无动物膳食胶原蛋白的制作方法

无动物膳食胶原蛋白
交叉引用
1.本技术要求2020年1月24日提交的美国临时申请第62/965,700号和2020年11月23日提交的第63/117,243号的权益，这些申请通过引用以其整体并入本文。


背景技术：

2.胶原蛋白是在身体各种结缔组织(包括肌腱、韧带、皮肤和头发)中发现的最丰富的蛋白质之一。胶原蛋白或胶原蛋白补充剂在医疗、化妆品和/或健康目的(例如，刺激皮肤生长、促进伤口愈合、强化指甲或关节等)中很受欢迎。大多数胶原蛋白补充剂的胶原蛋白来源于动物，是动物加工业的副产品。然而，这种动物来源的胶原蛋白可能会增加疾病传播以及过敏的风险。此外，由于各种其他原因，某些消费者通常对无动物产品感兴趣。因此，仍然需要来源于非动物来源的胶原蛋白的改进组合物和方法。


技术实现要素：

3.在一方面，提供了一种非天然存在的多肽，其包含：(i)与seq id no:31具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者；或(ii)与seq id no:32具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者。在一些情况下，非天然存在的多肽包含：(i)与seq id no:31具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者；或(ii)与seq id no:32具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者。在一些情况下，非天然存在的多肽包含：(i)与seq id no:31具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者；或(ii)与seq id no:32具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者。在一些情况下，非天然存在的多肽包含：(i)与seq id no:31具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者；或(ii)与seq id no:32具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者。在一些情况下，非天然存在的多肽包含：(i)与seq id no:31具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者；或(ii)与seq id no:32具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列具有n-端截短、c-端截短或两者。在一些情况下，非天然存在的多肽包含：(i)具有n-端截短、c-端截短或两者的seq id no:31的氨基酸序列；或(ii)具有n-端截短、c-端截短或两者的seq id no:32的氨基酸序列。在一些情况下，非天然存在的多肽包含具有n-端截短的与seq id no:31具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，n-端截短是50个氨基酸至600个氨基酸的n-端截短。在一些情况下，非天然存在的多肽包含具有c-端截短的与seq id no:31具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，c-端截短是50个氨基酸至250个氨基酸的c-端截短。在一些情况下，非天然存在的多肽包含具有n-端截短和c-端截短两者的与seq id no:31具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，n-端截短是50个氨基酸至600个氨基酸
的n-端截短，且c-端截短是50个氨基酸至250个氨基酸的c-端截短。在一些情况下，非天然存在的多肽包含seq id no:2或seq id no:6的氨基酸序列。在一些情况下，非天然存在的多肽由seq id no:2或seq id no:6的氨基酸序列组成。在一些情况下，非天然存在的多肽包含具有n-端截短的与seq id no:32具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，n-端截短是50个氨基酸至750个氨基酸的n-端截短。在一些情况下，非天然存在的多肽包含具有c-端截短的与seq id no:32具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，c-端截短是50个氨基酸至250个氨基酸的c-端截短。在一些情况下，非天然存在的多肽包含具有n-端截短和c-端截短两者的与seq id no:32具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，n-端截短是50个氨基酸至750个氨基酸的n-端截短，且c-端截短是50个氨基酸至250个氨基酸的c-端截短。在一些情况下，非天然存在的多肽包含seq id no:8的氨基酸序列。在一些情况下，非天然存在的多肽由seq id no:8的氨基酸序列组成。在一些情况下，非天然存在的多肽具有50个氨基酸至900个氨基酸的总截短。在一些情况下，非天然存在的多肽的长度为50个氨基酸至250个氨基酸。在一些情况下，非天然存在的多肽不包含以下中的一个或更多个：层粘连蛋白g结构域、血管性血友病(von willebrand)因子a型(vwa)结构域，以及纤维状胶原蛋白c-端结构域。在一些情况下，非天然存在的多肽包含一个或更多个胶原蛋白三股螺旋重复。在一些情况下，非天然存在的多肽是单体的。在一些情况下，非天然存在的多肽未形成天然存在的胶原蛋白的稳定三股螺旋结构。在一些情况下，非天然存在的多肽基本上不含其他胶原蛋白链。在一些情况下，相对于天然存在的胶原蛋白，非天然存在的多肽具有非天然存在的羟基化水平。在一些情况下，存在于非天然存在的多肽中的脯氨酸的小于10％被羟基化。在一些情况下，非天然存在的多肽是非羟基化的。在一些情况下，相对于天然存在的胶原蛋白，非天然存在的多肽具有非天然存在的糖基化水平。在一些情况下，非天然存在的多肽蛋白质包含小于5wt.％的糖基化。
4.在另一方面，提供了一种组合物，其包含0.001％至30％w/w的前述中任一种的非天然存在的多肽。在一些情况下，组合物被配制用于被个体消耗。在一些情况下，组合物是营养食品。在一些情况下，个体是人类。
5.在另一方面，提供了一种改善对象的皮肤、头发和/或指甲的外观和/或改善对象的骨骼、肌肉和/或关节健康的方法，该方法包括：将前述组合物中任一种的组合物施用至对象。在一些情况下，施用包括口服施用至对象。
6.在又一方面，提供了一种重组细胞，其中含有至少一个拷贝的编码前述中任一种的非天然存在的多肽的异源核酸序列。在一些情况下，重组细胞是微生物细胞。在一些情况下，微生物细胞是细菌细胞。在一些情况下，细菌细胞属于大肠杆菌种。在一些情况下，重组细胞缺乏使非天然存在的多肽的一个或更多个氨基酸羟基化的酶。在一些情况下，重组细胞缺乏脯氨酰4-羟化酶和/或脯氨酰3-羟化酶。在一些情况下，异源核酸序列包含与seq id no:1、3、5、7、9、11和25-30中的任一个具有至少80％的序列同一性的核酸序列。在一些情况下，异源核酸序列包含与seq id no:1、3、5、7、9、11和25-30中的任一个具有至少85％的序列同一性的核酸序列。在一些情况下，异源核酸序列包含与seq id no:1、3、5、7、9、11和25-30中的任一个具有至少90％的序列同一性的核酸序列。在一些情况下，异源核酸序列包含与seq id no:1、3、5、7、9、11和25-30中的任一个具有至少95％的序列同一性的核酸序列。在一些情况下，异源核酸序列包含与seq id no:1、3、5、7、9、11和25-30中的任一个具有至
少98％的序列同一性的核酸序列。在一些情况下，非天然存在的多肽进一步包含分泌信号。在一些情况下，重组细胞将非天然存在的多肽分泌至周质中、培养基中或细胞外。在一些情况下，异源核酸序列经密码子优化用于在重组细胞中表达。在一些情况下，异源核酸序列可操作地连接至诱导型启动子或组成型启动子。在一些情况下，异源核酸是质粒或包含在质粒中。在一些情况下，异源核酸序列稳定地整合至重组细胞的染色体中。
7.在又一方面，提供了一种培养基，其包含前述中任一种的重组细胞。在一些情况下，培养基进一步包含从重组细胞分泌的前述中任一种的非天然存在的多肽。
8.本公开进一步提供了一种重组细胞，其中含有至少一个拷贝的编码胶原蛋白的异源核酸序列，该胶原蛋白选自：原鸡(gallus gallus)胶原蛋白或史氏鲟(acipenser schrenckii)(日本鲟鱼)胶原蛋白。在一些实施方案中，重组细胞是微生物细胞。在一些实施方案中，微生物细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞属于大肠杆菌种。在一些实施方案中，异源核酸序列包含seq id no:1、3、5、7、9、11和25-30中的任一个。
9.在一些实施方案中，胶原蛋白是原鸡21型胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白是史氏鲟2型α1胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白是非天然存在的胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白是截短的胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白包含根据seq id no:2、4、6和8中的任一个的氨基酸序列。
10.在一些实施方案中，胶原蛋白进一步包含分泌信号序列。在一些情况下，分泌信号序列包含根据seq id no:10、12、14、16、18、20、22和24中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组细胞将胶原蛋白分泌至培养基中。在一些实施方案中，重组细胞分泌至周质。在一些实施方案中，重组细胞将胶原蛋白分泌至细胞外空间。
11.在一些实施方案中，异源核酸序列经密码子优化用于在重组细胞中表达。在一些实施方案中，异源核酸序列可操作地连接至诱导型启动子或组成型启动子。在一些实施方案中，异源核酸是质粒或包含在质粒内。在一些实施方案中，异源核酸序列稳定地整合至重组细胞的染色体中。
12.本公开还提供了一种培养基，其包含本文所述的重组细胞。在一些实施方案中，培养基进一步包含从重组细胞分泌的重组胶原蛋白。
13.本公开还提供了一种重组蛋白，其包含与选自以下的胶原蛋白的片段具有至少90％的序列同一性的序列：原鸡胶原蛋白，以及史氏鲟胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白是原鸡21型胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白是史氏鲟2型α1胶原蛋白。
14.在一些实施方案中，胶原蛋白是非天然存在的胶原蛋白或其片段。在一些实施方案中，蛋白质具有非天然存在的糖基化水平(例如，相对于相应的天然胶原蛋白)。在一些实施方案中，蛋白质包含小于5wt.％的糖基化(例如，小于3wt.％、小于1wt.％、小于0.5wt.％或小于0.1wt.％)。在一些实施方案中，蛋白质是截短的胶原蛋白。在一些实施方案中，蛋白质包含根据seq id no:2、4、6和8中的任一个的氨基酸序列(或具有其至少90％、其至少95％、其至少98％等的序列同一性)。
15.在一些实施方案中，胶原蛋白进一步包含分泌信号序列。在一些实施方案中，分泌信号序列包含根据seq id no:10、12、14、16、18、20、22和24的氨基酸序列。
16.本公开还提供了一种组合物，其包含本文公开的重组蛋白。在一些实施方案中，组合物进一步包含培养基。另外和/或可替代地，组合物进一步包含本文公开的重组细胞。在
一些实施方案中，重组细胞是微生物细胞。在一些实施方案中，微生物细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞属于大肠杆菌种。在一些实施方案中，重组细胞包含编码胶原蛋白、截短的胶原蛋白或其片段的整合的异源核酸序列。在一些实施方案中，异源核酸序列包含seq id no:1、3、5、7和25-30中的任一个。
17.本公开还提供了一种用于纯化重组胶原蛋白的方法，该方法包括：在培养基中孵育本文所述的重组细胞，其中重组细胞将重组胶原蛋白分泌至培养基中；收集包含分泌至其中的重组胶原蛋白的培养基；以及从培养基中纯化重组胶原蛋白。
18.本公开还提供了一种重组胶原蛋白，其是从本文的方法中公开的培养基中纯化的。在一些实施方案中，重组胶原蛋白的纯度为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
19.本公开还提供了一种表达载体，其包含可操作地连接至启动子的编码非天然存在的截短的胶原蛋白的核酸序列，其中非天然存在的截短的胶原蛋白选自：原鸡胶原蛋白和史氏鲟胶原蛋白。在一些实施方案中，核酸序列包含seq id no:1、3、5、7和25-30中的任一个。在一些实施方案中，原鸡胶原蛋白是21型胶原蛋白。在一些实施方案中，史氏鲟胶原蛋白是2型α1胶原蛋白。
20.在一些实施方案中，表达载体进一步包含编码分泌信号序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码分泌信号序列的核酸序列包含seq id no:11、13、15、17、19、21和23中的任一个。在一些实施方案中，核酸序列经密码子优化用于在细胞中表达。
21.本公开还提供了一种组合物，其包含本文公开的重组胶原蛋白，被配制用于被个体消耗。在一些实施方案中，组合物是营养食品。在一些实施方案中，个体是人类。在一些实施方案中，组合物包含0.1％至10％的重组胶原蛋白。在一些实施方案中，组合物包含至少50％的重组胶原蛋白。在一些实施方案中，组合物包含70％至99％的重组胶原蛋白。在一些实施方案中，组合物进一步包含载体和防腐剂中的至少一种。
22.本公开还提供了一种通过将本文公开的组合物施用至对象来改善对象的皮肤、头发和/或指甲的外观的方法。在一些实施方案中，施用的步骤包括口服施用至对象。
23.从以下详细描述中，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。如将认识到的，本公开能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些均不脱离本公开。因此，附图和说明书本质上将被认为是说明性的，而不是限制性的。
附图说明
24.在所附权利要求中特别地阐述了本文公开的主题的新颖特征。通过参照阐述说明性实施方案的以下详细描述，将获得对本文公开的主题的特征和优点的更好理解，其中利用了本文公开的主题的原理，并且在附图中：
25.图1示出了两张sds-page凝胶的图像，其显示了来自微生物细胞培养物的上清液样品中的胶原蛋白的条带。每种蛋白质的身份在每个条带上方标出。
26.图2a-2c描绘了sds-page凝胶的图像，其显示了在ph 3.0处理之前和之后本公开的非天然存在的多肽的条带。
27.图3描绘了当用本公开的非天然存在的多肽(包含根据seq id no:2的氨基酸序
列)处理时，人皮肤成纤维细胞的细胞活力增加。
28.图4描绘了当用本公开的非天然存在的多肽(包含根据seq id no:2的氨基酸序列)处理时，人皮肤成纤维细胞中i型胶原蛋白产量的增加。
29.图5描绘了当用本公开的非天然存在的多肽(包含根据seq id no:2的氨基酸序列)处理时，肌腱细胞中i型胶原蛋白产量的增加。
30.图6描绘了本公开的非天然存在的多肽与相应的天然存在的胶原蛋白的比对。图6按出现的顺序分别公开了seq id no:33和34。
31.图7a描绘了ph对本公开的示例性非天然存在的多肽的溶液粘度的影响。
32.图7b描绘了本公开的示例性非天然存在的多肽的溶液粘度与基准的比较。
33.图8描绘了本公开的示例性非天然存在的多肽和黄原胶的各种共混物的粘度。
34.图9描绘了本公开的示例性非天然存在的多肽的溶液的凝胶硬度。
35.图10a和图10b描绘了本公开的示例性非天然存在的多肽的各种批次的溶液的凝胶硬度。
