杂交捕获方法和组合物与流程

本文描述了用于改进杂交捕获以从核酸群中富集靶核酸序列的方法和组合物。一方面，所述方法和组合物可用于下一代测序(ngs)应用。

背景技术：

1、在dna和rna分析中，在复杂样本、例如来自一个基因组、多个基因组、cfdna、ctdna、rna或ffpe样本的样本内询问选定的靶序列群来检测多重变化往往是更有效率的。选定的序列被靶向分离(“靶标捕获”)，用于下游工作流程，例如扩增、现场即时检测、测序、或化学/生物增殖。

2、靶标捕获的两种方法是杂交靶标捕获(杂交-捕获)或多重pcr(扩增子富集)。

3、多重pcr技术快速、灵敏，并且通常提供简单高效的工作流程，这往往是对用户友好的。然而，可以同时询问(捕获)的靶序列的数量限于最多几千个pcr-引物对。此外，连续长序列(数千碱基)的不间断呈现、捕获均一性和定量测量具有挑战性。有些多重pcr挑战通常通过现有杂交捕获技术来解决。

4、其它方法，例如分子倒置探针(mip)或锁式探针，也遇到了基于扩增子富集的方法的类似变化。

5、商业杂交-捕获(杂交-捕获)方法有很多种。对于杂交-捕获，核酸可包括但不限于dsdna、dsrna、或杂化dna-rna复合物。任何核酸种类的捕获依赖于从复杂混合物中捕获靶序列子集的类似方法，该方法基于在由双链核酸解链温度(tm)推算的条件下的杂交。杂交-捕获方法遵循以下一般工作流程：

6、(a)将复杂的样本，例如基因组dna(靶核酸)的文库，与数千或数十万个靶向探针(或“诱饵”)序列库一起在专门配制的杂交-捕获溶液中温育。

7、(b)靶向探针以可扩增模板的形式与靶序列杂交。然后，杂交的复合物经常被另一种底物捕获。该捕获往往需要额外的温育，该温育经常与混合相结合。

8、(c)将步骤b的捕获材料以多步大力洗涤以消除脱靶(off-target)核酸，并将所得的富集的捕获材料进行准备用于测序。如果将步骤b的捕获材料延伸而形成适合测序的可扩增模板，则无需步骤c的洗涤步骤。然而，靶材料的延伸会受到复合性(plexity)降低的影响。

9、典型的杂交捕获方法在被认为对预计的探针-靶标解链温度(tm)“特定”的条件下使探针与靶标接触。tm通常通过在特定条件下加热(解链)双链体核酸来凭经验确定。然后直接应用、或使用这样的直接实验观察结果来计算/推算杂交捕获条件的tm。值得注意的是，tm不说明具有生物复杂性的样本中双链体缔合和形成的复杂动力学和概率。探针和靶标需要首先通过机会成核相缔合。对于生产性成核事件，探针-靶标对需要相互“采样”。参见yin和zhao，acc.chem.res.44(11):1172–1181(2011)。这样的缔合和“采样”的持续时间取决于杂交条件和互补性程度。这样的缔合/采样事件连续且反复地发生，直到系统达到其最低能量状态(热力学平衡)。值得注意的是，具有足够互补性水平的脱靶缔合可以将探针-靶标对捆绑一段延长的持续时间，并防止各自与完全互补的靶核酸杂交。这样的错配双链核酸可能持续整个杂交-捕获过程。在高温下延长温育使优选的靶标/探针杂交最大化，减少脱靶对。杂交-捕获通常在刚低于或等于预计的双链体tm下进行，以最大限度减少脱靶杂交的形成；预计脱靶双链体的碱基配对较少，因此tm和持续时间低于预定的靶标/探针复合物。目前的方法忽略了这样一个事实，即只有当系统处于热力学平衡时，分子群才会反映这样的能量差异，而热力学平衡可能需要很长时间才能达到。关于微阵列上寡核苷酸系统的经验数据表明，在高温下40小时后，用持续且高度剧烈的混合，接近了(未达到)这样的平衡。wang等,rna13(1):151-159(2007)。更长和更复杂的探针-靶标混合物的杂交可能需要更长的时间才能达到平衡，即使在非封闭的平台上可以实现相似的温度严格性和严格的混合的情况下。因此，即使在理想的探针设计和杂交条件下，杂交-捕获也需要长时间温育才能达到均一性和收率。

