸和二硫苏糖醇，并将其溶解于ddw中，以得到12mm、120mm、0.1mm和2mm的溶液。将反应缓冲液调节到ph7.4，并在室温下储存。[0377]非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(非变性page)[0378]关于非变性page浓缩凝胶：[0379]组分体积(ml)0.375mtris-hcl(ph＝8.8)4.275丙烯酰胺/双丙烯酰胺(30％/0.8％w/v)0.6710％(w/v)过硫酸铵0.05四甲基乙二胺0.005[0380]关于非变性page分离凝胶：[0381]组分体积(ml)0.375mtris-hcl(ph＝8.8)6.49丙烯酰胺/双丙烯酰胺(30％/0.8％w/v)3.410％(w/v)过硫酸铵0.1四甲基乙二胺0.01[0382]非变性page的运行缓冲液[0383]称取适量tris-hcl和甘氨酸，将其溶解于ddw中，以获得25mm和192mm的运行缓冲液，并在室温下储存，以用于非变性page。[0384]非变性page的样品缓冲液(2x)[0385]将62.5mmtris-hcl(ph6.8)、25％甘油和1％溴酚蓝溶解于ddw中，并在室温下储存。[0386]非变性page的固定溶液[0387]将50％甲醇和10％冰乙酸溶解于在ddw中，并在室温下储存。[0388]非变性page染色溶液[0389]将0.1％考马斯亮蓝r-250、50％甲醇和10％冰乙酸溶解于ddw中，并在室温下储存。[0390]sars-cov-2病毒3cl蛋白酶[0391]sarscov2的病毒rna从中国台北荣民总医院的病理学和检验医学部的临床样本获得。用3cl正向引物(5'-agtggttttagaaaaatggcattccc-3'；seqidno:1)和3cl反向引物(5'-ctccggtattgagggacgc-3'；seqidno:2)，应用逆转录(rt)-pcr扩增sars-cov-23clpro的互补dna(cdna)。对经扩增的cdna产物进行测序、确认，并通过blast搜索示出与所报告的sars-cov-23clpro的100％同一性(ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。[0392]为了表达蛋白质，将经扩增的cdna产物插入到pet42b载体中，并且随后转化大肠杆菌菌株bl21。将具有pet42b-sars-cov-23clpro的经转化的细胞在含有100ug/ml卡那霉素的luria-bertani(lb)琼脂平板上温育以供选择(37℃；14-16小时)。分离卡那霉素抗性克隆，并在250ml烧瓶中培养。当培养密度在600nm处达到0.8od时，通过在16℃下添加0.4mm异丙基-b-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白质表达。在22小时之后，通过离心和裂解采集经培养的细胞。最后，使用谷胱甘肽4b柱从细菌裂解物中纯化sars-cov-23clpro，然后与1％因子xa蛋白酶溶液温育以去除谷胱甘肽s-转移酶标签。在储存之前，在ph7.4的具有12mm三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、120mm氯化钠、0.1mm乙二胺四乙酸和2mm二硫苏糖醇的缓冲液中透析未经标记的3clpro。[0393]测试制品和对照样品的制备[0394]测试制品的溶液的制备[0395]在实验当天制备测试制品，并将其保持处于室温。在实验结束之后，将剩余溶液作为一般废物丢弃。[0396]将五毫克snb01、β-10g、β-15g和ga溶解于反应缓冲液中，以获得10mm储备溶液。如下表所示，用反应缓冲液进一步稀释储备溶液，以通过非变性page测定测试化合物与sars-cov-23clpro之间的相互作用。每个snb01样品的测试条件提供于下表12。[0397]表12：测试制品的连续稀释液[0398]样品代码体积(μl)反应缓冲液(μl)总体积(μl)浓度(μm)snb01-110901001000snb01-25050100500snb01-35050100250snb01-45050100125snb01-5505010062.5β-10g-110901001000β-10g-25050100500β-10g-35050100250β-10g-45050100125β-10g-5505010062.5β-15g-110901001000β-15g-25050100500β-15g-35050100250β-15g-45050100125β-15g-5505010062.5ga-110901001000ga-25050100500ga-35050100250ga-45050100125ga-5505010062.5[0399]阴性对照[0400]反应缓冲液用作阴性对照。[0401]运行非变性page的程序[0402]将10μl样品(参见表12，snb01-1到ga-5)与10μl40μmsars-cov-23clpro混合。通过程序61(rm-2lintelli混合器，elmiltd.)在4℃下以99rpm振荡所有反应混合物3小时。然后，将10μl反应混合物分别与相同体积的样品缓冲液(2x)混合。此外，将10μl20μmsars-cov-23clpro、snb01-2、β-10g-2、β-15g-2或ga-2分别与10μl样品缓冲液(2x)混合。所有样品均在4℃下以80v运行非变性page，持续100分钟。将凝胶浸泡在固定溶液中，并以100rpm振荡30分钟。然后，将凝胶移动到染色溶液中，并以100rpm振荡30分钟。最后，用ddw多次补充凝胶，并以120rpm振荡，直到凝胶背景完全脱色。[0403]结果[0404]如通过非变性page确定的，从这项研究获得的结果表明，snb01、β-10g或β-15g与sars-cov-23clpro之间存在显著结合。在snb01与3clpro(复合)温育之后，page上的3clpro条带变得模糊并移位，这表明蛋白酶与snb01之间形成复合物。(图9)图10示出了β-10g和3clpro复合还影响3clpro在page上的迁移率。取决于β-10g的量，条带偏移并拓宽。图11展示了在β-15g与3clpro复合之后，条带的定位发生变化并拓宽。相互作用还取决于β-15g的量。图12示出了ga没有显著结合来改变3clpro的迁移率。[0405]总之，snb01(包括β-10g)、β-10g和其类似物β-15g均表现出与3clpro的显著的剂量依赖性复合，这改变了3clpro在非变性page上的迁移率。然而，ga与3clpro的温育没有导致蛋白酶在非变性page上的迁移率变化，表明两种组分之间没有结合。[0406]综上所述，所有snb01、β-10g和β-15g均显示出与sars-cov-2的3clpro的显著结合活性，所述3clpro是病毒复制的关键酶。这一结果进一步证明snb01、β-10g和β-15g是3clpro蛋白酶的强效抑制剂，这预期产生抗病毒活性。