36.图11描绘了压实和卵磷脂凝聚对本公开的示例性非天然存在的多肽的影响。
37.图12描绘了ph和油类型对含有本公开的示例性非天然存在的多肽的凝胶的凝胶硬度的影响。
具体实施方式
定义
38.本文使用的术语仅仅是为了描述特定的情况，而不是为了限制。如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式。此外，就在具体实施方式和/或权利要求中使用的术语“包括(including、includes)”、“具有(having、has)”、“有(with)”或其变体而言，这些术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式是包含性的。
39.术语“约”或“近似”是指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，例如，测量系统的限制。例如，“约”可以指在1个或多于1个标准偏差内，根据给定值的实践。在本技术和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”应假定为是指特定值的可接受误差范围。
40.术语“个体”、“患者”或“对象”在本文中可互换使用。术语中没有一个要求或限于以健康护理工作者(例如，医生、注册护士、护士从业者、医生助手、护理员或临终关怀的工作者)的监督(例如，持续或间歇)为特征的情况。
41.如本文所用，术语“包含(comprise)”或其变体(例如“包含(comprises、comprising)”)将理解为表示包括任何列举的特征但不排除任何其他特征。因此，如本文所用，术语“包含”是包含性的并且不排除另外的、未列举的特征。在本文提供的组合物和方法中的任一种的一些实施方案中，“包含”可以用“基本上由
…
组成”或“由
…
组成”替代。短语“基本上由
…
组成”在本文中用于要求指定的特征以及不实质上影响所要求保护的公开内容的特征或功能的那些特征。如本文所用，术语“由
…
组成”用于表示仅存在所列举的特征。
42.在整个本公开中，各种实施方案以范围格式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对任何实施方案的范围的硬性限制。因此，除非上下文
另有明确规定，否则范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内至下限单位的十分之一的任何单个数值。例如，范围的描述(例如1至6)应被认为具有具体公开的子范围(例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等)，以及该范围内的任何单个值(例如1.1、2、2.3、5和5.9)。无论范围的宽度如何，这都适用。这些中间范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本公开内，在所述范围中受到任何明确排除的限制。除非上下文另外明确规定，否则在所述范围包括限制中的一个或两个的情况下，排除那些包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
43.术语“治疗(treatment of、treating)”、“施加(applying)”、“减轻(palliating)”或“改善(ameliorating)”在本文中可互换使用。这些术语是指获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。“治疗益处”是指根除或改善所治疗的潜在病症。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在病症相关的生理症状中的一种或更多种来实现，使得在患者中观察到改善，尽管患者仍患有潜在病症。对于预防益处，在一些实施方案中，将组合物施用至处于发展特定疾病或病况的风险中的患者或报告疾病的生理症状中一种或更多种的患者，即使尚未对该疾病作出诊断。
44.术语“对象”、“个体”或“患者”在本文中通常可互换使用。“对象”可以是含有表达的遗传物质的生物实体。生物实体可以是植物、动物或微生物，包括例如细菌、病毒、真菌和原生动物。对象可以是体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。对象可以是哺乳动物。哺乳动物可以是人类。对象可以被诊断或疑似处于高患病风险中。在一些情况下，对象不一定确诊或疑似处于高患病风险中。
45.如本文所用，术语“截短的胶原蛋白”通常是指小于全长(例如，天然的)胶原蛋白的多肽，其中全长(例如，天然的)胶原蛋白的一个或更多个部分不存在。本文提供的非天然多肽可以在c-端、n-端截短，通过去除全长胶原蛋白序列的内部部分截短(例如，内部截短)，在c-端和n-端均截短，或可以具有c-端截短和n-端截短中的一者或两者以及内部截短。在非限制性实施方案中，截短的胶原蛋白可以包含根据seq id no:2的氨基酸序列或其同源物。在另一非限制性实施方案中，截短的胶原蛋白可以包含根据seq id no:8的氨基酸序列或其同源物。
46.当用于提及氨基酸位置时，“截短”包括所述氨基酸位置。例如，在全长蛋白质的第100位氨基酸处的n-端截短是指从全长蛋白质的n-端截短100个氨基酸(即，截短的蛋白质缺失了全长蛋白质的第1至100位氨基酸)。类似地，在全长蛋白质的第901位氨基酸处的c-端截短(假定1000个氨基酸的全长蛋白质)是指从c-端截短100个氨基酸(即，截短的蛋白质缺失了全长蛋白质的第901至1000位氨基酸)。类似地，在第101位和第200位氨基酸处的内部截短是指内部截短全长蛋白质的100个氨基酸(即，截短的蛋白质缺失了全长蛋白质的第101至200位氨基酸)。
47.本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所述的主题。
48.在某些实施方案中，本文以非限制性实例的方式提供了用于制造非天然存在的多肽的组合物、方法和系统，非天然存在的多肽例如无动物胶原蛋白多肽或胶原蛋白样多肽，以及胶原蛋白片段和/或截短的胶原蛋白，例如在遗传工程微生物中表达和/或由遗传工程微生物表达的那些。因此，在本公开的各个方面，本文提供的非天然存在的多肽包括胶原蛋白或胶原蛋白样多肽、重组胶原蛋白、胶原蛋白片段或截短的胶原蛋白。在某些实施方案
中，本文所述的非天然存在的多肽(例如，重组胶原蛋白、胶原蛋白片段或截短的胶原蛋白)来源于任何合适的来源，例如来自哺乳动物或非哺乳动物来源。例如，在一些实施方案中，本文所述的非天然存在的多肽(例如，重组胶原蛋白、胶原蛋白片段或截短的胶原蛋白)或其至少一部分来源于(例如，修饰、截短、片段化等)鸟或禽类动物(例如，原鸡胶原蛋白)、淡水鱼或咸水鱼(例如，史氏鲟胶原蛋白)或其任何组合的胶原蛋白。
49.本文提供的非天然存在的多肽不是在自然界中通常存在的。通常，本文所述的非天然存在的多肽表现出与天然存在的胶原蛋白的一种或更多种差异。在某些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以具有与天然存在的多肽不同的氨基酸序列(例如，截短的胶原蛋白)。在一些情况下，非天然存在的多肽可以具有与天然存在的胶原蛋白不同的结构。天然胶原蛋白的四级结构是三股螺旋，通常由三条多肽组成。在一些方面，本文所述的非天然存在的多肽可以不具有或可以不形成天然胶原蛋白的四级结构。例如，在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽可以不形成天然存在的胶原蛋白的稳定的三股螺旋结构。在某些情况下，在形成天然胶原蛋白的三条多肽中，两条通常是相同的并称为α链。第三条多肽称为β链。在某些情况下，典型的天然胶原蛋白可以称为aab，其中胶原蛋白由两条α(“a”)链和一条β(“b”)链组成。在某些方面，本文所述的非天然存在的多肽不具有天然胶原蛋白的aab结构。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽不含或基本上不含不同的胶原蛋白链(例如，本文所述的非天然存在的多肽可以包含α链胶原蛋白，并且可以不含或基本上不含β链胶原蛋白)。在一些方面，本文所述的非天然存在的多肽是单体的(例如，不形成多聚体结构)。在其他方面，在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽可以与相同单体形成多聚体结构(例如，同型二聚体、同型三聚体等)。
50.在一些方面，非天然存在的多肽是重组多肽(例如，在宿主细胞中重组制备)。在一个实施方案中，非天然存在的胶原蛋白是截短的胶原蛋白。其他非天然存在的胶原蛋白多肽包括嵌合胶原蛋白。嵌合胶原蛋白是多肽，其中胶原蛋白多肽的一部分与第二胶原蛋白多肽的一部分邻接。例如，包含与来自另一物种的胶原蛋白的一部分邻接的来自一个物种的胶原蛋白的一部分的胶原蛋白分子是嵌合胶原蛋白。在另一实施方案中，非天然存在的胶原蛋白包含融合多肽，该融合多肽包括另外的氨基酸，例如分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点、gek重复、gdk重复和/或β-内酰胺酶。
51.在一些实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽(例如，重组多肽)具有非天然存在的糖基化水平，例如，相对于相应的天然胶原蛋白或天然存在的胶原蛋白。例如，在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包含小于10wt.％、小于9wt.％、小于8wt.％、小于7wt.％、小于6wt.％、小于5wt.％、小于4wt.％、小于3wt.％、小于2wt.％、小于1wt.％、小于0.9wt.％、小于0.8wt.％、小于0.7wt.％、小于0.6wt.％、小于0.5wt.％、小于0.4wt.％、小于0.3wt.％、小于0.2wt.％或小于0.1wt.％的糖基化。可替代地和/或另外，非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包含小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的相应的天然胶原蛋白或天然存在的胶原蛋白的总糖基化。例如，在来自物种xyz的天然存在的胶原蛋白abc具有20个糖基化(遍及胶原蛋白abc的全长或其一部分)的情况下，预期非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包含小于19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个糖基化。在一
些实施方案中，那些较低水平的糖基化可以特异于糖基化的一种或更多种类型(例如，o-糖基化或n-糖基化等)和/或糖基化残基(例如，半乳糖基羟基赖氨酸(gal-hyl)、葡萄糖基半乳糖基羟基赖氨酸(glcgal-hyl)等)。在一些情况下，重组(例如，在重组宿主细胞中)产生的非天然存在的多肽可以具有与天然存在的胶原蛋白不同的糖基化水平和/或糖基化模式。
52.在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽具有非天然存在量的羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽缺乏羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽包含比天然存在的胶原蛋白更少的羟脯氨酸。羟脯氨酸包括但不限于3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸和5-羟脯氨酸。在一些情况下，小于约50％(例如，小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或更小)的存在于本文提供的非天然存在的多肽的氨基酸序列中的脯氨酸是羟脯氨酸。在一些方面，重组(例如，在重组宿主细胞中)产生的非天然存在的多肽可以具有比天然存在的胶原蛋白更少的羟脯氨酸。在一些情况下，如本文提供的重组多肽在缺乏使重组多肽的一个或更多个氨基酸(例如，脯氨酸)羟基化的酶的重组宿主细胞(例如，细菌细胞)中重组表达。在一些情况下，如本文提供的重组多肽在缺乏脯氨酰4-羟化酶和/或脯氨酰3-羟化酶的宿主细胞(例如，细菌细胞)中重组表达。
53.在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽缺乏或基本上缺乏赖氨酰氧化。赖氨酰氧化涉及将赖氨酸残基转化为可以与其他蛋白质形成交联的高反应性醛。天然存在的胶原蛋白可以具有一定水平的赖氨酰氧化。因此，非天然存在的多肽可以与天然胶原蛋白不同，因为它们缺乏或基本上缺乏赖氨酰氧化。
54.通常，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以具有与天然或全长胶原蛋白相似或基本上相似的功能和/或提供益处(例如，如本文提供的)。在一些情况下，与天然或全长胶原蛋白相比，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以具有改善的或提高的功能和/或益处(例如，如本文提供的)。
55.本文公开的非天然存在的多肽通常具有与其单体结构和/或缺乏能够与其他胶原蛋白链交联的氨基酸(例如，缺乏羟脯氨酸残基)有关的有利特性。另外，与全长或天然胶原蛋白相比，本文公开的非天然存在的多肽的胶原蛋白水解物也以增加的溶解度产生。此外，与天然三股螺旋胶原蛋白相反，单体结构更容易消化和生物利用或经消化蛋白酶分解。其他有利特性包括液体组合物和纯化过程中改善的物理特性，因为全长或天然胶原蛋白或胶原蛋白链相互作用形成更强的结构，该结构可以由于羟脯氨酸残基的存在而沉淀。
56.在某些优选的实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)包含与天然存在的哺乳动物或非哺乳动物胶原蛋白的至少一部分具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列，该多肽来源于天然存在的哺乳动物或非哺乳动物胶原蛋白。在一些情况下，天然氨基酸序列的一部分或多部分缺失，但序列的其余部分与天然氨基酸序列基本上相似或相同。在某些示例性实施方案中，非天然存在的多肽具有与原鸡21型α1胶原蛋白或其片段具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至
少约99％的序列同一性的氨基酸序列。在另一实例中，非天然存在的多肽具有与史氏鲟2型α1胶原蛋白片段具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。
57.在一些实施方案中，重组蛋白是截短的胶原蛋白。在某些情况下，截短的胶原蛋白是小于全长(例如，天然的)胶原蛋白的多肽，其中全长(例如，天然的)胶原蛋白的一个或更多个部分(例如，内部和/或端部分)不存在。在各种情况下，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)在c-末端截短、在n-末端截短、通过去除全长胶原蛋白多肽的内部部分截短(例如，内部截短)、在c-末端和n-末端均截短，或包含c-端截短和n-端截短中的一者或两者以及内部截短。在一些情况下，非天然存在的多肽是天然存在的胶原蛋白的片段，其保留了天然或天然存在的相应胶原蛋白的(例如，感兴趣的)功能的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。在一些情况下，术语截短的胶原蛋白可以与术语胶原蛋白片段互换使用。在一些情况下，截短的胶原蛋白包括全长天然或天然存在的相应胶原蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％的任何连续胶原蛋白片段。在一些实施方案中，截短是内部截短、在胶原蛋白的n-端部分截短、在胶原蛋白的c-端部分截短、内部部分的截短，或在c-端和n-端均截短。本文提供的截短的胶原蛋白可以截短50个氨基酸至1000个氨基酸、50个氨基酸至950个氨基酸、50个氨基酸至900个氨基酸、50个氨基酸至850个氨基酸、50个氨基酸至800个氨基酸、50个氨基酸至750个氨基酸、50个氨基酸至700个氨基酸、50个氨基酸至650个氨基酸、50个氨基酸至600个氨基酸、50个氨基酸至550个氨基酸、50个氨基酸至500个氨基酸、50个氨基酸至450个氨基酸、50个氨基酸至400个氨基酸、50个氨基酸至350个氨基酸、50个氨基酸至300个氨基酸、50个氨基酸至250个氨基酸、50个氨基酸至200个氨基酸、50个氨基酸至150个氨基酸，或50个氨基酸至100个氨基酸。在另一实施方案中，截短的胶原蛋白截短了50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个氨基酸。