10、虽然杂交-捕获可以实现很高的的复杂性(在单个捕获反应中同时数十万个探针序列)并且可以提供连续和定量的更长基因组片段覆盖度，但工作流程漫长而费力。典型的工作流程包括许多时间敏感的、由经验丰富的操作人员手动操作的步骤，以实现可再现和一致的结果。此外，覆盖度均一性和特异性是挑战，这通常通过探针设计、杂交溶液配制优化、杂交持续时间、和杂交-捕获后洗涤步骤的严格性来弥补。测定通常仍会受到富含gc或at区域的采样不足或过度采样的影响。

11、需要方法和组合物来克服现有技术存在的挑战并降低工作流程的复杂性、减少杂交-捕获时间、增加复杂靶区域的捕获、以及改进靶序列或区域的特异且均一的捕获。

技术实现思路

1、本文描述了用于改进杂交捕获以从核酸群中富集靶核酸序列的方法和组合物。所述方法包括：在溶液中合并核酸群和互补探针组；让所述互补探针组与所述靶核酸杂交或结合；选择性固定化探针/靶核酸复合物；将选择性固定化的探针/靶核酸复合物暴露于低于总tm(aggregate tm)的温度以使不需要的非靶物解链；并洗涤所述复合物以去除未结合的非靶物，从而富集靶核酸。

2、本文所述的一个实施方式涉及减少杂交捕获的杂交时间的能力。本文所述的一个方面降低了杂交捕获工作流程的复杂性。本文所述的另一个方面增加了复杂靶区域的捕获特异性。本文所述的另一个方面改进了靶核酸序列或区域的特异性捕获，同时使序列偏倚最小化。

3、本文所述的另一个实施方式提供了改进的杂交捕获组合物。本文所述的另一个方面提供了改进的杂交捕获缓冲液。

4、本文所述的另一个实施方式是杂交捕获方法。所述杂交捕获方法是杂交-捕获-解链工作流程。在第一步，探针组在促进杂交的条件下与核酸样本接触。任选地，所述探针组可含有捕获部分，例如但不限于生物素化。所述生物素化的探针与靶核酸或要富集的核酸互补。在第一步，目标是增加杂交捕获收率。核酸捕获的特异性次于收率。在第二步中，将所述生物素化的探针固定化到链霉亲和素珠上。将带有和不带有杂交靶标的探针固定化。在第三步，进行解链以解离所有非特异性杂交相互作用。不受单一理论的束缚，还预计在进行解链后进行捕获探针与靶序列的再杂交，进一步改善收率和特异性。在第四步，进行洗涤步骤以进一步去除未杂交和弱杂交的非靶向核酸。

5、本文所述的另一个实施方式是改进的杂交捕获组合物。在一个方面，提供了改善杂交捕获效率的杂交捕获缓冲液。在另一个方面，可以添加tm调节试剂。在另一个方面，可以添加降低tm对双链靶标gc碱基含量的依赖性的添加剂以改善捕获。

6、本文所述的另一个实施方式是一种杂交捕获方法。在一个步骤中，提供了低严格度的杂交。在另一个步骤中，在足以促进固定化的温度下进行捕获(固定化)。在另一个步骤中，在升高的温度下进行解链以减少脱靶杂交。在另一个步骤中，进行洗涤以减少脱靶杂交，并且任选地该洗涤步骤可在没有热洗涤的情况下进行。