[0407]实例9：通过等温滴定量热法初步研究snb01与sars-cov-2病毒3cl蛋白酶之间的相互作用[0408]这项研究的目的是确认snb01与sars-cov-2病毒3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(3cl蛋白酶，3clpro)的结合靶标。[0409]测试制品和对照制品[0410]测试制品[0411][0412]媒剂对照[0413]名称：无菌双蒸馏水(ddw)ddw生产设备：barnsteadsmart2pure，赛默科技公司外观：无色透明液体储存：储存在密封容器中。正当性：ddw将用于制备测试制品调配物，并且还用作测定中的媒剂对照。[0414]试剂制备[0415]反应缓冲液[0416]称取适量的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、乙二胺四乙酸和二硫苏糖醇，并将其溶解于ddw中，以分别得到12mm、120mm、0.1mm和2mm的溶液。将反应缓冲液的ph值调节到7.4，并在室温下储存。[0417]sars-cov-2病毒3cl蛋白酶[0418]sarscov2的病毒rna从中国台北荣民总医院的病理学和检验医学部的临床样本获得。用3cl正向引物(5'-agtggttttagaaaaatggcattccc-3'；seqidno:1)和3cl反向引物(5'-ctccggtattgagggacgc-3'；seqidno:2)，应用逆转录(rt)-pcr扩增sars-cov-23clpro的互补dna(cdna)。对经扩增的cdna产物进行测序、确认，并通过blast搜索示出与所报告的sars-cov-23clpro的100％同一性(ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。[0419]为了表达蛋白质，将经扩增的cdna产物插入到pet42b载体中，并且随后转化大肠杆菌菌株bl21。将具有pet42b-sars-cov-23clpro的经转化的细胞在含有100ug/ml卡那霉素的luria-bertani(lb)琼脂平板上温育以供选择(37℃；14-16小时)。分离卡那霉素抗性克隆，并在250ml烧瓶中培养。当培养密度在600nm处达到0.8od时，通过在16℃下添加0.4mm异丙基-b-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白质表达。在22小时之后，通过离心和裂解采集经培养的细胞。最后，使用谷胱甘肽4b柱从细菌裂解物中纯化sars-cov-23clpro，然后与1％因子xa蛋白酶溶液温育以去除谷胱甘肽s-转移酶标签。在储存之前，在ph7.4的具有12mm三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、120mm氯化钠、0.1mm乙二胺四乙酸和2mm二硫苏糖醇的缓冲液中透析未经标记的3clpro。[0420]测试制品和对照样品的制备[0421]测试制品的溶液的制备[0422]在实验当天制备测试制品，并将其保持处于室温。在实验结束之后，将剩余溶液作为一般废物丢弃。[0423]将五毫克测试制品(snb01)溶解于反应缓冲液中，以获得10mm储备溶液。用反应缓冲液进一步稀释储备溶液，如下表13所示。样品snb01-1用于通过等温滴定量热法(itc)测定结合亲和力。[0424]表13：snb01样品稀释[0425]样品代码体积(μl)反应缓冲液(μl)总体积(μl)浓度(μm)snb01-110090010001000[0426]阴性对照[0427]反应缓冲液用作阴性对照。[0428]等温滴定量热法测定的程序[0429]等温滴定量热法(itc)(马尔文帕纳科公司(malvernpanalyticalltd))是在25℃下通过使用microcalitc200系统进行的。用70μl的样品snb01-1填充注射器。然后，在反应缓冲液中用350μl的40μmsars-cov-2病毒3clpro填充样品细胞。通过将2μl样品snb01-1注射到样品池中20次，进行滴定。进行第一次注射1μl用于滴定，以使注射器柱塞的体积误差最小化，并且随后在分析中丢弃。每次注射之间的时间为180秒。使用用于itc分析的nitpic软件包分析从等温滴定获得的数据。使用单位点模型(相同和独立的结合位点)拟合数据。通过非线性回归分析结合等温线，以计算结合位点数(n)、结合常数(kb或k)和结合焓(δh)。作为结合的自由能(δg)和熵(δs)的变化的热力学参数由吉布斯自由能关系式(gibbsfreeenergyrelation)δg＝δh-tδs＝-rtln(kb)确定，其中t是绝对温度，并且r＝1.987cal/molk。[0430]结果[0431]这项研究通过itc测定证明snb01与3clpro具有显著的结合活性：[0432]δg：-5824.395cal/mol[0433]结合位点数：6.63±0.607[0434]kb：1.86e4±1.13e4m-1[0435]δh：-7822±868.5cal/mol[0436]δs：-6.70cal/mol/deg[0437]图13示出了等温滴定曲线和通过snb01与3clpro之间的相互作用获得的每次注射热量。大的结合常数和结合产生的负吉布斯能表明snb01与3clpro之间存在强烈的相互作用。[0438]n、kb、δh和δs可以通过所述单位点模型确定。然而，注入曲线表明热力学反应尚未饱和。注入snb01一小时后，量热读数仍在变化。未来调整测试化合物的浓度和注入次数以达到饱和状态的研究可以提供信息。[0439]六位点模型还用于参考。所有热力学参数整理在下表14中。大部分吉布斯自由能为负，并且结合常数较大。所述模型还表明snb01与3clpro之间的相互作用很强。[0440]表14：通过itc分析的snb01与sars-cov-2病毒3clpro的结合的六位点模型的热力学参数。[0441][0442]kb，结合常数；δh、δs和δg，结合焓、熵和吉布斯自由能的变化。[0443]总之，来自这项研究的结果表明snb01与sars-cov-2病毒3clpro具有实质性的相互作用。snb01与3clpro的结合是与有利的焓变化(负δh)相关联的放热反应(负δs)。负δh值与范德华相互作用(vanderwaalsinteraction)和氢键相关联，而负δs值与氢键的净形成相关联(dasilva等人,2017)。因此，snb01与3clpro之间的结合焓可能随着氢键的形成而发生。这一发现与分子建模研究(参见实例13)一致，所述研究还表明snb01的多种活性组分可以与sars-cov-2病毒3clpro形成多个氢键，并支持3clpro抑制是snb01的作用机制。[0444]实例10：大鼠口服施用snb01的14天重复剂量毒性研究[0445]这项研究旨在评估snb01的毒性和在潜在靶器官中的毒性，连续14天向雄性斯普拉-道来(sd)大鼠每天口服施用一次所述snb01。所述研究还可以为未来实验的剂量计划提供信息。