58.本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含相对于全长(例如，天然的)胶原蛋白的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原蛋白可以包含相对于全长(例如，天然的)鸡(原鸡)21型α1胶原蛋白(例如，seq id no:31)的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原蛋白可以包含具有n-端截短、c-端截短、内部截短或其组合的seq id no:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原蛋白可以包含相对于全长(例如，天然的)日本鲟鱼(史氏鲟)2型α1胶原蛋白(例如，seq id no:32)的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原蛋白可以包含具有n-端截短、c-端截短、内部截短或其组合的seq id no:32的氨基酸序列。下文表1中提供了全长(例如，天然的)胶原蛋白的非限制性实例。
59.在其他实施方案中，多肽可以是与鱼胶原蛋白相当的截短的胶原蛋白多肽，包括来自鲟鱼的其他物种，或来自产生适合鱼子酱的鱼子的其他物种，包括鲑鱼、虹鳟、鳟鱼、圆鳍鱼、白鲑鱼或鲤鱼，以及其他鱼类，例如罗非鱼和鲨鱼。来自史氏鲟(日本鲟鱼)的合适的
可比序列包括ncbi登录号bao58965.1、bao58966.1、bao58967.1、bat51012.1、bar72360.1、bar72359.1、bar72358.1、bar72357.1和bar72356.1。来自小体鲟(acipenser ruthenus)的合适序列包括ncbi登录号a0a444ugw0、a0a444tzm6、a0a444uc45、a0a444uc53、a0a662ytx1、a0a662z270、a0a662yz39、a0a444u1f5、a0a444ujk3、a0a444unu0、x5hzz7、x5ihc1、a0a444upk8、a0a444ubs1、a0a444uyq7、a0a444twq3、a0a444uly4、a0a444tz23、a0a662ys48、a0a444u4c8、a0a444ud64、a0a662yx10、a0a662yxi2、a0a444txq4、a0a444tz42、a0a444u8n8、a0a444uju3、a0a444uq51、a0a444u2t2、a0a662yj50、a0a444v1v9、a0a444v113、a0a662ywr6、a0a662yw91、a0a444u5j5、a0a662yr93、a0a444ujb0、a0a444ufs4、a0a444uvk2、a0a444uju1、a0a444uly9、a0a444uka7、a0a444u5l7、a0a444v6m4、a0a444v788、a0a444ufs9、a0a444uvp7、a0a444u4d9、a0a444uhn6、a0a662yjc1、a0a444v1e8、a0a444upm0、a0a662yu87、a0a444tzs8、a0a444u200、a0a444v2e3、a0a662yxd3、a0a662yqa4、a0a444u1h9、a0a444v7i5、a0a444ufx8、a0a444v7b8、a0a444u2k4、a0a444v762、a0a444uq49、a0a662ymd3、a0a662ywf2、a0a444ue44、a0a444uar6、a0a444ux46、a0a444u5p4、a0a662yrg8、a0a444usc3、a0a444uk09、a0a444unq7、a0a444un69、a0a444v5d9、e6y298、a0a444tzy1、a0a444tys0和e6y299。
60.在其他实施方案中，多肽可以是与鸡胶原蛋白或其他家禽胶原蛋白相当的截短的胶原蛋白多肽，例如来自家养禽类，包括鸡、火鸡、鹅和鸭。来自原鸡(鸡)的合适的可比序列包括ncbi登录号v9gzr2、q9pss5、a0a3q2udi3、q90802、a0a1d5pnh7、q4tzw6、q90803、q91014、a0a1d5ppi0、a0a1d5p1a5、a0a3q2u6k2、a0a3q2u8f9、q90689、a0a3q2u3u6、p13731、a0a1d5pfe0、a0a3q2txz7、q5fy72、a0a1d5pr16、a0a1d5pkr6、f1ndf5、q90589、p08125、f1nrh2、p32017、a0a1d5pw49、q90800、p12108、e1c353、q7lzr2、p02460、a0a1l1rni7、q90796、p12106、f1nq20、q9i9k3、p20785、a0a1d5pwn6、p15988、p12105、f1nil4、o93419、p02467、a0a5h1zrj7、a0a1d5pkq4、a0a5h1zrk9、q90w37、a0a1d5ny11、a0a1d5p959、p02457、a0a1d5pyu1、a0a1d5pe57、q90za0、q90584、a0a1l1rzw7、a0a1d5nvm0、a0a1d5p8p3、f1nip0、f1p2q3、a0a1d5pe74、q9iau4、a0a3q2ttc1、f1nhh4、p32018、a0a1d5p0f4、r4ghp9、a0a3q2ud12、a0a3q2umj2、a0a3q2u4u7、f1nx22、a0a1d5p8i8、a0a1l1rpw4、p13944、p15989、f1p2f0、a0a1d5pgd5和a0a3q3ar07。表1.全长胶原蛋白氨基酸序列
61.在一些情况下，如本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含seq id no:31的氨基酸序列(或与其具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％)的序列同一性的氨基酸序列)，其在以下位置的任何氨基酸位置处具有n-端截短(例如，相对于seq id no:31)：第1至537位氨基酸；第1至542位氨基酸；第1至547位氨基酸；第1至552位氨基酸；第1至557位氨基酸；第1至562位氨基酸；第1至567位氨基酸；第1至572位氨基酸；或第1至577位氨基酸。在一些情况下，如本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含seq id no:31的氨基酸序列(或与其具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％)的序列同一性的氨基酸序列)，其在以下位置的任何氨基酸位置处具有c-端截短(相对于seq id no:31)：第726至957位氨基酸；第731至957位氨基酸；第736至957位氨基酸；第741至957位氨基酸；第746至957位氨基酸；第751至957位氨基酸；第756至957位氨基酸；第761至957位氨基酸；第766至957位氨基酸；第769至957位氨基酸；第774至957位氨基酸；第779至957位氨基酸；或第784至957位氨基酸。在一些情况下，如本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含n-端截短和c-端截短两者。例如，如本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含seq id no:31的氨基酸序列(或与其具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％)的序列同一性的氨基酸序列)，其在以下位置的任何氨基酸位置处具有n-端截短(例如，相对于seq id no:31)：第1至537位氨基酸；第1至542位氨基酸；第1至547位氨基酸；第1至552位氨基酸；第1至557位氨基酸；第1至562位氨基酸；第1至567位氨基酸；第1至572位氨基酸；或第1至577位氨基酸；并且在以下位置的任何氨基酸位置处具有c-端截短(相对于seq id no:31)：第726至957位氨基酸；第731至957位氨基酸；第736至957位氨基酸；第741至957位氨基酸；第746至957位氨基酸；第751至957位氨基酸；第756至957位氨基酸；第761至957位氨基酸；第766至957位氨基酸；第769至957位氨基酸；第774至957位氨基酸；第779至957位氨基酸；或第784至957位氨基酸。在具体实施方案中，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含seq id no:31的氨基酸序列(或与其具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％)的序列同一性的氨基酸序列)，其在第557位氨基酸处具有n-端截短(相对于seq id no:31)；并且在第746位氨基酸处具有c-端截短(相对于seq id no:31)。在另一具体实施方案中，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含seq id no:31的氨基酸序列(或与其具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％)的序列同一性的氨基酸序列)，其在第557位氨基酸处具有n-端截短(相对于seq id no:31)；并且在第769位氨基酸处具有c-端截短(相对于seq id no:31)。
62.在一些情况下，如本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含seq id no:32的氨基酸序列(或与其具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％)的序列同一性的氨基酸序列)，其在以下位置的任何氨基酸位置处具有n-端截短(例如，相对于seq id no:32)：第1至660位氨基酸；第1至665位氨基酸；第1至670位氨基酸；第1至675位氨基酸；第1至680位氨基酸；第1至685位氨基酸；第1至690位氨基酸；第1至695位氨基酸；或第1至700位氨基酸。在一些情况下，如本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含seq id no:32的氨基酸序列(或与其具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％)的序列同一性的氨基酸序列)，其在以下位置
的任何氨基酸位置处具有c-端截短(相对于seq id no:32)：第855至1420位氨基酸；第860至1420位氨基酸；第865至1420位氨基酸；第870至1420位氨基酸；第875至1420位氨基酸；第880至1420位氨基酸；第885至1420位氨基酸；第890至1420位氨基酸；第895至1420位氨基酸；或第900至1420位氨基酸。在一些情况下，如本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含n-端截短和c-端截短两者。例如，如本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含seq id no:32的氨基酸序列(或与其具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％)的序列同一性的氨基酸序列)，其在以下位置的任何氨基酸位置处具有n-端截短(例如，相对于seq id no:32)：第1至660位氨基酸；第1至665位氨基酸；第1至670位氨基酸；第1至675位氨基酸；第1至680位氨基酸；第1至685位氨基酸；第1至690位氨基酸；第1至695位氨基酸；或第1至700位氨基酸；并且在以下位置的任何氨基酸位置处具有c-端截短(相对于seq id no:32)：第855至1420位氨基酸；第860至1420位氨基酸；第865至1420位氨基酸；第870至1420位氨基酸；第875至1420位氨基酸；第880至1420位氨基酸；第885至1420位氨基酸；第890至1420位氨基酸；第895至1420位氨基酸；或第900至1420位氨基酸。在具体实施方案中，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含seq id no:32的氨基酸序列(或与其具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％)的序列同一性的氨基酸序列)，其在第680位氨基酸处具有n-端截短(相对于seq id no:32)；并且在第880位氨基酸处具有c-端截短(相对于seq id no:32)。
63.在一些情况下，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以包含本文提供的任何氨基酸序列。在一些情况下，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以由本文提供的任何氨基酸序列组成。在一些情况下，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)可以基本上由本文提供的任何氨基酸序列组成。在具体实施方案中，非天然存在的多肽具有或包含seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6和seq id no:8中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原蛋白)包含与seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6和seq id no:8中的任一个具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多肽由或基本上由seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6和seq id no:8中的任一个的氨基酸序列组成。
64.在一些方面，非天然存在的多肽可以包括任何嵌合胶原蛋白，其包括至少一个非连续胶原蛋白片段。例如，非天然存在的多肽可以是嵌合胶原蛋白，其中n-端胶原蛋白的一部分与c-端胶原蛋白的一部分邻接，其中n-端胶原蛋白的该部分和c-端胶原蛋白的该部分在天然或天然存在的相应胶原蛋白中不邻接。在另一实例中，非天然存在的多肽可以是嵌合胶原蛋白，其中c-端胶原蛋白的一部分与n-端胶原蛋白的一部分邻接(例如，以翻转或反向顺序－c端胶原蛋白位于n-端胶原蛋白的该部分的n-端)，其中c-端胶原蛋白的该部分和n-端胶原蛋白的该部分在天然或天然存在的相应胶原蛋白中邻接或不邻接。在另一实例中，非天然存在的多肽可以是嵌合胶原蛋白，其中胶原蛋白多肽的一部分与第二胶原蛋白多肽的一部分邻接(例如，包含与来自第二物种的胶原蛋白的部分邻接的来自第一物种的胶原蛋白的部分的胶原蛋白分子是嵌合胶原蛋白等)。
65.下文提供了重组蛋白的示例性氨基酸序列或编码重组蛋白的核酸序列：
66.seq id no:1－编码来自原鸡(鸡)的截短的21型α1胶原蛋白多肽的核苷酸序列