7、本文所述的一个实施方式是一种用于富集样本中的核酸靶序列群的方法，所述方法包括：(a)提供包含多个靶核酸序列和多个脱靶核酸序列的核酸分子样本；(b)在杂交条件下将所述样本和与所述多个靶核酸序列互补的核酸探针组杂交以生成探针/靶标复合物；(c)选择性固定化所述探针/靶标复合物以形成固定化的探针/靶标复合物；(d)将所述固定化的探针/靶标复合物加热至等于或低于所述探针/靶标复合物的总tm的温度，持续一段足以解离所述脱靶核酸序列的时间；和(e)洗涤所述固定化的探针/靶标复合物以从杂交的多个靶核酸序列中去除未杂交的核酸序列和脱靶核酸序列，从而富集所述样本中的所述多个靶核酸序列。在一个方面，与所述多个靶核酸序列互补的核酸探针组还包含捕获部分。在另一个方面，所述捕获部分是生物素。在另一个方面，所述杂交条件包括杂交缓冲液，所述杂交缓冲液包含以下一种或多种：(a)盐，选自以下一种或多种：一价盐、二价盐、钠盐、铵盐、铯盐或锰盐、氯化物、柠檬酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、异硫氰酸盐或胍盐；(b)螯合剂，选自以下一种或多种：乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇双(β-氨乙基醚)-n,n,n′,n′-四乙酸(egta)、或(1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n′,n′-四乙酸(bapta)；(c)缓冲剂，选自以下一种或多种：三(羟甲基)氨基甲烷(tris)；2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)(bicine)；(n-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)；[三(羟甲基)甲氨基]丙磺酸(taps)；3-[n-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸(tapso)；4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)；2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸(tes)；3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)；哌嗪-n,n′-双(2-乙磺酸)(pipes)；2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)；或二甲基砷酸(甲次砷酸盐)；(d)去污剂，选自以下一种或多种：十二烷基硫酸钠(sds)、聚山梨醇酯20(20)、辛基酚乙氧基化物(triton x-100)、辛基酚聚氧乙烯醚(-ca 630)、壬基酚聚氧乙烯醚(np-40)、或西曲溴铵(ctab)；或(e)添加剂，选自以下一种或多种：甘氨酸、甜菜碱、甘氨酸-甜菜碱、7-脱氮-2′-脱氧鸟苷、二甲亚砜(dmso)、聚乙二醇400–1,000,000、甘油、镁、四甲基氯化铵(tmac)、四乙基氯化铵(teac)、三乙胺盐酸盐、碳酸亚乙酯、硫酸葡聚糖、或牛血清白蛋白(bsa)。在另一个方面，所述杂交缓冲液含有甲酰胺。在另一个方面，所述杂交缓冲液不含甲酰胺。

8、在一个实施方式中，所述杂交条件包括温育时间从10分钟至48小时。在一个方面，所述杂交条件包括温育时间从2小时至过夜。在另一个方面，与过夜温育时间相比，用2小时温育时间达到了等效的特异性和等效的收率。在另一个方面，所述杂交条件包括温育温度从约55℃至约75℃。在另一个方面，所述杂交条件包括温育温度从约60℃至约70℃。在另一个方面，所述杂交条件包括温育时间2小时和温育温度约65℃。

9、在另一个实施方式中，使用链霉亲和素珠选择性固定化所述探针/靶标复合物。在一个方面，在包括从约10分钟至约48小时的温育时间的条件下选择性固定化所述探针/靶标复合物。在另一个方面，在包括温育温度从约20℃至约40℃的条件下选择性固定化所述探针/靶标复合物。在另一个方面，在包括温育时间约30分钟和温育温度为室温的条件下选择性固定化所述探针/靶标复合物。在另一个方面，所述固定化的探针/靶标复合物的加热包括解链缓冲液，所述解链缓冲液包含以下一种或多种：(a)盐，选自以下一种或多种：一价盐、二价盐、钠盐、铵盐、铯盐或锰盐、氯化物、柠檬酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、异硫氰酸盐或胍盐；(b)螯合剂，选自以下一种或多种：乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇双(β-氨乙基醚)-n,n,n′,n′-四乙酸(egta)、或(1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n′,n′-四乙酸(bapta)；(c)缓冲剂，选自以下一种或多种：三(羟甲基)氨基甲烷(tris)；2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)(bicine)；(n-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)；[三(羟甲基)甲氨基]丙磺酸(taps)；3-[n-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸(tapso)；4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)；2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸(tes)；3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)；哌嗪-n,n′-双(2-乙磺酸)(pipes)；2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)；或二甲基砷酸(甲次砷酸盐)；(d)去污剂，选自以下一种或多种：十二烷基硫酸钠(sds)、聚山梨醇酯20(20)、辛基酚乙氧基化物(triton x-100)、辛基酚聚氧乙烯醚(-ca 630)、壬基酚聚氧乙烯醚(np-40)、或西曲溴铵(ctab)；或(e)添加剂，选自以下一种或多种：甘氨酸、甜菜碱、甘氨酸-甜菜碱、7-脱氮-2′-脱氧鸟苷、二甲亚砜(dmso)、聚乙二醇400–1,000,000、甘油、镁、四甲基氯化铵(tmac)、四乙基氯化铵(teac)、三乙胺盐酸盐、碳酸亚乙酯、硫酸葡聚糖或牛血清白蛋白(bsa)。