[0446]测试制品和对照制品[0447]测试制品的特性[0448][0449]媒剂/对照制品的特性[0450][0451]调配物的制备[0452]调配物制备：在施用之前，新鲜制备测试制品和媒剂对照的调配物。[0453]测试制品调配物：准确称量期望量的测试制品，将其添加到适量的ddw中，并缓慢搅拌直至完全溶解。测试制品的最终浓度为400mg/ml。测试制品的调配物的浓度按重量/体积计算。[0454]对照媒剂：双蒸馏水(ddw)用作媒剂对照。[0455]调配物储存和调配物处置[0456]在施用当天，在室温下新鲜制备剂量调配物，并在给药之前避光。给药程序在3小时内完成。在给药完成后，将测试制品和媒剂对照的剩余调配物分别作为医疗废物和一般废物丢弃。[0457]研究系统[0458]研究中使用的动物[0459][0460][0461]饲养[0462]将动物单独饲养在经环境监测的通风良好的维持处于20-26℃的温度和40％-70％的相对湿度的房间中的聚碳酸酯笼中(笼大小为33.2cm×21.5cm×21cm)。提供荧光照明以进行照明，并维持12小时光照/12小时黑暗周期。聚碳酸酯笼、饮食和玉米芯垫料在使用之前进行高压灭菌。研究中的所有大鼠都可以随意口服摄入水和食物。特异性病原体的检查和其频率示出于下表15：[0463]表15：特异性病原体、频率和测试方法[0464][0465][0466]隔离和驯化[0467]在研究之前，将动物隔离和驯化至少7天。兽医评估了动物的一般健康状况，并进行了全面的健康检查。将有异常、异常行为或比平均体重高/低20％的动物排除在研究之外。[0468]动物和笼卡标识[0469]每只大鼠单独饲养。因此，动物通过笼卡标识。笼卡上标记有日期、项目代码、实验、处理组编号和剂量水平。[0470]实验设计[0471][0472]组分配和剂量[0473]在第0天(给药前一天)测量动物体重。所有大鼠随机分配到媒剂对照组或snb01处理组。所述大鼠体重类似。如果在第1天观察到与测试制品无关的动物死亡，则用体重类似的其它动物替代所述动物。将从死亡与测试制品无关的那些动物中收集的数据保留在研究文件中，但未报告。[0474]给药条件提供如下：[0475]给药途径：口服强饲[0476]给药频率和持续时间：每日一次，连续14天。第一个给药日定义为第1天。[0477]给药体积：10ml/kg[0478]给药方法：媒剂对照组a和b以及测试制品组c、d、e、f和g大鼠使用合适的一次性注射器和16号球头不锈钢管通过口服强饲接受媒剂对照制品或测试制品。基于最接近称重日期的体重计算给药体积。[0479]临床观察[0480]每日临床观察：每天观察所有大鼠至少两次(上午和下午)，或在隔离、驯化和研究时间段期间根据需要经常观察死亡、发病率、呼吸、分泌物、粪便和其水和食物摄入的迹象。[0481]详细临床观察：在给药之前，将每只大鼠从其笼中取出，并且仔细检查是否有任何临床毒性迹象。观察包含但不限于对行为、皮肤、毛发、眼睛、耳朵、鼻子、腹部、外生殖器、肛门、四肢、脚和呼吸的评估。[0482]体重[0483]在实验时间段期间，每天上午10点测量体重(表7：动物的个体体重和平均增重)。当发现动物死亡或在极端情况下实施安乐死时，也会记录体重。[0484]在整个研究时间段期间的第一个给药日后，记录媒剂对照组和测试制品组两者中的动物的食物消耗量(食物输入/食物输出)，并以克/大鼠/日的形式报告。[0485]动物安乐死[0486]在实验结束后，所有动物均通过吸入co2实施安乐死。[0487]宏观和微观检查[0488]所有动物均接受完整的尸检。在正常工作时间后发现死亡的动物在2℃到8℃下冷藏，并在24小时内尽快进行尸检。在尸检和大体目视检查中记录组织或器官的任何病变或异常。在最终给药24小时之后，对所有存活的动物实施安乐死，以进行尸检。所收集的肺组织保存在10％中性福尔马林缓冲溶液中，以用于组织学检查和评估。尸体在尸检和组织收集后作为医疗废物丢弃。[0489]结果[0490]死亡率和发病率[0491]在整个研究过程中，未观察到任何组的死亡率和发病率。[0492]临床观察：[0493]在14天的口服施用期间，4000mg/kgsnb01处理组未观察到显著异常。[0494]体重：[0495]虽然在4000mg/kgsnb01处理组中，观察到五分之四的动物体重略有下降，但在第14天平均体重下降不到10％(-7％)(表8：动物的个体体重和平均增重。)[0496]这种体重减轻可以解释snb01的体重抑制作用，即使是在非常低的剂量下。参见下文公开。[0497]食物消耗量：[0498]在若干动物中偶尔观察到每日食物消耗量显著减少。总的来说，在实验时间段期间，所有动物的每日食物消耗量没有显示出显著或持续的下降。[0499]水消耗量：[0500]观察到水摄入量的结果与食物消耗量的结果类似。在14天的口服施用期间，水摄入量的显著减少并不常见，但这种减少是暂时的。[0501]尸检和肺病理分析[0502]在14天口服施用结束之后，将经处理的动物饲养24小时，并且然后对其进行安乐死，以进行尸检和肺病理分析。[0503]尸检未观察到测试制品处理的大鼠的大体病变或异常。[0504]在病理分析之前对肺组织进行固定和石蜡包埋。在snb01处理的大鼠中，在用苏木精和曙红(h&e)染色的切片中未观察到病理异常。[0505]总之，在结合以高达4,000mg/kg/天的日剂量口服施用snb01的情况下，未观察到显著的副作用。[0506]大鼠口服施用snb01的snb01毒性研究[0507]鉴于sars-cov-2感染患者的肺症状，除口服施用外，吸入途径也被认为是snb01的潜在施用方法。因此，还评估了snb01的吸入安全性。在吸入安全性研究中，通过雾化器(美国纽约的blueechocare公司)向10周大的雄性斯普拉-道来(sd)大鼠递送单剂量(8.25mg/kg)的snb01。在吸入的snb01施用后24小时，监测呼吸功能(包含呼吸频率和血氧比)、一般生理指标(包含食物消耗量和水消耗量以及体重)。未观察到显著异常和临床症状。[0508]实例11：snb01对人受试者的毒性的评估[0509]以1100mg/kg的日剂量对人受试者进行7天重复剂量处理的snb01毒性研究。在用snb01处理的人受试者中未观察到任何临床或行为异常。在第7天结束时观察到轻微的减重(1.5％)。[0510]此外，尸检未揭示主要器官，包含肺、肝、脾、心、肾和胃肠道的任何显著异常和病变。因此，1100mg/kg的剂量被认为是未观察到副作用的水平(noael)。[0511]实例12：通过lc-ms分析的snb01在斯普拉-道来大鼠中的药代动力学研究[0512]这项研究的目的是通过lc-ms分析评估和确定snb01在单次或14天重复口服施用之后在斯普拉-道来大鼠中的药代动力学参数。[0513]测试制品和对照制品信息[0514]测试制品[0515][0516]媒剂[0517]名称：双蒸馏水(ddw)储存：在灭菌之后储存在密封容器中[0518]调配物制备[0519]调配物溶液的制备[0520]在第1天(给药前一天)制备测试制品的调配物溶液。准确称量所需量的测试制品，其中添加适量的双蒸馏水(ddw)，并缓慢搅拌直至完全溶解。