gataccggttttccgggtatgcctggtcgtagcggtgatccgggtcgtagcggtaaagatggtctgcctggtagcccgggttttaaaggtgaagttggtcagccaggtagccctggtctggaaggtcatcgtggtgaaccgggtattccaggtattccgggtaatcagggtgcaaaaggtcagaaaggcgaaattggtcctccgggtctgccaggtgccaaaggttctccgggtgaaaccggtctgatgggtcctgaaggtagctttggcctgcctggtgcaccgggtccgaaaggtgacaaaggtgaacctggtctgcagggtaaaccgggtagcagcggtgcaaaaggcgaaccaggtggtccgggtgctccgggtgaaccaggctatccgggtattcctggtactcagggtattaaaggcgataaaggtagccagggtgaaagcggtattcagggtcgtaagggtgaaaaaggccgtcagggtaatccaggcctgcagggcaccgaaggtctgcgtggcgaacagggcgaaaaaggtgagaagggtgacccaggcattcgt
67.seq id no:2－来自原鸡(鸡)的截短的21型α1胶原蛋白多肽的氨基酸序列dtgfpgmpgrsgdpgrsgkdglpgspgfkgevgqpgspgleghrgepgipgipgnqgakgqkgeigppglpgakgspgetglmgpegsfglpgapgpkgdkgepglqgkpgssgakgepggpgapgepgypgipgtqgikgdkgsqgesgiqgrkgekgrqgnpglqgteglrgeqgekgekgdpgir
68.seq id no:3－编码来自原鸡(鸡)的截短的21型α1胶原蛋白多肽的核苷酸序列gatactggtttcccggggatgcctgggcgctcaggtgatccggggcgtagtggaaaagacggtctgccggggtccccgggctttaagggtgaggtgggtcagcccggtagtccaggtttagaaggtcaccgcggagagcccgggattccaggcattcctggcaaccagggtgccaagggacagaaaggcgaaattggtccgcccggcctaccgggcgcgaaaggttctcctggtgaaaccggtctcatgggtccggaaggtagcttcggcctgcccggcgcacctggtccgaagggcgataagggggagcctgggctgcaaggtaaaccgggtagttctggcgccaaaggtgaacccggcggtcccggtgcgccaggggaaccaggttatcctggtattcctggaacccaaggaattaaaggtgacaaaggctcacagggcgaaagtggtatacagggtcgcaagggcgaaaaaggacgtcagggcaatccaggcctgcagggtactgaaggcctgcgtggagaacagggtgagaaaggtgaaaaaggagatcctggtattcgc
69.seq id no:4－来自原鸡(鸡)的截短的21型α1胶原蛋白多肽的氨基酸序列dtgfpgmpgrsgdpgrsgkdglpgspgfkgevgqpgspgleghrgepgipgipgnqgakgqkgeigppglpgakgspgetglmgpegsfglpgapgpkgdkgepglqgkpgssgakgepggpgapgepgypgipgtqgikgdkgsqgesgiqgrkgekgrqgnpglqgteglrgeqgekgekgdpgir
70.seq id no:5－编码来自原鸡(鸡)的截短的21型α1胶原蛋白多肽的核苷酸序列
71.gatactggtttcccggggatgcctgggcgctcaggtgatccggggcgtagtggaaaagacggtctgccggggtccccgggctttaagggtgaggtgggtcagcccggtagtccaggtttagaaggtcaccgcggagagcccgggattccaggcattcctggcaaccagggtgccaagggacagaaaggcgaaattggtccgcccggcctaccgggcgcgaaaggttctcctggtgaaaccggtctcatgggtccggaaggtagcttcggcctgcccggcgcacctggtccgaagggcgataagggggagcctgggctgcaaggtaaaccgggtagttctggcgccaaaggtgaacccggcggtcccggtgcgccaggggaaccaggttatcctggtattcctggaacccaaggaattaaaggtgacaaaggctcacagggcgaaagtggtatacagggtcgcaagggcgaaaaaggacgtcagggcaatccaggcctgcagggtactgaaggcctgcgtggagaacagggtgagaaaggtgaaaaaggagatcctggtattcgcggcattaacggtcaaaagggtgaaagtgggatacaaggtcttgtcggtccgcccggagttagaggccag
72.seq id no:6－来自原鸡(鸡)的截短的21型α1胶原蛋白多肽的氨基酸序列dtgfpgmpgrsgdpgrsgkdglpgspgfkgevgqpgspgleghrgepgipgipgnqgakgqkgeigppglpgakgspgetglmgpegsfglpgapgpkgdkgepglqgkpgssgakgepggpgapgepgypgipgtqgikgdkgsqgesgiqgrkgekgrqgnpglqgteglrgeqgekgekgdpgirgingqkgesgiqglvgppgvrgq
73.seq id no:7－编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型α1胶原蛋白多肽的核苷酸序列gtctgcagggtatgcctggtgaacgtggtgcaagcggtattgccggtgcaaaaggtgatcgtggtgatgttggtgaaaaaggtccggaaggtgccagcggtaaagatggtagccgtggtctgaccggtccgattggtccgcctggtccggcaggtccgaatggcgaaaaaggtgaaagcggtccgagcggtcctccgggtgcagcaggtactcgtggtgcaccgggtgatcgcggtgaaaatggtccaccgggtcctgccggttttgcaggtccgccaggtgcagatggtcagcctggtgccaaaggcgaacaaggcgaaggtggtcagaaaggtgatgcaggcgctccgggtccgcagggtccttctggtgcacctggtcctcagggtccgaccggtgtttctggtccgaaaggcgcacgtggtgcccagggtccacctggtgcgaccggttttcctggcgcagcaggtcgtgttggtcctccaggtcctaatggtaatccgggtccaagcggtcctgcaggtagcgcaggcaaagatggtcctaaaggtgtacgcggtgatgctggtcctcctggccgtgccggtgatgccggt
74.seq id no:8－来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型α1胶原蛋白多肽的氨基酸序列glqgmpgergasgiagakgdrgdvgekgpegasgkdgsrgltgpigppgpagpngekgesgpsgppgaagtrgapgdrgengppgpagfagppgadgqpgakgeqgeggqkgdagapgpqgpsgapgpqgptgvsgpkgargaqgppgatgfpgaagrvgppgpngnpgpsgpagsagkdgpkgvrgdagppgragdag
75.seq id no:9－编码称为分泌信号序列1的分泌信号序列的核苷酸序列atgaaaaagatttggctggcgctggctggtttagttttagcgtttagcgcatcggcg
76.seq id no:10－分泌信号序列1的氨基酸序列mkkiwlalaglvlafsasa
77.seq id no:11－编码称为分泌信号序列2的分泌信号序列的核苷酸序列atgaaaaaaggtttcatgctgttcaccctcctcgctgcgttctctggtttcgcgcaggct
78.seq id no:12－分泌信号序列2的氨基酸序列mkkgfmlftllaafsgfaqa
79.seq id no:13－编码称为分泌信号序列3的分泌信号序列的核苷酸序列atgatgatcaccctgcgtaaactgccgctggctgttgctgttgctgctggtgttatgtctgctcaggctatggct
80.seq id no:14－分泌信号序列3的氨基酸序列mmitlrklplavavaagvmsaqama
81.seq id no:15－编码称为分泌信号序列4的分泌信号序列的核苷酸序列atgaaaaaaaccgctatcgctatcgctgttgctctggctggtttcgctaccgttgctcaggct
82.seq id no:16－分泌信号序列4的氨基酸序列mkktaiaiavalagfatvaqa
83.seq id no:17－编码称为分泌信号序列5的分泌信号序列的核苷酸序列atgaaagttaaagttctgtctctgctggttccggctctgctggttgctggtgctgctaacgct
84.seq id no:18－分泌信号序列5的氨基酸序列mkvkvlsllvpallvagaana
85.seq id no:19－编码称为分泌信号序列6的分泌信号序列的核苷酸序列atgaaaaaaaacatcctgtctctgtctatggttgctctgtctctgtctctggctctgggttctgtttctgttaccgct
86.seq id no:20－分泌信号序列6的氨基酸序列mkknilslsmvalslslalgsvsvta
87.seq id no:21－编码称为分泌信号序列7的分泌信号序列的核苷酸序列atgctgaacccgaaagttgcttacatggtttggatgacctgcctgggtctgaccctgccgtctcaggct
88.seq id no:22－分泌信号序列7的氨基酸序列mlnpkvaymvwmtclgltlpsqa
89.seq id no:23－编码称为分泌信号序列8的分泌信号序列的核苷酸序列atgaaacaggctctgcgtgtagcgttcggtttcctgatactgtgggcttctgttctgcacgct
90.seq id no:24－分泌信号序列8的氨基酸序列mkqalrvafgflilwasvlha
91.seq id no:25－编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型α1胶原蛋白多肽的经密码子优化的核苷酸序列ggtctgcagggtatgccgggtgaacgtggtgccagcggtattgcaggtgccaaaggtgatcgtggtgatgttggtgaaaaaggtccggaaggtgcaagcggtaaagatggtagccgtggtctgaccggtccgattggtccgccgggtccggccggtccgaatggtgaaaaaggtgaaagcggtccgagcggtccgccgggtgcagccggtacccgtggtgcaccgggtgatcgtggtgaaaatggtccgccgggtccggccggttttgcaggtccgccgggtgccgatggtcagccgggtgcaaaaggtgaacagggtgaaggtggtcagaaaggtgatgccggtgcaccgggtccgcagggtccgagcggtgccccgggtccgcagggtccgaccggtgttagcggtccgaaaggtgcacgtggtgcccagggtccgccgggtgcaaccggttttccgggtgccgcaggtcgtgttggtccgccgggtccgaatggtaatccgggtccgagcggtccggcaggtagcgccggtaaagatggtccgaaaggtgttcgtggtgatgcaggtccgccgggtcgtgccggtgatgcaggttaa
92.seq id no:26－编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型α1胶原蛋白多肽的经密码子优化的核苷酸序列ggcctgcaaggcatgccaggcgagcgcggcgcgtctggcatcgcgggcgcgaagggcgaccgcggcgacgtgggcgagaagggccctgagggcgcgtccggcaaggacggctctcgcggcctgacaggcccaatcggccctccaggccctgcgggcccaaacggcgagaagggcgagtccggcccttctggcccacctggcgcggcgggcacacgcggcgcgccaggcgaccgcggcgagaacggccctccaggccctgcgggcttcgcgggcccacctggcgcggacggccaaccaggcgcgaagggcgagcaaggcgagggcggccaaaagggcgacgcgggcgcgcctggcccacaaggcccttctggcgcgccaggccctcaaggcccaacaggcgtgtccggccctaagggcgcgcgcggcgcgcaaggcccacctggcgcgacaggcttcccaggcgcggcgggccgcgtgggccctccaggccctaacggcaacccaggcccttctggcccagcgggctccgcgggcaaggacggccctaagggcgtgcgcggcgacgcgggcccacctggccgcgcgggcgacgcgggctga
93.seq id no:27－编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型α1胶原蛋白多肽的经密码子优化的核苷酸序列ggtttgcaaggtatgccaggggaacggggtgcgtccgggatagccggggcaaaaggtgatcgaggcgatgtaggagaaaaaggcccagaaggggcgtcaggtaaggacggatctcgcggcttgacgggacctatcgggcctccaggtcccgccggccctaatggggaaaaaggcgagagtgggccgtctggtccgcccggcgccgctggcacacgtggagcgccgggcgatcgtggtgagaacggaccaccgggtcctgctggttttgcgggacctccgggagcagacggccagccgggcgctaaaggtgaacagggtgaaggtggccaaaaaggcgatgcaggcgcaccgggtccgcagggcccttcaggtgcaccgggtccacagggcccaactggcgtttcagggccgaaaggcgcaagaggtgctcagggtccgcccggggcaactgggtttcctggagcggccggccgtgttggacctccggggccgaacggaaaccctggaccgtctggaccagccggttcagcgggtaaggatggtcctaagggtgtaaggggtgacgcaggtccccctggacgtgcaggggatgcggggtag
94.seq id no:28－编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型α1胶原蛋白多肽的经密码子优化的核苷酸序列gggttacaaggtatgccgggagaacgtggagcgtcaggaattgctggggccaaaggtgatcgtggtgatgttggcgagaaagggcccgaaggcgcatctggtaaagatggctcacgcgggttaactggaccaatcggaccaccaggccccgctgggcctaatggtgaaaagggtgaaagtggcccttctggacccccaggagccgccggtacacgtggagcgccaggcgatcgtggcgaaaacggaccgcccggacctgcaggttttgcgggaccccctggagcagacggccaaccaggagcaaaaggtgagcaaggtgaaggtggacaaaagggagatgccggagcgccaggcccccaaggcccatcaggagctccaggacctcaaggtccaactggtgtatcagggcctaagggtgcgcgcggcgctcaaggaccgcctggcgcaactggctttccgggagctgctggtcgtgtgggcccgcctggcccaaacggaaatccaggcccttcaggcccggcgggctcagccggaaaagacggtccgaagggagtccgtggagatgcgggaccgccaggacgcgctggcgatgcaggctaa