10、在另一个实施方式中，所述固定化的探针/靶标复合物的加热包括温育时间从约5分钟至约1小时。在一个方面，所述固定化的探针/靶标复合物的加热包括温育温度从约50℃至约70℃。在另一个方面，所述固定化的探针/靶标复合物的加热包括温育时间约20分钟和温育温度约55℃。在另一个方面，所述固定化的探针/靶标复合物的洗涤包括两种不同的洗涤缓冲液，其中每种洗涤缓冲液独立地包含以下一种或多种：(a)盐，选自以下一种或多种：一价盐、二价盐、钠盐、铵盐、铯盐或锰盐、氯化物、柠檬酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、异硫氰酸盐或胍盐；(b)螯合剂，选自以下一种或多种：乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇双(β-氨乙基醚)-n,n,n′,n′-四乙酸(egta)、或(1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n′,n′-四乙酸(bapta)；(c)缓冲剂，选自以下一种或多种：三(羟甲基)氨基甲烷(tris)；2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)(bicine)；(n-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)；[三(羟甲基)甲氨基]丙磺酸(taps)；3-[n-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸(tapso)；4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)；2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸(tes)；3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)；哌嗪-n,n′-双(2-乙磺酸)(pipes)；2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)；或二甲基砷酸(甲次砷酸盐)；(d)去污剂，选自以下一种或多种：十二烷基硫酸钠(sds)、聚山梨醇酯20(20)、辛基酚乙氧基化物(triton x-100)、辛基酚聚氧乙烯醚(-ca630)、壬基酚聚氧乙烯醚(np-40)、或西曲溴铵(ctab)；或(e)添加剂，选自以下一种或多种：甘氨酸、甜菜碱、甘氨酸-甜菜碱、7-脱氮-2′-脱氧鸟苷、二甲亚砜(dmso)、聚乙二醇400–1,000,000、甘油、镁、四甲基氯化铵(tmac)、四乙基氯化铵(teac)、三乙胺盐酸盐、碳酸亚乙酯、硫酸葡聚糖、或牛血清白蛋白(bsa)。

11、在另一个实施方式中，所述固定化的探针/靶标复合物的洗涤包括温育时间约5分钟至约15分钟和温育温度约60℃。在一个方面，与常规方法相比，所述方法改善了特异性并提高了收率。在另一个方面，常规方法不包括在洗涤前加热的步骤。在另一个方面，与常规方法相比，所述方法改善了中靶(on-target)百分比。在另一个方面，常规方法不包括在洗涤前加热的步骤。在另一个方面，与常规方法相比，所述方法减少了处理时间(handlingtime)和产出时间(throughput time)。在另一个方面，常规方法不包括在洗涤前加热的步骤。在另一个方面，所述方法与常规方法相比，所述方法适合自动化并且降低了复杂度。在另一个方面，常规方法不包括在洗涤前加热的步骤。

12、本文所述的另一个实施方式是使用本文所述的方法分离的多个靶核酸序列。

13、本文所述的另一个实施方式是用于分离多个靶核酸序列的方法(means)，包括本文所述的任何方式、方法、步骤或组合物。

14、本文所述的另一个实施方式是本文所述的方法在分离多个靶核酸序列中的用途。