将ddw添加到量子满足水平，以制备浓度为70、150和200mg/ml的最终期望体积。测试制品的调配物的浓度按重量/体积计算。使溶液避光并储存在2-8℃的冰箱中。[0521]调配物储存和其处置[0522]在给药当天，将调配物溶液转移并储存在室温下，并在给药之前避光。给药程序在6小时内完成。在给药完成后，将剩余测试制品和媒剂对照品的调配物溶液作为一般废物丢弃。[0523]研究系统[0524]研究中使用的动物[0525][0526]饲养[0527]将动物单独饲养在聚碳酸酯笼中(笼大小为33.2cm×21.5cm×21cm)并处于经环境监测的通风良好的维持处于20-26℃的温度和40％-70％的相对湿度的房间中。提供荧光照明以每日照明约12小时。聚碳酸酯笼、饮食和玉米芯垫料在使用之前进行高压灭菌。特异性病原体以及检查频率和检查方法示出于表15中。[0528]隔离和驯化[0529]将动物隔离和驯化至少7天。兽医对动物的一般健康状况进行了评估。有异常的动物或体重≥平均体重±20％的动物被排除在研究之外。[0530]动物标识[0531]笼标识：笼卡上标记有日期、项目代码、实验、处理组编号和剂量水平。[0532]实验设计[0533]大鼠颈静脉导管插入[0534]在麻醉室内用异氟醚(3-5％)诱导麻醉，并用遮盖物(1-3％异氟醚)维持麻醉。将聚乙烯导管植入到颈静脉中。通过用肝素化盐水(100单位/ml)冲洗使导管保持开放。在动物恢复意识之前施用酮洛芬(5mg/kg)以减轻疼痛。在手术之后，让动物恢复24小时。[0535]随机化和组分配[0536]在随机化之后，将大鼠分配到五组之一，如下表所示：[0537][0538]给药程序：[0539]给药途径：口服强饲[0540]给药频率和持续时间：单次施用和14天重复施用[0541]剂量：350、750或1000mg/kg[0542]剂量体积：10ml/kg[0543]给药方法：通过无菌一次性注射器与16号球头不锈钢管施用剂量以进行口服强饲。基于最近测量的体重计算给药体积，并四舍五入到小数点后2位。1ml一次性使用无菌注射器的分度值为0.02ml，因此，当给药体积介于两条分度值线之间时，给药体积是较大的给药体积。[0544]施用途径的正当性：选择测试制品的口服施用途径，因为这将是预期的临床施用途径。[0545]施用剂量的正当性：这项pk实验的剂量是基于先前的研究数据确定的。发现表明，小鼠对2000mg/kgsnb01具有良好的耐受性。基于体表面积的转换，大鼠体内snb01的等效剂量为1000mg/kg。此外，选择1000mg/kg进行大鼠pk研究，因为单宁酸在大鼠体内的吸收率较低(《农业与食品化学杂志(j.agric.foodchem)》.2003,51,331-339)。[0546]选择350、750和1000mg/kg的第1-3组进行大鼠pk研究，以探索剂量效应。[0547]第4组接受14天的重复施用，以探索长期的药代动力学效应。[0548]另外，第5组随意喂食，以确定禁食/食物影响。[0549]禁食要求[0550]在实验时间段期间，将大鼠分为5组：第一组到第三组动物禁食过夜；第四组动物在施用测试制品之前每天禁食3小时；而第五组的动物在施用测试制品之前没有接受禁食。[0551]血液样品的收集和处理[0552]在给药前(0小时)和给药后0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时，从第1组和第2组动物中收集血液样品(约500μl)。另外，在给药前(0小时)和给药后1小时、2小时、4小时、5小时、6小时、7小时和24小时，从第3组到第5组动物中收集血液样品。将所收集的血液样品转移到含有5μl肝素(5000iu/ml)的试管中，并在2到8℃下以4,000xg离心10分钟。将上清液转移到新试管中，并储存在-80℃下，直到分析。[0553]单宁酸分析的介绍[0554]snb01描述于上文实例5中。用于snb01的药代动力学研究的分析方法是根据黑龙江省食品药品检验机构(heilongjianginstituteforfoodanddrugcontrol)的方法进行修改，以测量大鼠血浆中的单宁酸。[0555]到目前为止，黑龙江省食品药品检验机构描述了一种用于检测药物产品中单宁酸含量的最佳分析方法，其中应用单宁酶以使单宁酸水解，以通过高效液相色谱法(hplc)测定总没食子酸。在测定总没食子酸的量之后，从没食子酸总量中减去单宁酶处理前的游离没食子酸，以推断单宁酸中所表示的聚合没食子酸的量(《中国药品标准(drugstandardsofchina)》2014,第15卷,第3期)。[0556]根据上述参考文献，开发了一种用于测定总没食子酸与游离没食子酸的量的单宁酸的酶促水解测定。[0557]血液样品的hplc-ms分析[0558]内标物(is)[0559]名称：3,5-二羟基苯甲酸[0560]制造：德国西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich,germany)[0561]纯度：97％[0562]储存条件：储存在阴凉处。将容器密封在干燥且通风良好的地方。[0563]仪器和设备[0564]质谱仪：岛津，lcms-2020，日本[0565]泵：岛津lc-20ad，日本[0566]质谱仪检测器：岛津lcms-2020，日本[0567]光电二极管阵列检测器：岛津spd-m20a，日本[0568]自动取样器：岛津sil-20acht，日本[0569]柱式炉：岛津cto-20ac，日本[0570]色谱柱：美国菲罗门公司(phenomenex,us)的c18，5μm，150*4.6mm[0571]溶液制备[0572]1.流动相制备[0573]流动相a：准确地将1ml甲酸转移到含有1l水的容器中，并充分混合。[0574]流动相b：准确地将200mlmeoh转移到含有800mlacn的容器中，并充分混合。[0575]2.酶反应溶液的制备[0576]乙酸缓冲液(0.02m)：制备0.02m乙酸和0.02m乙酸钠水溶液。将其混合在一起，并将ph值调整到4.7。[0577]单宁酶反应溶液(15mg/ml)：将150mg单宁酶准确称取到离心管中，向所述离心管中添加10ml0.02m乙酸缓冲液。通过涡流充分混合。[0578]3.内标物的制备[0579]内标物(4.5mg/ml)：将45mg内标物准确称取到含有10ml去离子水(ddh2o)的试管中，并充分混合。[0580]4.提取试剂的制备[0581]提取试剂：含1.5％(w/w)甲酸的acn溶液[0582]5.snb01标准曲线样品的制备：[0583]将15mgsnb01和约2/3体积的稀释剂添加到200ml容量瓶中，并涡旋直到充分混合。然后，向烧瓶中添加适量稀释剂，以达到最终期望体积。根据下表16，将其充分混合，以获得浓度为75μg/ml的snb01储备溶液(ta9-1)，以通过ddh2o以1:2的连续稀释度制备标准曲线溶液：[0584]表16：snb01样品[0585][0586][0587]6.酶水解：[0588]根据下表17所示的方案，使用溶液(ta1-1到ta9-1)制备标准曲线样品以分析大鼠血浆。