95.seq id no:29－编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型α1胶原蛋白多肽的经密码子优化的核苷酸序列ggtttacagggaatgccaggggaacgcggcgcctcagggattgccggtgctaaaggagatcgtggcgacgtgggtgaaaagggtcccgagggagcatcaggtaaggatggttcccgtggtttgacgggacctattggacctccgggtcctgcaggtccgaacggcgaaaagggggaaagcgggcctagtggtccacccggcgccgcaggtacccgtggtgccccaggcgaccgcggggagaatggaccgcctggccctgccggttttgcgggtcctccaggagccgatgggcagcccggtgcaaaaggagagcagggagagggaggtcaaaagggagatgccggcgccccgggccctcagggaccaagcggtgcgccaggcccccagggtcctacgggtgttagcgggccgaaaggcgcacgcggagcgcagggcccacctggtgcaacaggcttcccaggagctgcggggcgcgtcggacctccgggacccaatggaaacccaggtccgtcagggccggcaggctccgcagggaaagatggtcccaaaggcgtgcgtggagacgcagggccccccggacgcgccggcgatgcgggataa
96.seq id no:30－编码来自原鸡的截短的21型胶原蛋白多肽的经密码子优化的核苷酸序列gatactggtttcccggggatgcctgggcgctcaggtgatccggggcgtagtggaaaagacggtctgccggggtccccgggctttaagggtgaggtgggtcagcccggtagtccaggtttagaaggtcaccgcggagagcccgggattccaggcattcctggcaaccagggtgccaagggacagaaaggcgaaattggtccgcccggcctaccgggcgcgaaaggttctcctggtgaaaccggtctcatgggtccggaaggtagcttcggcctgcccggcgcacctggtccgaagggcgataagggggagcctgggctgcaaggtaaaccgggtagttctggcgccaaaggtgaacccggcggtcccggtgcgccaggggaaccaggttatcctggtattcctggaacccaaggaattaaaggtgacaaaggctcacagggcgaaagtggtatacagggtcgcaagggcgaaaaaggacgtcagggcaatccaggcctgcagggtactgaaggcctgcgtggagaacagggtgagaaaggtgaaaaaggagatcctggtattcgc
97.在一些实施方案中，非天然存在的多肽包含seq id no:2、4、6和8中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多肽包含与seq id no:2、4、6和8中的任一个的氨基酸序列具有其至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性等的氨基酸序列。可替代地和/或另外，非天然存在的多肽由seq id no:1、3、5、7和25-30中的任一个的核酸序列编码。在一些实施方案中，非天然存在的多肽由与seq id no:1、3、5、7和25-30中的任一个的核酸序列具有其至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性等的核酸编码。
98.在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以含有或可以不含有来自天然胶原蛋白的一个或更多个结构域。图6描绘了本公开的示例性非天然存在的多肽(例如，截短的
胶原蛋白)与相应的天然存在的胶原蛋白的比对。上图描述了seq id no:2和seq id no:6的非天然存在的多肽与原鸡21型α1胶原蛋白(例如，seq id no:31)的比对。下图描述了seq id no:8的非天然存在的多肽与史氏鲟2型α1胶原蛋白的比对。图6证明了非天然存在的多肽可以具有天然胶原蛋白中发现的一个或更多个结构域(例如，胶原蛋白三股螺旋重复结构域)。图6进一步证明了非天然存在的多肽可以缺乏天然胶原蛋白中发现的一个或更多个结构域(例如，血管性血友病因子a型(vwa)结构域、层粘连蛋白g结构域、纤维状胶原蛋白c-端结构域)。在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以含有一个或更多个胶原蛋白三股螺旋重复结构域。在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以缺乏血管性血友病因子a型(vwa)结构域、层粘连蛋白g结构域和纤维状胶原蛋白c-端结构域中的一个或更多个。
99.在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包括分泌信号序列。任何合适的分泌信号序列(例如，疏水性信号肽、sec信号肽、tat信号肽等)能够诱导非天然存在的多肽(例如，重组多肽)分泌至周质和/或细胞外空间(例如，当在重组宿主细胞中产生时)。示例性分泌信号序列包括氨基酸序列为seq id no:10、12、14、16、18、20、22和24中的任一个的肽。可替代地和/或另外，分泌信号序列包括由seq id no:9、11、13、15、17、19、21和23中的任一个的核酸序列编码的肽。分泌信号序列优选位于非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的n-端。然而，预期分泌信号序列可以位于分泌信号序列保持功能的n-端以外的位置。
100.本文所述的非天然存在的多肽(例如，重组多肽)可以经由编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸序列表达或生成。因此，本公开的另一方面包括表达载体，其包含编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体是细菌表达载体。在一些实施方案中，表达载体是酵母表达载体。在一些实施方案中，表达载体是昆虫表达载体。任何合适的表达载体能够从编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的插入核酸诱导蛋白质表达。示例性细菌表达载体可以包括其中谷胱甘肽s-转移酶用作融合配偶体并且基因表达在tac启动子的控制下的pgex载体，或者使用t7启动子的pet载体(例如，pet28载体等)。示例性酵母表达载体可以包括ppic载体，其使用甲醇可诱导的aox1启动子。在一些实施方案中，表达载体是独立地存在于宿主细胞(例如，表达重组多肽的细胞)中的质粒形式(例如，包括细菌人工染色体形式等)。在一些实施方案中，表达载体经由随机或靶向整合稳定地整合至宿主细胞的染色体中。
101.在一些实施方案中，编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸序列经密码子优化，以在非动物细胞中、优选地在细菌细胞中表达。如本文所用，“经密码子优化”是指密码子组成被改进以在异源细胞(例如，微生物细胞、细菌细胞等)中表达而不改变所编码的氨基酸序列。经密码子优化的核酸序列(例如，编码如本文所述的非天然存在的多肽)的非限制性实例包括seq id no:25-30。
102.在一些实施方案中，表达载体可以包括一种或更多种选择剂。选择剂包括某些糖，包括含有半乳糖的糖或抗生素，包括氨苄青霉素、潮霉素、g418等。用于赋予针对选择剂的抗性的酶包括β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶。可替代地和/或另外，表达载体包括诱导型启动子或组成型启动子(例如，cmv启动子等)，使得编码重组蛋白的核酸可操作地连接至诱导型启动子或组成型启动子。例如，表达载体可以包括四环素诱导型启动子ptet、arac-parabad诱导型启动子或iptg诱导型lac启动子。如本文所用，“可操作地连接”启动子和核酸是指核
酸的表达(例如，转录、翻译等)至少在启动子的部分控制下。
103.在一些实施方案中，编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸(例如，seq id no:1、3、5、7和25-30中的任一个的核酸)和表达载体可以具有20至50bp长、20至40bp长、20至30bp长或30至40bp长的重叠。此类重叠可以使用采用dna聚合酶(例如，gxl聚合酶(www.takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polym erase))的pcr来添加。可以使用任何合适的克隆体系(例如，cloning(www.takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)或sgi gibson组装(us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc))将开放的表达载体和编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的插入核酸一起组装成最终的质粒。
104.此类制备的表达载体(或质粒)可以用于生成遗传工程或修饰的生物体或重组细胞，以产生本文所述的非天然存在的多肽(例如，胶原蛋白、截短的胶原蛋白或胶原蛋白片段)。优选地，重组细胞含有至少一个拷贝的质粒或稳定整合的编码非天然存在多肽(例如胶原蛋白、截短的胶原蛋白或胶原蛋白片段，优选属于或来源于原鸡胶原蛋白和/或史氏鲟胶原蛋白的胶原蛋白、截短的胶原蛋白或胶原蛋白片段)的异源核酸序列。在一些实施方案中，重组细胞是微生物细胞。例如，在表达载体是细菌表达载体的情况下，可以将表达载体插入(例如，经由任何合适的转化方法)至细菌细胞中用于蛋白质表达(例如，大肠杆菌，包括bl-21细胞等)，以独立地存在于细菌的细胞质中(例如，作为质粒形式)或至少暂时和/或稳定地整合至细菌染色体中。
105.因此，可以在合适的培养基中培养转化的细胞。优选地，合适的培养基包括基本培养基，并细胞与植物甘油以50∶50的细胞甘油比冷冻成1.5等份。对于蛋白质表达，可以通过连续摇动培养物(例如，至少100rpm、至少200rpm、至少250rpm等)，将一小瓶冷冻培养的细胞在合适量的细菌培养基(例如，基本培养基，50ml、100ml等)中在至少36℃、优选在约37℃下培养至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少过夜。表2和表3示出了可以用于细胞培养和培养物的基本培养基的示例性制剂。
106.表2：基本培养基制剂表2：基本培养基制剂
107.表3：微量金属制剂
millipore切向流过滤系统来进行过滤步骤。在该实例中，使用两个平行的盒，过滤的总面积可以是0.2m2。在tff阶段可以实现体积减少至1/5和盐减少至1/19。最终的胶原蛋白浆液可以在sds-page凝胶上电泳(run)，以确认重组蛋白的存在。然后可以在sds-page凝胶上分析纯化的重组蛋白，以鉴定在每种相应蛋白的预期大小处观察到的相应的粗且清晰的条带。可以使用反相和尺寸排阻hplc层析来进一步进行滴度和纯度的定量。优选地，纯化的重组蛋白的纯度为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
113.在一些实施方案中，可以配制包含本文提供的非天然存在的多肽(例如，重组蛋白和/或纯化的重组蛋白)的组合物，用于个体(例如，人类(human)、患者、人(person)、动物等)消耗。在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，重组蛋白和/或纯化的重组蛋白)可以配制为用于口服消耗的营养食品补充剂。在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，重组蛋白和/或纯化的重组蛋白)可以配制为用于口服消耗的食品或食物成分。在一些实施方案中，非天然存在的多肽可以配制为蛋白质补充剂。任选地，在此类实施方案中，非天然存在的多肽(例如，重组蛋白和/或纯化的重组蛋白)可以与载体分子、防腐剂和/或另外的可食用成分中的至少一种混合。因此，例如，组合物可以包含维生素(例如，维生素a、维生素b、维生素c、维生素d、维生素e等)、矿物质(例如，钙、锌、铜、锰、铬、钼、硼等)、糖(例如，纤维素、右旋糖、麦芽糖等)和/或天然提取物(例如，草药、人参、紫锥菊、绿茶、葡糖胺、ω-3、叶黄素、叶酸、肝油、鱼油、咖啡提取物等)。适于个体(例如，人类)消耗的制剂包括但不限于即混粉末、即饮饮料、功能性小丸、补充片剂和胶囊、咖啡奶精、棒、小吃或烘焙商品、“无骨”肉汤、非乳制冷冻新奇食品、胶状物(例如，糖果)、巧克力和肉类零食。在实施例4-6中提供了含有非天然存在的多肽的制剂的非限制性实例。
114.如果组合物、制剂或产品向其预期消费者提供了可感知量的营养，则其是“营养的”或“营养性的”，这意味着消费者将组合物或制剂的全部或一部分吸收至细胞、器官和/或组织中。通常，此类吸收至细胞、器官和/或组织中向消费者提供了益处或用处，例如，通过维持或改善所述细胞、器官和/或组织的健康和/或天然功能。如本文所述的被吸收的营养组合物或制剂称为“营养(nutrition)”。作为非限制性实例，如果多肽向其预期消费者提供了可感知量的多肽营养，则多肽是营养的，这意味着消费者将蛋白质的全部或一部分(通常以单个氨基酸或小肽的形式)吸收至细胞、器官和/或组织中。“营养(nutrition)”还指向对象(例如人类或其他哺乳动物)提供营养组合物、制剂、产品或其他材料的过程。营养产品不必是“营养完全的”，这意味着如果消耗足够的量，则产品提供了消费者健康所需的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、必需氨基酸、条件性必需氨基酸、维生素和矿物质。另外，“营养完全的蛋白质”含有所需的所有蛋白质营养(这意味着生物体的生理正常所需的量)，但不一定含有微量营养素例如维生素和矿物质、碳水化合物或脂质。
115.在优选的实施方案中，若组合物或制剂提供的多肽能够分解(例如，肽键的断裂，通常称为蛋白质消化)成足以提供“营养益处”的量的单个氨基酸和/或小肽(例如，两个氨基酸、三个氨基酸或四个氨基酸，可能最多达十个氨基酸)，则其是营养的。另外，在某些实施方案中，提供了营养多肽，其穿过胃肠壁并且作为小肽(例如，大于单个氨基酸但小于约十个氨基酸)或更大的肽、寡肽或多肽(例如，》11个氨基酸)被吸收至血流中。含有多肽的组合物的营养益处可以通过许多度量来证明和任选地量化。例如，营养益处是对消耗生物体的益处，其等于或大于蛋白质每日参考摄入值的至少约0.5％，例如每日参考摄入值的约
1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或大于约100％。可替代地，营养益处通过消费者对饱腹感的感觉和/或识别来证明。在其他实施方案中，营养益处通过将组合物或制剂的大量多肽组分掺入至消费者的细胞、器官和/或组织中来证明，此类掺入通常是指使用单个氨基酸或短肽在细胞内从头产生多肽。“消费者(consumer)”或“消费生物体”是指能够摄取具有营养益处的产品的任何动物。通常，消费者是哺乳动物，例如健康的人类，例如，健康的婴儿、儿童、成人或老年人。可替代地，消费者是处于形成或患有特征在于(i)缺乏足够营养和/或(ii)由本公开的营养产品缓解的疾病、病症或病况的风险的哺乳动物，例如人类(例如，婴儿、儿童、成人或老年人)。“婴儿”通常是小于约1或2岁的人类，“儿童”通常是小于约18岁的人类，“老年人”或“老人”是约65岁或大于65岁的人类。
116.本文提供了营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)，其能够改变健康并且治疗、预防和降低与氨基酸病理生理学相关的多种疾病、病症和病况的严重性，因为它们被选择用于特定的生理益处，以改善健康并且解决许多营养有关的病况，包括胃肠道吸收不良、肌肉萎缩、糖尿病或前驱糖尿病、肥胖症、肿瘤学、代谢疾病以及其他细胞和全身性疾病。还提供了含有营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)的组合物和制剂，如食物、饮料、医疗食物、补充剂和药物。
117.可以评估营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)的物理化学特性，并且可以评估其功能特性(参见，例如，实施例7)。此类特性可以包括可消化性、变应原性、热稳定性、溶解度、聚集性、毒性、味道以及口感/感觉特征。
118.在一些实施方案中，将制剂掺入至食品中，该食品具有优于缺乏营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)的类似食品的优点，或者将制剂掺入至其他产品(例如饮料产品或动物饲料产品)中。例如，与不具有营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)的食品相比，食品具有降低的脂肪含量、降低的糖含量和/或降低的卡路里含量。优选地，营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)存在于食品中，使得消耗营养量的食品是令人满足的。在实施方案中，动物来源的材料明胶被含有一种或更多种营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)的非动物来源的产品替代。通常，营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)以有效替代产品中的明胶的量存在。明胶替代品被掺入食品、饮料产品或动物饲料产品中，并且制剂基本上不含不可食用的产品。
119.本文还提供了含有以功能性和/或营养的量存在的增加食品或饮料产品的粘度的营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)的制剂，例如具有优于缺乏营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)的类似食品的优点的含有掺入至食品中的增加粘度的营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)的制剂。例如，与不具有营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)的食品相比，食品具有降低的脂肪含量、降低的糖含量和/或降低的卡路里含量。粘性的营养性多肽(例如，本文所述的非天然存在的多肽)可以用作脂肪的营养良好的低卡路里代替物。另外，可能需要向组合物和产品中添加一种或更多种多糖或乳化剂，从而进一步改善奶油口感。
120.在某些实施方案中，本公开的非天然存在的多肽可以与其他成分组合，以提供组合产品。此类成分可以包括碳水化合物、脂质、补充矿物质、补充维生素、赋形剂或缓冲剂、
调味剂、甜味剂或着色剂。
[0121]“碳水化合物”是指糖或糖的聚合物。术语“糖”、“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”可以互换使用。大多数碳水化合物是具有许多羟基的醛或酮，通常在分子的每个碳原子上有一个羟基。碳水化合物通常具有分子式cnh2non。碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。最基本的碳水化合物是单糖，例如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是两个相连的单糖。示例性二糖包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖。通常，寡糖包括三至六个单糖单元(例如，棉子糖、水苏糖)，多糖包括六个或更多个单糖单元。示例性多糖包括淀粉、糖原和纤维素。碳水化合物可以含有改性的糖单元，例如其中去除羟基的2
’‑
脱氧核糖、其中氟取代羟基的2
’‑
氟代核糖或n-乙酰葡糖胺、含氮形式的葡萄糖(例如，2
’‑
氟代核糖、脱氧核糖和己糖)。碳水化合物可以以许多不同的形式存在，例如，构象异构体、环状形式、无环形式、立体异构体、互变异构体、端基差向异构体和同分异构体。
[0122]
如本文所用，“脂质”包括脂肪、油、甘油三酯、胆固醇、磷脂、包括游离脂肪酸在内的任何形式的脂肪酸。脂肪、油和脂肪酸可以是饱和的、不饱和的(顺式或反式)或部分不饱和的(顺式或反式)。在一些实施方案中，脂质包含选自以下的至少一种脂肪酸：月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、十七烷酸(17:0)、十七烯酸(17:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、亚麻酸(18:3)、十八碳四烯酸(18:4)、花生酸(20:0)、二十碳烯酸(20:1)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)(epa)、二十二烷酸(22:0)、二十二烯酸(22:1)、二十二碳五烯酸(22:5)、二十二碳六烯酸(dha)和二十四烷酸(24:0)。在一些实施方案中，组合物包含至少一种改性的脂质，例如已通过烹饪改性的脂质。
[0123]
另外的成分还包括补充矿物质或矿物质源。矿物质的实例包括但不限于：氯化物、钠、钙、铁、铬、铜、碘、锌、镁、锰、钼、磷、钾和硒。前述矿物质中的任一种的合适形式包括可溶性矿物质盐、微溶性矿物质盐、不溶性矿物质盐、螯合矿物质、矿物质络合物、非反应性矿物质(例如羰基矿物质和还原矿物质)及其组合。
[0124]
另外的成分还包括一种或更多种补充维生素。维生素可以是脂溶性或水溶性维生素。合适的维生素包括但不限于维生素c、维生素a、维生素e、维生素b12、维生素k、核黄素、烟酸、维生素d、维生素b6、叶酸、吡哆醇、硫胺素、泛酸和生物素。前述物质中的任一种的合适形式是维生素的盐、维生素的衍生物、具有与维生素相同或相似活性的化合物，以及维生素的代谢物。
[0125]
制剂还可以包括赋形剂或缓冲剂。合适的赋形剂的非限制性实例包括促味剂、香料、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。
[0126]
制剂还可以包括防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括天然来源于发酵的有机酸(例如柠檬酸、抗坏血酸、丙酸)、抗微生物肽(乳链菌肽)或其他合适的防腐剂(例如盐、山梨酸钙、山梨酸钠)。
[0127]
粘合剂、润滑剂、分散增强剂、崩解剂等也可以用作赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮、聚乙烯醇、c12-c18脂肪酸醇、聚乙二
醇、多元醇、糖、寡糖及其组合。合适的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁和轻质矿物油。合适的分散剂的非限制性实例包括作为高hlb乳化剂表面活性剂的淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化的木质纤维素、羟基乙酸淀粉钠、异无定形硅酸盐和微晶纤维素。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉)、甜味剂、粘土(例如膨润土)、微晶纤维素、藻酸盐、羧基乙酸淀粉钠、树胶(例如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、梧桐树胶、果胶(pecitin)和黄蓍胶。在一些实施方案中，崩解剂是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合，以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。
[0128]
另外的成分还可以包括调味剂、甜味剂或着色剂。掺入至外层中的调味剂可以选自合成调味油和调味芳香剂；天然油；来自植物、叶、花和果实的提取物；及其组合。合适的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当未用作载体时)；糖精及其各种盐，例如钠盐；二肽甜味剂，例如阿斯巴甜；二氢查耳酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(甜菊苷)；蔗糖的氯代衍生物，例如三氯蔗糖；以及糖醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇(sylitol)等。合适的着色剂的非限制性实例包括食物、药物和化妆品色素(fd&c)、药物和化妆品色素(d&c)，以及外用药物和化妆品色素(ext.d&c)。
[0129]
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、囊片、丸剂、锭剂、含片、粉末和颗粒。胶囊通常包括包含蛋白质或组合物的芯材以及包封芯材的壳壁。在一些实施方案中，芯材包含固体、液体和乳液中的至少一种。在一些实施方案中，壳壁材料包含软明胶、硬明胶和聚合物中的至少一种。
[0130]
包含本文公开的多肽和组合物的粉末或颗粒可以掺入至食品中。在一些实施方案中，食品是用于口服施用的饮料。合适的饮料的非限制性实例包括果汁、果汁饮料、人工调味的饮料、人工增甜的饮料、碳酸饮料、运动饮料、液体乳制品、奶昔、酒精饮料、含咖啡因的饮料、婴儿配方食品等。用于口服施用的其他合适的手段包括水溶液和非水溶液、霜、糊剂、乳液、悬浮液和浆液，其各自还可以任选地含有合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、着色剂、促味剂、香料和调味剂中的至少一种。
[0131]
固体食品的合适的实例包括但不限于食物棒、零食棒、曲奇、核仁巧克力饼、玛芬蛋糕、薄脆饼干、松饼、奶油或糊状物、冰淇淋棒、冷冻酸奶棒等。
[0132]
制剂可以含有基于营养性多肽(例如，如本文所述的非天然存在的多肽)的浓度(例如，基于重量比)的量的营养性多肽(例如，如本文所述的非天然存在的多肽)，使得营养性多肽(例如，如本文所述的非天然存在的多肽)占制剂重量的至多100％，这意味着制剂中存在的物质全部或基本上全部是营养性多肽(例如，如本文所述的非天然存在的多肽)的形式。通常，制剂中存在的约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或小于约5％的重量是营养性多肽(例如，如本文所述的非天然存在的多肽)的形式。在一些实施方案中，制剂含有10mg、100mg、500mg、750mg、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或超过100g的营养性多肽。
[0133]
在一些实施方案中，多肽或组合物以剂型提供。在一些实施方案中，剂型被设计用
于施用本文公开的至少一种多肽，其中施用的多肽的总量选自0.1g至1g、1g至5g、2g至10g、5g至15g、10g至20g、15g至25g、20g至40g、25g至50g以及30g至60g。在一些实施方案中，剂型被设计用于施用本文公开的至少一种蛋白质，其中施用的蛋白质的总量选自约0.1g、0.1g至1g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g、55g、60g、65g、70g、75g、80g、85g、90g、95g以及100g。
[0134]
在一些实施方案中，以每天0.1g至1g、每天1g至5g、每天2g至10g、每天5g至15g、每天10g至20g、每天15g至30g、每天20g至40g、每天25g至50g、每天40g至80g、每天50g至100g或更多的速率消耗蛋白质或组合物。
[0135]
在另一方面，本公开提供了维持或增加对象肌肉质量、肌肉强度和功能表现中的至少一种的方法。在一些实施方案中，方法包括向对象提供足够量的本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物。在一些实施方案中，对象是老人、危重病人和患有蛋白质-能量营养不良的对象中的至少一种。在一些实施方案中，足够量的本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由对象消耗，同时进行运动。在一些实施方案中，本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由对象通过口服、肠内或肠胃外途径消耗。在一些实施方案中，本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由对象通过口服途径消耗。在一些实施方案中，本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由对象通过肠内途径消耗。
[0136]
在另一方面，本公开提供了维持或实现对象期望的身体质量指数的方法。在一些实施方案中，方法包括向对象提供足够量的本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物。在一些实施方案中，对象是老人、危重病人和患有蛋白质-能量营养不良的对象中的至少一种。在一些实施方案中，足够量的本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由对象消耗，同时进行运动。在一些实施方案中，本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由对象通过口服、肠内或肠胃外途径消耗。
[0137]
在另一方面，本公开提供了向患有蛋白质-能量营养不良的对象提供多肽(例如，本公开的多肽)的方法。在一些实施方案中，方法包括向对象提供足够量的本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物。在一些实施方案中，本公开的多肽、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由对象通过口服、肠内或肠胃外途径消耗。
[0138]
一旦对象出现少肌症或虚弱，本公开的多肽就可用于治疗，或用于预防作为危险群体成员的对象的少肌症或虚弱的发作。在一些实施方案中，由对象消耗的多肽全部是根据本公开的多肽。在一些实施方案中，根据本公开的多肽与其他来源的蛋白质和/或游离氨基酸组合，以提供对象的总蛋白质摄入。在一些实施方案中，对象是老人、危重病人和患有蛋白质-能量营养不良的对象中的至少一种。在一些实施方案中，根据本公开的多肽、根据本公开的组合物或通过根据本公开的方法制备的组合物由对象消耗，同时进行运动。在一些实施方案中，根据本公开的多肽、根据本公开的组合物或通过根据本公开的方法制备的组合物由对象通过口服、肠内或肠胃外途径消耗。
[0139]
在一些实施方案中，将本公开的至少一种多肽或组合物掺入至对象的饮食中具有选自以下的至少一种作用：诱导餐后饱腹感(包括通过抑制饥饿)、诱导生热作用、降低血糖
反应、积极影响能量消耗、积极影响瘦体重、降低过度饮食引起的体重增加，以及减少能量摄入。在一些实施方案中，将本公开的至少一种多肽或组合物掺入至对象的饮食中具有选自以下的至少一种作用：增加对象体脂损失、减少无脂肪组织损失、改善脂质分布，以及改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。