简而言之，向标准曲线样品中添加200μl单宁酶反应溶液(15mg/ml)，并通过涡流充分混合。将混合物在30℃下温育4小时以完成水解。通过600μl提取试剂(含1.5％(w/w)甲酸的acn)提取水解物，并在2-8℃下以15,000xg离心10分钟。[0589]表17：所测试的ta样品[0590]样品名称大鼠血浆体积(μl)单宁酶反应溶液(μl)提取试剂(μl)最终体积(μl)ta9100200600940ta8100200600940ta7100200600940ta6100200600940ta5100200600940ta4100200600940ta3100200600940ta2100200600940ta1100200600940空白100200600940[0591]收集上清液并与10μl内标物(is)(4.5mg/ml)混合，然后在n2下蒸发至干燥。在150μl流动相a中重构干燥提取物，并通过0.22μm膜过滤器过滤。snb01标准曲线样品的最终浓度示出于表18中：[0592]表18：ta样品条件[0593]样品名称重构溶液(μl)snb01浓度(μg/ml)ta915020ta815010ta71505ta61502.5ta51501.25ta41500.625ta31500.313ta21500.156ta11500.078空白150-[0594]血浆样品的提取程序[0595]将经冷冻的血浆样品在室温下完全解冻，并在取等分试样之前充分涡旋。将100μl每个样品一式两份地用移液器吸取到到两个1.5ml试管中。一组样品用于测定血浆中的游离没食子酸；另一组用于测定水解后在同一血浆中的总没食子酸含量。实验程序如下所示。[0596]大鼠血浆中的游离没食子酸含量的测定：[0597]在没有进行酶促水解的情况下分析大鼠血浆中的游离没食子酸。通过600μl提取试剂(含1.5％(w/w)甲酸的acn)提取100μl每个血浆样品，并在2-8℃下以15,000xg离心10分钟。收集上清液并与10μlis(4.5mg/ml)混合，然后在n2下蒸发至干燥。将含有游离没食子酸的干燥提取物用150μl流动相a重构，并通过0.22μm膜过滤器过滤。在hplc-ms分析之前，将样品储存在-20℃下。[0598]大鼠血浆中总没食子酸的测定：[0599]在酶促水解完成之后，分析大鼠血浆中总单宁酸的量。将100μl每个血浆样品与200μl单宁酶反应溶液(15mg/ml)充分混合。将混合物在30℃下温育4小时以完成水解。然后，通过600μl提取试剂(含1.5％(w/w)甲酸的acn)提取水解物，并在2-8℃下以15,000xg离心10分钟。收集上清液并与10μlis(4.5mg/ml)混合，然后在n2下蒸发至干燥。将含有总没食子酸的干燥提取物用150μl流动相a重构，并通过0.22μm膜过滤器过滤。在hplc-ms分析之前，将样品储存在-20℃下。[0600]仪器参数[0601]hplc-ms参数：[0602]流速：0.6毫升/分钟[0603]柱温：30℃[0604]样品炉：4℃[0605]运行时间：50分钟[0606]注射体积：25μl[0607]流动相梯度洗脱：[0608]时间(分钟)％m.p.a％m.p.b0982108119257822267525317426446634462984898250982[0609]hplc-ms条件[0610]电离模式：电喷雾电离，负[0611]扫描模式：选择离子监测色谱(sim)扫描[0612]分析物的sim：169(没食子酸)[0613]issim：153(3,5-二羟基苯甲酸)[0614]质谱参数：[0615]雾化气体流量：1.5升/分钟[0616]干燥气流：20升/分钟[0617]接口温度：350℃[0618]dl温度：250℃[0619]加热块温度：400℃[0620]标准曲线计算[0621]应答：没食子酸峰面积/is峰面积比[0622]等式：y＝bx+a[0623]结果[0624]标准曲线的数据[0625]大鼠血浆中snb01的标准曲线的数据呈现于图15和表19中。snb01的标准曲线在0.078到20μg/ml范围内呈线性。标准物的反向计算浓度的cv％在2.52％到11.25％的范围内；相对误差(re％)值为-4.64％到10.93％。相关系数(r)大于0.99。[0626]血浆浓度-时间数据[0627]在单次口服施用(350、750和1000mg/kg)于大鼠之后，snb01血浆浓度-时间曲线和数据如图16、表20-22所示。cmax(1000、750、350mg/kg剂量组分别为7.80±2.32、3.60±1.10、1.17±0.97μg/ml)和auc0-t(1000、750、350mg/kg剂量组分别为44.33±16.29、23.50±12.94、4.06±2.23微克*小时/毫升)与所施用的剂量成比例(对于cmax，r2＝0.92，对于auc0-t，r2＝0.98)。[0628]另外，在大鼠中单次施用与14天重复口服施用snb01的浓度-时间曲线和数据如图17和表23所示。与单次施用相比，14天施用1000mg/kgsnb01导致auc0-t更高，但不显著(58.06±9.38对44.33±16.29微克*小时/毫升，p＝0.19)，但没有增加cmax(6.16±2.96对7.80±2.32μg/ml)。在24小时之后，低水平的snb01(0.52±0.19)保持不变。[0629]在禁食条件与喂食条件下单次口服施用的浓度-时间曲线和数据如图18和表24所示。禁食显著提高cmax(7.80±2.32对1.54±0.60μg/ml，p《0.01)和auc0-t(44.33±16.29对8.23±3.27微克*小时/毫升，p《0.01)。[0630]药代动力学参数[0631]snb01的λz计算方法在表25中。表26呈现了第1组(单剂量，1000mg/kg，禁食)、第2组(单剂量，750mg/kg，禁食)、第3组(单剂量，350mg/kg，禁食)、第4组(14天重复剂量，1000mg/kg，禁食)和第5组(单剂量，1000mg/kg，喂食)的snb01的关键药代动力学(pk)参数。[0632]总之，结果表明，在以350、750和1000mg/kg的剂量单次口服施用单宁酸之后，单宁酸的暴露量与snb01的剂量成比例增加。另外，与单剂量施用相比，14天的施用并没有增加药代动力学参数。此外，在禁食条件下的snb01的cmax和auc值为喂食条件下的cmax和auc值的约5倍。[0633]结论[0634]总之，snb01在口服施用后1-6小时内达到cmax。snb01的血浆半衰期为1.00-7.78小时，并且在单次口服施用之后24小时内几乎完全消除。另外，口服施用snb01会使血浆浓度和auc暴露量相对于剂量呈线性(成比例)增加。[0635]轻度covid-19是一种疾病，持续一到两周。在这项研究中，snb01在施用14天之后没有显著累积，这支持了其在持续时间的安全性。这项研究中的药代动力学发现外推到人，以每8小时口服途径施用一次，以在治疗covid-19的系统中保持snb01的持续水平。胶囊的形成将允许snb01的快速释放。[0636]另外，snb01在禁食的情况下吸收良好。将在餐后空腹临床施用snb01。[0637]表19：大鼠血浆中snb01的标准曲线[0638][0639][0640]表20：第1组动物的大鼠血浆中snb01浓度(1000mg/kg，单剂量，禁食)[0641][0642]*所计算的浓度低于loq(0.078μg/ml)。[0643]表21：第2组动物的大鼠血浆中snb01浓度(750mg/kg，单剂量，禁食)[0644][0645]*所计算的浓度低于loq(0.078μg/ml)。[0646]表22：第3组动物的大鼠血浆中snb01浓度(350mg/kg，单剂量，禁食)[0647][0648][0649]*所计算的浓度低于loq(0.078μg/ml)。[0650]表23：第4组动物的血浆中snb01浓度(1000mg/kg，14天重复剂量，禁食)[0651][0652]表24：第5组动物的血浆中snb01浓度(1000mg/kg，单剂量，喂食)[0653][0654]*所计算的浓度低于loq(0.078μg/ml)。[0655]表25：snb01的药代动力学研究的λz计算[0656][0657][0658]表26：每组动物的snb01的pk参数[0659][0660][0661]通过lc-ms分析的吸入施用于斯普拉-道来大鼠的snb01的药代动力学研究[0662]还评估了吸入snb01的药代动力学特征。通过雾化器(美国纽约的blueechocare公司)将单剂量(26.32mg/kg)的snb01吸入施用于10周大的雄性斯普拉-道来(sd)大鼠。在处理后24小时内，在循环体系中成功检测到snb01。这一结果表明，吸入途径是可行的snb01递送途径。[0663]实例13：通过lc-ms/ms分析的snb01在斯普拉-道来大鼠肺组织中的药代动力学研究。[0664]这项研究的目的是评估和确定snb01在单次或14天重复口服施用之后在斯普拉-道来大鼠的肺组织中的药代动力学参数。[0665]测试制品和对照制品以及其调配物如上文实例12所公开。研究动物、其饲养条件和隔离/驯化也如上文实例12所提供。特异性病原体、检查频率和检查方法提供于上表15中。[0666]实验设计[0667]随机化和组分配[0668]在第一次给药之前，将动物随机分为研究组。在随机化之后，将大鼠分配到六组之一，如下表所示：[0669][0670]给药程序[0671]给药途径：口服强饲[0672]给药频率和持续时间：单次施用和14天重复施用[0673]剂量：1000mg/kg[0674]剂量体积：10ml/kg[0675]给药方法：通过无菌一次性注射器与16号球头不锈钢管施用剂量以进行口服强饲。基于最近测量的体重计算给药体积，并四舍五入到小数点后2位。1ml一次性使用无菌注射器的分度值为0.02ml，因此，当给药体积介于两条分度值线之间时，给药体积是较大的给药体积。[0676]施用途径的正当性：选择测试制品的口服施用途径，因为这将是方便covid-19患者的预期临床施用途径。[0677]施用剂量的正当性：这项pk实验的剂量是基于先前的研究数据确定的。结果表明，小鼠对2000mg/kgsnb01具有良好的耐受性。基于体表面积的转换，大鼠体内snb01的等效剂量为1000mg/kg。此外，选择1000mg/kg是因为单宁酸在大鼠体内的吸收率较低(《农业与食品化学杂志》2003,51,331-339)。[0678]第4-6组接受14天的重复施用，以探索长期施用的药代动力学效应。[0679]禁食要求[0680]在实验时间段期间，将大鼠分为6组，第一组到第三组动物禁食过夜，第四组到第六组动物在每天施用测试制品前禁食3小时。这种安排是由于发现胃肠道饲料对snb01的吸收有很大影响(参见实例11)。[0681]肺样品的收集和处理[0682]在给药后4小时、7小时和24小时从动物身上收集肺样品。在液氮中快速冷冻肺组织，并在-80℃下储存，直到分析。[0683]动物福利[0684]这项研究中使用的程序经心悦生医国际(中国台湾)股份有限公司的动物护理和使用委员会(iacuc)批准。iacuc研究编号：sr109002。[0685]肺样品的lc-ms/ms分析[0686]内标物(is)[0687]名称：4-羟基苯甲酸[0688]制造：美国acros[0689]纯度：》99％[0690]储存条件：储存在阴凉处。将容器密封在干燥且通风良好的地方。[0691]仪器和设备[0692]质谱仪：美国absciex3200qtraplc-ms/ms系统[0693]泵：美国安捷伦1260lc四元泵[0694]质谱仪检测器：美国absciex3200qtrap[0695]自动取样器：美国安捷伦1260infinity自动取样器[0696]柱式炉：美国安捷伦1100柱式炉[0697]色谱柱：美国菲罗门公司的c8，5μm，100*4.6mm[0698]手持式组织均质器：美国btlab系统[0699]溶液制备[0700]1.流动相制备[0701]流动相a：准确地将1ml甲酸转移到含有1l水的容器中，并充分混合。[0702]流动相b：准确地将200mlmeoh转移到含有800mlacn的容器中，并充分混合。[0703]2.酶反应溶液的制备[0704]乙酸缓冲液(0.02m)：制备0.02m乙酸和0.02m乙酸钠水溶液。将其混合在一起以将ph值调整到4.7。[0705]单宁酶反应溶液(2.5mg/ml)：将75mg单宁酶准确称取到离心管中，向所述离心管中添加30ml0.02m乙酸缓冲液。通过涡流充分混合。[0706]3.内标物储备溶液的制备[0707]内标物溶液(4μg/ml)：将4mg内标物准确称取到含有10ml去离子水(ddh2o)的试管中，并充分混合以获得is溶液(400μg/ml)。准确地将1mlis储备溶液转移到含有99mlddh2o的容器中，并充分混合。[0708]4.提取试剂的制备[0709]提取试剂：含1.5％(w/w)甲酸的acn溶液[0710]5.肺组织中的snb01标准曲线的制备[0711]snb01标准曲线样品的制备：[0712]将30mgsnb01和约2/3体积的稀释剂添加到200ml容量瓶中，并涡旋直到充分混合。然后，向烧瓶中添加适量稀释剂，以达到最终期望体积。根据下表27，将其充分混合，以获得浓度为150μg/ml的snb01储备溶液(ta-b-5-1)以通过ddh2o以1:2的连续稀释度制备标准曲线溶液：[0713]表27：所测试的ta样品[0714]溶液ddh2o的体积(μl)最终体积(μl)snb01浓度(μg/ml)ta-b-5-1-400150.0ta-b-4-120040075.0ta-b-3-120040037.5ta-b-2-120040018.75ta-b-1-12004009.375空白-1400400-[0715]酶水解：[0716]根据下表28所示的方案，溶液(ta-b-1-1到ta-b-5-1)用于制备标准曲线样品以分析肺组织。使用手持式组织均质器，用100μl均质介质(0.02m乙酸缓冲液)使每个组织样品(50mg)均质。