[0140]
在一些实施方案中，包含非天然存在的多肽(例如，重组蛋白和/或纯化的重组蛋白)的组合物可以被配制用于局部施用。局部施用可以用于医疗目的或化妆品目的。在此类实施方案中，组合物可以进一步包含载体分子(例如，媒介物)、防腐剂和/或另外的可食用成分中的至少一种。预期了任何合适的载体分子，并且示例性载体分子可以包括水、油、醇、丙二醇或乳化剂。另外，预期了任何合适的防腐剂，并且示例性防腐剂包括氧化锌、对羟基苯甲酸酯、甲醛释放剂、异噻唑啉酮类、苯氧乙醇或有机酸(例如苯甲酸)、苯甲酸钠或丁二醇、己二醇或山梨酸钾。
[0141]
在一方面，包含非天然存在的多肽的组合物可以是个人护理产品(例如，化妆品)。在一些实施方案中，组合物被配制用于局部施用。组合物可以含有适于人类使用的其他化妆品成分。个人护理产品可以用于预防或治疗对人类皮肤或头发的紫外线辐射损伤。个人护理产品可以用于增加皮肤的紧致度、弹性、亮度、水合、触觉质感或视觉质感和/或刺激胶原蛋白产生。个人护理产品可以用于减少皮肤泛红。个人护理产品可以施加至皮肤或头发。组合物包含例如面膜、皮肤清洁剂(例如肥皂、清洁霜、清洁洗剂、面部清洁剂、清洁乳、清洁垫、洁面乳、面部和身体霜)以及保湿剂、面部精华、面部和身体面膜、面部爽肤水和喷雾、眼霜和眼处理剂、去角质剂配方、唇膏和口红、洗发水、护发素和沐浴露、头发和头皮精华、头发雾和喷雾、眼影、遮瑕膏、睫毛膏和其他彩妆。
[0142]
包含非天然存在的多肽的组合物可以进一步包含至少一种另外的成分，该另外的成分包括局部载体或防腐剂。局部载体可以包括选自以下的局部载体：脂质体、生物可降解微胶囊、洗剂、喷雾、气溶胶、扑粉、生物可降解聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、环甲基硅酮、环戊硅氧烷和水。防腐剂可以包括选自以下的防腐剂：生育酚、二碘甲基对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基双环噁唑烷、苯氧乙醇、丁二醇、1,2己二醇、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、ii、迷迭香提取物，以及edta。
[0143]
在本文的某些实施方案中还提供了减少皮肤损伤、促进受损皮肤的修复、保护皮肤免受uv损伤和/或保护皮肤细胞免受暴露于城市灰尘的影响的方法。在另一实施方案中，提供了增加皮肤的紧致度、弹性、亮度、水合、触觉质感或视觉质感和/或刺激胶原蛋白产生的方法。该方法可以包括将包含本公开的非天然存在的多肽的组合物施加至对象的皮肤的步骤。不受特定理论或机制的约束，组合物中的非天然存在的多肽可以通过保护免受uv损伤来减少皮肤损伤。在一些情况下，组合物中的非天然存在的多肽可以通过提高细胞的活力来促进受损皮肤的修复。在一些情况下，组合物中的非天然存在的多肽在施加至皮肤时可以通过增加原胶原蛋白合成和/或促进皮肤细胞的活力来减少皮肤损伤和/或促进细胞修复。在一些情况下，非天然存在的多肽减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(tt)二聚体的形成。
[0144]
本文提供的方法涵盖了组合物用于方法中指示的治疗的用途，例如通过本文提供
的步骤。在实施方案中，本公开提供了本文提供的组合物(例如，非天然存在的多肽或包含非天然存在的多肽的制剂)在用于减少皮肤损伤、促进受损皮肤的修复、保护皮肤免受uv损伤和/或保护皮肤细胞免受暴露于城市灰尘的影响的方法中的用途(例如，例如通过将本文提供的组合物施用至对象的皮肤)。在实施方案中，本公开提供了本文提供的组合物(例如，非天然存在的多肽或包含非天然存在的多肽的制剂)在用于增加皮肤的紧致度、弹性、亮度、水合、触觉质感或视觉质感和/或刺激胶原蛋白产生的方法中的用途。
[0145]
在本文的某些实施方案中，提供了包含本文提供的一种或更多种非天然存在的多肽的(例如，局部)组合物或制剂(例如，用于化妆品用途)。在一些实施方案中，组合物提供了任何合适量的本文提供的多肽，例如以任何合适的量(例如，当给予或施用至个体或细胞时适于提供益处的量)。在一些具体实施方案中，组合物包含当(例如，局部地)施用至个体的皮肤时适于向个体的皮肤提供有益效果的量。在具体实施方案中，组合物包含0.001％至30％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的胶原蛋白多肽)。在更具体的实施方案中，组合物包含0.001％至20％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的胶原蛋白多肽)、0.001％至10％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的胶原蛋白多肽)、0.001％至5％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的胶原蛋白多肽)、0.001％至2％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的胶原蛋白多肽)、0.001％至1％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的胶原蛋白多肽)、0.001％至0.5％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的胶原蛋白多肽)，以及0.001％至0.2％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的胶原蛋白多肽)。
[0146]
在各种实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的浓度或量在本文提供的组合物中以任何合适的量存在，并且可以例如根据用途或制剂(例如，凝胶、胶囊、液体、粉末等)而变化。组合物中非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的示例性浓度可以是组合物中的至少约0.01％、至少约0.05％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.5％、至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％(w/v或w/w)。可替代地和/或另外，组合物中非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的示例性浓度可以是组合物中的约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、至少0.5％、1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％(w/v或w/w)。可替代地和/或另外，组合物中非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的示例性浓度的范围可以为约0.01％至约99％、约0.05％至约99％、约0.1％至约99％、约0.1％至约99％、约0.5％至约99％、约0.1％至约10％、约1％至约99％、约5％至约99％、约10％至约99％、约15％至约99％、约20％至约99％、约25％至约99％、约30％至约99％、约35％至约99％、约40％至约99％、约45％至约99％、约50％至约99％、约55％至约99％、约60％至约99％、约65％至约99％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约0.1％至约90％、约1％至约90％、约5％至约90％、约10％至约90％、约15％至约90％、约20％至约90％、约25％至约90％、约30％至约90％、约35％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％、约50％至约90％、约55％至约90％、约60％至约90％、约65％至约
90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约85％至约90％、约20％至约80％、约25％至约80％、约30％至约80％、约35％至约80％、约40％至约80％、约45％至约80％、约50％至约80％、约55％至约80％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％等。可替代地和/或另外，组合物中非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的示例性浓度可以小于约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％等。
[0147]
本公开的某些方面包括通过将组合物施用至对象来改善对象的皮肤、头发和/或指甲的外观的方法。另外和/或可替代地，本公开包括改善对象关节健康和/或恢复骨密度的方法。在一些实施方案中，对象患有或疑似患有骨质疏松症和/或骨关节炎。可替代地和/或另外，本公开包括改善肠道健康、改变或改善对象的微生物组，或改变和/或减少对象炎症或组织修复的方法。在一些实施方案中，组合物以足以或有效改善对象的皮肤、头发和/或指甲的外观、改善患有骨质疏松症和/或骨关节炎的对象的关节健康和/或恢复骨密度、和/或改善肠道健康、改变或改善对象的微生物组或改变和/或减少对象炎症或组织修复的剂量和时间表口服施用。任选地使用任何合适的剂量。在一些实施方案中，使用的剂量为约0.1mg/kg至约200mg/kg、约0.2mg/kg至约150mg/kg、约0.5mg/kg至约150mg/kg、约0.5mg/kg至约100mg/kg、约0.8mg/kg至约100mg/kg、约1.0mg/kg至约100mg/kg、约1.0mg/kg至约90mg/kg、约1.0mg/kg至约80mg/kg、约1.0mg/kg至约70mg/kg、约1.0mg/kg至约60mg/kg、约1.0mg/kg至约50mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2.0mg/kg、约2.5mg/kg、约3.0mg/kg、约3.5mg/kg、约4.0mg/kg、约4.5mg/kg或约5.0mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg或约30mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以通过施用的时间表增加或减少。例如，施用至对象(例如，人类)的剂量可以增加或减少约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约1.0mg/kg/每次施用(例如，对于3次连续施用，剂量可以分别从2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg增加等)。在另一实例中，施用至对象(例如，人类)的剂量可以增加然后减少或减少然后增加约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约1.0mg/kg/每次施用(例如，对于5次连续施用，剂量可以分别从2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg增加、然后为2.2mg/kg和2.0mg/kg等)。
[0148]
在一些实施方案中，施用的时间表根据对象的目的、性别、年龄或健康状况而变化。例如，在一些实施方案中，每天一次、每天两次、每天三次、每天最多达6次、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天等施用组合物。可替代地和/或另外，在一些实施方案中，以不规则的间隔或增加的间隔或减少的间隔多次施用组合物。
[0149]
在某些实施方案中，组合物以足以或有效改善对象的皮肤、头发和/或指甲的外观和/或减少对象炎症的剂量和/或时间表局部施加。在一些情况下，剂量根据局部施加的靶区域(例如，头发、皮肤、伤口、指甲等)而变化，并且可以局部施加的剂量范围为约0.1g/英寸2至约10g/英寸2、约0.1g/英寸2至约9g/英寸2、约0.1g/英寸2至约8g/英寸2、约0.1g/英寸2至约7g/英寸2、约0.1g/英寸2至约6g/英寸2、约0.1g/英寸2至约5g/英寸2、约0.1g/英寸2至约4g/英寸2、约0.1g/英寸2至约3g/英寸2、约0.5g/英寸2至约5g/英寸2、约0.5g/英寸2至约4g/英寸2、约1g/英寸2至约4g/英寸2或约1g/英寸2至约3g/英寸2区域。在某些实施方案中，剂量
根据目的、性别、年龄、区域损伤的严重程度或健康状况而变化。例如，可以每天至少三次、每天至少两次、每天一次、每天最多达6次、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天等将组合物施加至对象的靶区域。
[0150]
皮肤外观和质量：在一些实施方案中，本文提供了改善皮肤外观和/或质量的方法，例如通过将有效量的本文提供的产品或组合物(例如，含有本文所述的非天然存在的多肽)施用至个体(例如，需要这种改善的个体)。在一些实施方案中，施用为口服或局部。在一些情况下，施用导致对个体皮肤的各种改变或影响。在一些情况下，个体的皮肤表现出增殖增加和/或细胞死亡率降低(例如，当使用用于评估细胞代谢活性的比色试验(例如，mtt试验)进行测试时)。在一些实施方案中，皮肤表现出细胞外基质(ecm)组分(例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、原纤蛋白)的产量提高和/或基质降解蛋白(例如，基质金属蛋白酶(mmp)和蛋白酶)的产量减少。在某些情况下，皮肤在暴露于有害试剂如光损伤(例如，uv照射)、污染(例如，城市灰尘)和/或刺激性强的护肤活性物质(例如，视黄酸、过氧化苯甲酰、水杨酸)后显示出抗性或改善的结果。在某些情况下，这种抗性或改善的结果经由细胞活力或增殖改善(或细胞死亡减少)、dna修复改善、炎症减少、反应性氧化应激(ros)减少来显示，细胞活力或增殖改善(或细胞死亡减少)可以使用mtt活力试验评估，dna修复改善可以通过胸苷-二聚体elisa检测评估，炎症减少可以通过luminex检测评估，反应性氧化应激(ros)减少可以通过cm-h2dcfda(通用氧化应激指示剂)检测评估。
[0151]
在一些情况下，皮肤表现出皱纹和/或细纹减少、皮肤泛红和/或色素沉着过度减少、皮肤亮度提高、毛孔大小缩小、皮肤粗糙减少和/或痤疮减少(例如，当使用clarity分析进行评估时)。在某些情况下，皮肤表现出皮肤弹性改善、皮肤紧致度提高、皮肤水合增加、皮肤屏障功能提高、皮肤胶原蛋白和弹性蛋白含量增加和/或皮肤密度增加。
[0152]
头发质量：在一些实施方案中，本文提供了改善头发外观和/或质量的方法，例如通过将有效量的本文提供的产品或组合物(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)施用至个体(例如，需要这种改善的个体)。在一些实施方案中，施用为口服或局部。在一些情况下，施用导致对个体头发的各种改变或影响。在某些情况下，头发表现出头发纤维厚度和/或密度改善、水分增加、生长速率更快、发梢分叉减少、卷曲减少/静电控制提高、纤维排列/光泽改善、可梳性增加和/或抗头发断裂性更强。在一些情况下，头发表现出头发生长改善、头发纤维直径更粗、可梳性增加、头发损失减少和/或头发拉伸强度提高。
[0153]
指甲质量：在一些实施方案中，本文提供了改善指甲外观和/或质量的方法，例如通过将有效量的本文提供的产品或组合物(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)施用至个体(例如，需要这种改善的个体)。在一些实施方案中，施用为口服或局部。在一些情况下，施用导致对个体指甲的各种改变或影响。在某些情况下，指甲显示出指甲脱落、指甲边缘不规则和/或指甲粗糙、指甲开裂/碎裂的频率的改善(减少)和/或指甲生长速率提高。
[0154]