将匀浆与300μl单宁酶(15mg/ml)充分混合，并在30℃下温育4小时以完成水解。用2000μl提取试剂(含1.5％(w/w)甲酸的acn)提取水解物，并在2-8℃下以15,000xg离心10分钟。[0717]表28：用于分析肺组织中的ta样品的检查方案[0718][0719]将上清液收集并在n2下蒸发到干燥。在300μl的流动相a中重构干燥提取物，并通过0.22μm膜过滤器过滤。肺样品的具有标准曲线的snb01的最终浓度如下表29所示。[0720]表29：snb01的标准曲线测定的最终浓度[0721]样品名称重构溶液体积(μl)snb01浓度(μg/ml)ta-b-530025ta-b-430012.5ta-b-33006.25ta-b-23003.125ta-b-13001.5625空白300-[0722]肺样品的提取程序[0723]将经冷冻的肺组织在室温下完全解冻。准确称量每个样品，并将其转移到15ml管中。一组样品用于测定肺组织中的游离没食子酸；另一组用于测定同一肺组织中的总没食子酸含量。实验程序如下所示。[0724]大鼠肺中游离没食子酸的测定：[0725]在没有进行酶促水解的情况下分析肺中的游离没食子酸。将每个肺样品与50μlis(4μg/ml)混合，并使用手持式组织均质器，用4ml均质介质(0.02m乙酸缓冲液)使所述肺样品均质。用60ml提取试剂(含1.5％(w/w)甲酸的acn)提取每个样品，并在2-8℃下以15,000xg离心10分钟。将上清液收集，充分混合并在n2下蒸发到干燥。将来自肺样品的含有游离没食子酸的干燥提取物用300μl流动相a重构，并通过0.22μm膜过滤器过滤。在lc-ms/ms分析之前，将样品储存在-20℃下。[0726]大鼠肺中总食子酸的测定：[0727]在酶促水解完成之后，分析大鼠肺中总单宁酸的含量。将每个肺样品与50μlis(4μg/ml)混合，并使用手持式组织均质器，用4ml均质介质(0.02m乙酸缓冲液)使所述肺样品均质。随后立即将匀浆与8ml单宁酶溶液(2.5mg/ml)充分混合。将混合物在30℃下温育4小时以完成水解。然后，用60ml提取试剂(含1.5％(w/w)甲酸的acn)提取水解物，并在2-8℃下以15,000xg离心10分钟。将上清液收集，混合并在n2下蒸发到干燥。将含有总没食子酸的干燥提取物用300μl的流动相a重构，并通过0.22μm膜过滤器过滤。在lc-ms/ms分析之前，将样品储存在-20℃下。[0728]仪器参数[0729]lc-ms/ms参数：[0730]流速：0.15毫升/分钟[0731]柱温：30℃[0732]自动采样器温度：4℃[0733]运行时间：9分钟[0734]注射体积：20μl[0735]流动相梯度洗脱：[0736]时间(分钟)％m.p.a％m.p.b09554.050504.101006.001007.09559.0955[0737]lc-ms/ms条件：[0738]具有esi离子源的absciex3200qtrap在具有多反应监测的负离子模式下使用。[0739]离子源参数：[0740][0741]化合物相关参数：[0742][0743]标准曲线计算[0744]应答：没食子酸峰面积/is峰面积比[0745]等式：y＝bx+a[0746]结果[0747]标准曲线的数据[0748]证明了肺组织中snb01的标准曲线在1.5625到25μg/ml范围内呈线性(图19和表30)。标准物的反向算浓度的相对误差(re％)值为-2.63％到6.78％。相关系数(r)大于0.99。[0749]肺浓度-时间数据[0750]单次与14天重复口服施用snb01在肺组织中的浓度-时间数据如表31所示。结果表明：[0751]1)snb01在肺组织中可以达到的高水平与在血浆中的高水平类似(参见实例11)。在单次或14天重复口服施用(分别为1.06±1.03、0.90±0.68μg/克)之后，肺组织中snb01的浓度在4到7小时达到最高水平。[0752]2)在口服施用之后第4小时和第24小时，14天的重复处理导致肺部snb01水平升高，但无统计学意义。[0753]3)然而，在14天重复口服施用之后，snb01在肺部没有显著积聚。[0754]结论[0755]snb01在口服的情况下吸收良好，并口服施用之后以高水平分布于啮齿动物肺组织中。在14天施用之后，snb01没有显著积聚，这支持了其在处理期间的安全性。[0756]发现支持snb01的口服施用途径。snb01可以很好地到达肺组织，这是用于治疗sars-cov-2的呼吸道感染的任何临床治疗的必要条件，这种感染可能导致严重后果。[0757]表30：啮齿动物肺中的snb01的标准曲线[0758][0759]表31：在啮齿动物肺中单次(第1组到第3组)对14天重复(第4组到第6组)口服施用snb01的浓度与时间的关系[0760][0761]实例14：snb01与sars-cov-2的3cl蛋白酶结合的分子建模[0762]在过去的半年期间，sars-cov-2或2019-ncov在世界范围内造成了百年来最猖獗的大流行。其严重的急性呼吸道(sari)症状，包含发热、乏力、呼吸困难和肺炎，可以在受感染的群体中，特别是在老年人群体和患有现有病状的患者中，带来灾难性的发病率和死亡率。[0763]与其它冠状病毒一样，sars-cov-2病毒需要主蛋白酶(mpro)，一种具有约306个氨基酸的蛋白酶的自切割。所述主蛋白酶是病毒复制的关键酶。mpro的切割位点与小核糖核酸病毒3c蛋白酶(3cpro)的切割位点类似。因此，sars-cov-2的mpro也被称为3c样蛋白酶(3clpro)。3clpro具有保守的分子特征和病理学显著性，是开发治疗的有吸引力的靶标。[0764]本文发现snb01在体外强效抑制3clpro和veroe6细胞中的病毒生成。为了进一步了解其抑制的分子基础，与计算方法结合，使用jin等人,2020公开的复合物晶体6lu7来研究snb01的构象和配体酶与若干个已确认组分的相互作用。[0765]计算方法[0766]软件[0767]ucsfdock6，用于复杂模拟[0768]avogadrover.1.2，用于构象最小化[0769]ucsfchimeraver.1.12，用于查看和编辑结果。[0770]材料[0771]3clpro酶由复合物6lu7，3clpro与抑制剂n3复合的晶体结构修饰。使用软件ucsfchimera从6lu7中去除抑制剂n3和水以获得用于对接的裸露的3clpro酶。对接分子是已经确认并从snb01中分离出来的组分，包含主要组分3,4-二羟基-5-(3,4,5-三羟基苯甲酰氧基)苯甲酸(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-三(3,4-二羟基-5-(3,4,5-三羟基苯甲酰氧基)苯甲酰氧基)-6-((3,4-二羟基-5-(3,4,5-三羟基苯甲酰氧基)苯甲酰氧基)甲基)噁烷-2-基酯，缩写为β-10g(tsai等人,2017)(nishizawa等人,1982)。还研究了四种其它单宁酸类似物(表22)。[0772]在默认设置下通过avogadro使用mmff94力场等将立体构象最小化。[0773]方法[0774]选择了抑制剂n3的对接位点，并且网格生成遵循rizzo实验室教程(2018对接教程1与pdbid2nnq)及其默认设置。[0775]结果[0776]3clpro与抑制剂(snb01中的单宁酸类似物)的分子对接的发现示出为最稳定的构象，其中网格评分基于范德华能和静电能以及表23中的氢键。[0777]所指示的氨基酸残基his41、asn142、ser144、cys145、his163、glu166和pro168与长度为的那些抑制剂形成多个氢键(表23)。来自表23的模拟结果表明，所有这些单宁酸类似物的3clpro抑制剂都可以与sars-cov-2的3clpro形成4个到5个氢键。另外，所有抑制剂都可以适当地适合于切割位点，以几何方式阻止其它可能的底物。[0778]在形成氢键的残基中，cys145和his41对3clpro的蛋白水解过程至关重要(pillaiyar等人,2016)。发现与sars-cov-2的3clpro对接的抑制剂与cys145和/或his41形成至少一个氢键，这在分子模拟中明显阻止了3clpro的可能底物的蛋白水解过程。这些发现支持snb01对veroe6细胞的体外蛋白酶测定和体内杀病毒测定的有效抑制活性(参见实例5和实例7)。[0779]结论[0780]来自此分子模拟测定的结果显示出snb01对sars-cov-2的3clpro活性位点抑制的可能机制，这可以通过与cys145和/或his41的关键切割氨基酸残基形成至少一个氢键来解释。结合对作用机制的其它研究，如veroe6细胞中的杀病毒研究、蛋白酶测定、非变性page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析和itc(等温滴定量热法)研究(参见实例7、实例8、实例9)，这些形成多个氢键的氨基酸残基可能在调节sars-cov-2的3clpro活性中发挥显著作用。[0781]总之，本文所报告的发现支持以下假设：snb01是一种强效的3clpro抑制剂，其可以帮助降低sars-cov-2大流行的发病率和死亡率。[0782]表32：单宁酸类似物的化学结构[0783][0784][0785][0786]表33：3clpro与snb01中单宁酸类似物模拟的相互作用的发现[0787][0788]实例15：测试化合物对sars-cov-2的3cl蛋白酶(3clpro)的抑制[0789]为了研究如下表34所示的测试化合物对sars-cov-23clpro的抑制活性，通过测量由于荧光底物(dabcyl-ktsavlqsgfrkme-edans)的切割而增强的荧光，在体外确定了测定。为了分析抑制潜力，将各种化合物溶解于1％或8％二甲基亚砜(dmso)水溶液中作为化合物储备液。将不同浓度的每种储备液(5μl)与45μl反应混合物(含50nmsars-cov-2病毒3cl蛋白酶的20mmbis-tris，ph7.4)在37℃下预温育30分钟。然后，将50μl荧光肽底物(6μm)添加到混合物中并轻轻混合以得到最终dmso浓度为0.05％或0.4％的溶液。在37℃下使用荧光读板仪在485nm处测量在360nm处激发的反应产生的4分钟内的荧光强度差值。蛋白酶活性表示为荧光强度，并通过以下等式计算：[0790]抑制(％)＝1-[(荧光样品，4分钟-荧光样品，0分钟)/(荧光ddh2o，4分钟-荧光ddh2o，0分钟)]×100％。[0791]表34示出了测试化合物针对sars-cov-23clpro的50％抑制浓度(ic50)。在这些样品中，样品5在最低浓度(1.037μg/ml)时显示出半数最大抑制(ic50)。另外，样品1、2、3、4和6显示出针对sars-cov-23clpro的良好抑制活性。这些样品的ic50低于1.5μg/ml。总之，所有测试化合物针对sars-cov-23clpro的蛋白水解活性均有抑制作用。[0792]表34：示例性式(i)化合物针对2019-ncov3clpro的抑制活性[0793][0794]苯酚3g、间苯三酚9g和间苯三酚15g的结构如下所示。其它化合物的结构提供于上表1中。[0795][0796][0797]已测试了另外的式(i)化合物针对2019-ncov3clpro的抑制活性，并且结果如下表35所示。[0798]表35：另外的示例性式(i)化合物针对2019-ncov3clpro的抑制活性[0799][0800][0801]上表35中所列化合物的结构如图20所示。[0802]实例16：包括snb01的加压计量剂量吸入器的制备[0803]制备了包括snb01的加压计量剂量吸入器(pmdi)，并通过空气动力学粒度分布(apsd)和所递送的剂量均一性(ddu)测试了其吸入器性能。[0804]制备：微粒化和填充[0805]首先，使用高压空气喷射磨机对snb01进行微粉化。在微粉化之后，粒度分布(psd)的质量中值直径(d50)为2.17μm。然后，将微粉化的snb01悬浮于液体推进剂氢氟烷(hfa-134a)中。将snb01和hfa-134a的混合物填充在由未经涂覆的铝构成的19ml罐中。阀中的计量室定义了要作为下一剂量分配的最大调配物量为50μl。一次抽吸中的snb01量为250μg。[0806]1.空气动力学粒度分布[0807]使用usp设备6中所描述的多级级联冲击器，基于用于pmdi的usp方法执行apsd：新一代冲击器(ngi)。ngi模拟从口腔到肺中的肺泡的吸入途径。其包含致动器、l形管、每个组具有截止直径的具有8级的冲击器主体以及一个气流泵。snb01和hfa-134a的混合物在气流阀调节的30升/分钟的气流下从罐释放到ngi。内含物流经致动器、l形管和8级，在所述级中收集了不同粒度的内含物。测试并收集了10次抽吸。每级的内含物(snb01)如表36所示分析。[0808]表36：每级中的内容物和apsd参数[0809][0810][0811]此apsd参数通过copley吸入器测试数据分析软件(citdas)3.10版进行分析和报告。所发布的snb01的空气动力学质量中值直径(mmad)为3.87μm。mmad的几何标准偏差(gsd)为1.99。细颗粒剂量(fpd)直接测量被认为适合在呼吸道中沉积和保留的气溶胶颗粒。指示大小小于5μm的颗粒量的fpd为87.18μg。作为表示fpd相对于所递送的剂量的百分比的细颗粒分数(fpf)为41.92％。如apsd结果所示，估计约41.92％的所递送的剂量能够成功到达肺。[0812]2.所递送的剂量均一性[0813]所递送的剂量均一性(ddu)是体外测试的关键要求，以确保向患者递送正确且准确的剂量。将罐中的混合物释放到剂量单位采样设备(dusa)中，并用水洗涤以收集和计算snb01的量。如表37所示，收集并分析了10次单独的抽吸。结果符合usp41《601》的规定，即10个剂量中不少于9个介于规定靶递送剂量的75％与125％之间，并且没有一个在规定靶递送剂量的65％到135％范围之外。[0814][0815]表37：10个单独剂量的ddu。[0816][0817]本技术涉及以下序列表：[0818][0819][0820]当前第1页12当前第1页12