关节健康：在一些实施方案中，本文提供了改善关节健康的方法，例如通过将有效量的本文提供的产品或组合物(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)施用至个体(例如，需要这种改善的个体)。在一些实施方案中，施用为口服。在一些情况下，施用导致对个体关节健康的各种改变或影响。在某些情况下，通过报告的关节疼痛减少和/或关节活动性提高来表现关节健康改善。
[0155]
炎症：在一些实施方案中，本文提供了改善炎症作用的方法，例如通过将有效量的
本文提供的产品或组合物(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)施用至个体(例如，需要这种改善的个体)。在一些实施方案中，施用为口服或局部。在一些情况下，施用导致对个体炎症的各种改变或影响。在某些情况下，通过血流中的细胞因子水平更低(例如，通过luminex检测评估)和/或恢复免疫细胞的健康水平(例如，通过血液分类计数)来表现炎症作用改善。
[0156]
肠道健康：在一些实施方案中，本文提供了改善肠道健康的方法，例如通过将有效量的本文提供的产品或组合物(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)施用至个体(例如，需要这种改善的个体)。在一些实施方案中，施用为口服。在一些情况下，施用导致对个体的肠道健康的各种改变或影响。在某些情况下，通过肠运动改善和/或胃肠不适/疼痛减少来证明肠道健康改善。
[0157]
微生物组：在一些实施方案中，本文提供了改变和/或改善微生物组的方法，例如通过将有效量的本文提供的产品或组合物(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)施用至个体(例如，需要这种改善的个体)。在一些实施方案中，施用为口服。在一些情况下，施用导致对个体的微生物组的各种改变或影响。在某些情况下，通过微生物的多样性增加和/或有益微生物的丰度增加(例如，通过粪便样品的16s dna测序评估)来证明微生物组改善。实施例
[0158]
实施例1.本公开的非天然存在的多肽的生成。
[0159]
本实施例显示出通过遗传工程微生物生成本公开的重组多肽以及此类产生的多肽的纯化过程。
[0160]
合成seq id no:1、3、5和7的多核苷酸，并且将多核苷酸中的至少一种插入至pet载体中。将pet载体与seq id no:1、3、5和7之间的重叠长度设计为20至30bp，并且使用用酶gxl聚合酶(www.takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polym erase)的pcr来添加。使用in-cloning(www.takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)将打开的pet载体和插入dna(例如，seq id no:1的多核苷酸)一起组装成最终的质粒。在所有情况下，核酸序列以如seq id no:9、11、13、15、17、19、21或23公开的分泌信号序列为先导。通过sanger测序验证质粒序列。
[0161]
用最终质粒转化细胞，随后在基本培养基中培养，并且与植物甘油以50∶50的细胞与甘油的比例冷冻成1.5等份。将一小瓶冷冻培养物在50ml的基本培养基中在37℃、200rpm下过夜复苏。本实施例中的基本培养基的制剂在表2和表3中示出。然后将细胞转移至300ml的基本培养基中，生长6-9小时，以达到5-10的光密度(od)600。
[0162]
在25℃至28℃范围的各种温度下进行发酵。对于一些发酵，将发酵的温度维持在恒定温度，并且在发酵完成后立即纯化多肽。对于其他发酵，将发酵的温度维持一段期望的时间，当细胞密度达到od600为10-20时，降低温度以诱导蛋白质产生。通常，将温度从28℃降低至25℃。通过向培养基中添加浓度范围为0.1-0.5mm的iptg进行诱导。继续发酵40-60小时。
[0163]
如下纯化重组多肽：使用5％-50％的硫酸将发酵液的ph降低至3-3.5。然后使用离心或离心接着微滤来分离细胞。在聚丙烯酰胺凝胶上测试酸化的发酵液的上清液，发现含有与起始沉淀相比相对高丰度的重组多肽。为了减少体积和盐，超滤进行浓缩和渗滤步骤。
将最终的多肽浆液在sds-page凝胶上电泳，以确认重组多肽的存在。
[0164]
为了验证产生了期望的蛋白质，收集携带seq id no:1、3、5或7的微生物培养物的上清液，并且如上所述通过降低其ph来纯化。通过sds-page分析酸化的发酵液，并且以相对纯度检测对应于预期大小的蛋白质的条带。如图1所示，在每种相应蛋白的预期大小处观察到了粗且清晰的条带。随后通过反相和尺寸排阻hplc层析以及质谱分析样品，用于定量重组多肽滴度和纯度，这确认了感兴趣的相应蛋白质的正确身份。
[0165]
图2a-2c描绘了在ph 3.0处理之前和之后，本公开的非天然存在的多肽的sds-page凝胶。图2a描绘了在ph 3.0处理之前(泳道1)和之后(泳道2)，含有氨基酸序列为seq id no:2的非天然存在的多肽的发酵上清液的sds-page凝胶。这种多肽的预期分子量为约17.9kda。通过质谱确认了多肽的身份(数据未示出)。图2b描绘了在ph 3.0处理之前(泳道3)和之后(泳道4)，含有氨基酸序列为seq id no:8的非天然存在的多肽的发酵上清液的sds-page凝胶。这种多肽的预期分子量为约17.6kda。通过质谱确认了多肽的身份(数据未示出)。图2c描绘了在ph 3.0处理之前(泳道3-5)和之后(泳道6-8)，含有各种细菌宿主菌株中产生的氨基酸序列为seq id no:8的非天然存在的多肽的发酵上清液的sds-page凝胶。
[0166]
实施例2.本公开的非天然存在的多肽的人类临床研究。
[0167]
皮肤外观和质量：招募患者和/或提供培养的人类皮肤细胞或患者来源的皮肤样品，以评估本文提供的重组多肽的益处。将如本文所述的非天然存在的多肽(或含有如本文所述的非天然存在的多肽的产品)和对照产品施用(口服或局部)至不同的(体外或体内)群组，以评估对皮肤的各种影响。定量和/或定性地评估皮肤效果。例如，当将包含非天然存在的多肽的组合物施加至或施用至体外培养的人类皮肤细胞(原代培养物或细胞系)或离体的人类皮肤组织时，培养的人类皮肤细胞或人类皮肤组织中的细胞显示出增殖增加或细胞死亡率降低(例如，当使用用于评估细胞代谢活性的比色试验(例如，mtt试验)进行测试时)。在一些情况下，经由rna-seq转录组学分析或蛋白质组学分析，与包含本文所述的非天然存在的多肽的组合物接触或用其处理的这种培养的人类皮肤细胞或人类皮肤组织中的细胞可以显示出细胞外基质(ecm)组分(例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、原纤蛋白)的产量增加以及基质降解蛋白(例如，基质金属蛋白酶(mmp)和蛋白酶)的产量减少。评估这种经处理的培养的人类皮肤细胞或人类皮肤组织中的细胞，以证明在暴露于有害试剂如光损伤(例如，uv照射)、污染(例如，城市灰尘)和刺激性强的皮肤护理活性物质(例如，视黄酸、过氧化苯甲酰、水杨酸)后的抗性或改善的结果。这种抗性或改善的结果经由细胞活力或增殖改善(或细胞死亡减少)、dna修复改善、炎症减少和/或反应性氧化应激(ros)减少来显示，细胞活力或增殖改善(或细胞死亡减少)使用mtt活力试验评估，dna修复改善通过胸苷-二聚体elisa检测评估，炎症减少通过luminex检测评估，反应性氧化应激(ros)减少通过cm-h2dcfda(通用氧化应激指示剂)检测评估。
[0168]
在另一实施例中，当将包含非天然存在的多肽(例如，如本文所述的)的组合物口服或局部施加至或施用至对象的皮肤上时，评估对象的皮肤的皱纹和细纹减少、皮肤泛红和色素沉着过度减少、皮肤亮度提高、毛孔大小缩小、皮肤粗糙减少和痤疮减少(例如，当使用clarity分析进行评估时)。还进一步评估皮肤(施用前和施用后)，以显示皮肤弹性的改变、皮肤紧致度的改变、皮肤水合的改变、皮肤屏障功能的改变、皮肤胶原蛋白和弹性蛋白含量的改变和/或皮肤密度的改变。
[0169]
头发质量：还评估了本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)对头发的影响(例如，相对于对照产品)。例如，当将本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)施加至头发或口服施用至对象时，测量头发质量，例如通过测量头发纤维厚度和密度的改变、水分的改变、生长速率的改变、发梢分叉率的改变、卷曲的改变/静电控制提高、纤维排列/光泽的改变、可梳性的改变和/或抗头发断裂性的改变(例如，通过体外发绺测试测量)。在一些情况下，临床测试测量了头发生长、头发纤维直径、可梳性、头发损失和/或头发拉伸强度的改变。
[0170]
指甲质量：还评估了本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)对指甲的影响(例如，相对于对照产品)。例如，当将本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)施加至指甲或口服施用至对象时，测量指甲质量，例如通过测量指甲硬度、指甲脱落、指甲边缘不规则和指甲粗糙、指甲开裂/碎裂的频率和/或指甲生长速率的改变。
[0171]
关节健康：还评估了本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)对关节的影响(例如，相对于对照产品)。例如，当将本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)口服施用至对象时，测量关节质量，例如通过测量报告的关节疼痛和/或关节活动性的范围的改变。
[0172]
炎症：还评估了本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)对炎症的影响(例如，相对于对照产品)。例如，当将本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)口服施用至对象时，测量炎症的改变，测量血流中的细胞因子水平(例如，通过luminex检测评估)和/或测量免疫细胞的水平(通过血液分类计数)。
[0173]
肠道健康：还评估了本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)对肠道健康的影响(例如，相对于对照产品)。例如，当将本文提供的产品(例如，含有如本文所述的非天然存在的多肽)口服施用至对象时，测量肠运动和/或胃肠不适/疼痛的改变。
[0174]
微生物组：还评估了本文提供的产品(例如，含有本文所述的非天然存在的多肽)对微生物组的影响(例如，相对于对照产品)。例如，当将本文提供的产品(例如，含有本文所述的非天然存在的多肽)口服施用至对象时，测量微生物的多样性或有益微生物的丰度的改变，这可以通过粪便样品的16s dna测序评估。此外，当组合物支持有益微生物在发酵液共培养物中的生长时，这种影响可以在体外示出。
[0175]
实施例3.本公开的非天然存在的多肽的体外研究。
[0176]
该实施例证明了用氨基酸序列为seq id no:2的非天然存在的多肽处理后对体外细胞的功能影响。seq id no:2的非天然存在的多肽增加人真肤成纤维细胞的活力。
[0177]
在单独培养基(图3；“a”)，或含0.025％w/w(图3；“b”)、0.05％w/w(图3；“c”)或0.1％w/w(图3；“d”)的氨基酸序列为seq id no:2的非天然存在的多肽的培养基中培养人原代成纤维细胞，持续24小时。使用mtt比色试验评估细胞活力。如图3所示，相对于仅有培养基的对照，用seq id no:2的多肽处理的成纤维细胞显示出细胞活力的提高。seq id no:2的非天然存在的多肽增加人皮肤成纤维细胞中i型胶原蛋白的产量。
[0178]
在单独培养基(图4；“a”)，或含0.025％w/w(图4；“b”)、0.05％w/w(图4；“c”)或
0.1％w/w(图4；“d”)的氨基酸序列为seq id no:2的非天然存在的多肽的培养基中培养人原代成纤维细胞，持续24小时。通过用i型原胶原蛋白c-肽的酶联免疫吸附试验(elisa)分析上清液来测定i型胶原蛋白的成纤维细胞产量，其为总分泌的i型胶原蛋白的读数。如图4所示，用seq id no:2的多肽处理的成纤维细胞比培养基对照处理的成纤维细胞分泌更高水平的i型胶原蛋白。seq id no:2的非天然存在的多肽增加人肌腱细胞中i型胶原蛋白的产量。
[0179]
在单独培养基(图5；“a”)，或含0.025％w/w(图5；“b”)或0.05％w/w(图5；“c”)的氨基酸序列为seq id no:2的非天然存在的多肽的培养基中培养人原代肌腱细胞，持续24小时。通过用i型原胶原蛋白c-肽的酶联免疫吸附试验(elisa)分析上清液来测定i型胶原蛋白的肌腱细胞产量，其为总分泌的i型胶原蛋白的读数。如图5所示，用seq id no:2的多肽处理的肌腱细胞比培养基对照处理的细胞分泌更高水平的i型胶原蛋白。
[0180]
实施例4.含有本公开的非天然存在的多肽的运动饮料。
[0181]
在该实施例中，将本公开的非天然存在的多肽配制在运动饮料中。
[0182]
运动饮料配方：
[0183]
10g seq id no:2的多肽/12盎司份
[0184]
成分列表：
[0185]
水、胶原蛋白肽、糖、浓缩橘子汁、盐、柠檬酸、磷酸一钾、柠檬酸钠、果蔬汁[用于颜色]、天然调味料、甜菊糖苷
[0186]
测试的变量：
[0187]
1. 10g vs.12g seq id no:2的多肽/12盎司份
[0188]
2. 0％-15％浓缩果汁
[0189]
3. 7g-20g糖/12盎司份
[0190]
4.甜味剂体系：蔗糖、罗汉果、甜菊糖苷
[0191]
5. 0.05％-0.30％柠檬酸
[0192]
实施例5含有本公开的非天然存在的多肽的胶状物。
[0193]
在该实施例中，将本公开的非天然存在的多肽配制在胶状物中。
[0194]
2.5g seq id no:2的多肽&100mg透明质酸/25g份
[0195]
成分列表：
[0196]
木薯淀粉糖浆、蔗糖、水、胶原蛋白肽、柠檬酸、果胶、柠檬酸钠、天然调味料、透明质酸钠、果蔬汁[用于颜色]
[0197]
测试的变量：
[0198]
1.添加顺序－seq id no:2的多肽需要制成溶液并在糖浆烹饪步骤后添加。
[0199]
2.seq id no:2的多肽的各种水平(2％、6％、8％、10％)
[0200]
3.seq id no:2的多肽具有缓冲效果；测试了不同的柠檬酸盐/柠檬酸水平。
[0201]
实施例6.含有本公开的非天然存在的多肽的核仁巧克力饼。
[0202]
在该实施例中，将本公开的非天然存在的多肽配制在核仁巧克力饼中。
[0203]
3g seq id no:2的多肽/40g份
[0204]
成分列表：
[0205]
(面包)面粉、蔗糖、可可粉、水、椰子油、seq id no:2的多肽、橄榄油、甘油、香草提
取物、小苏打、盐、黄原胶、卵磷脂。
[0206]
测试的变量：
[0207]
1.通用面粉vs.面包面粉
[0208]
2.3g、3.75g、5g或9g seq id no:2的多肽/40g份
[0209]
3.还原糖20％、30％
[0210]
实施例7.本公开的非天然存在的多肽与营养用途有关的特性
[0211]
在该实施例中，评估了seq id no:2的非天然存在的多肽与营养用途有关的各种特性。
[0212]
粘度
[0213]
可以评估本文提供的非天然存在的多肽在溶液中的粘度。在该实施例中，使用在具有40mm平行板的dhr-ii流变仪上的在25℃下进行的流扫，显示出seq id no:2的多肽在ph 4.5时可溶性最高达43％w/w，在ph 6.5时可溶性最高达50％w/w。经发现，作为喷雾干燥粉末的seq id no:2的多肽在50℃或更高温度的水中比在环境温度的水中更缓慢地溶解。结果如图7a和图7b所示。
[0214]
还评估了seq id no:2的多肽与亲水胶体和油的相互作用。制备seq id no:2的多肽和阿拉伯树胶在去离子(di)中的共混物，并且根据表4的比例评估粘度。表4.阿拉伯树胶和多肽共混物的比例阿拉伯树胶seq id no:220％020％10％10％5％10％020％20％10％10％10％10％，但ph 6.5
[0215]
制备seq id no:2的多肽和黄原胶在去离子水中的共混物，并且以各种比例评估粘度。图8描绘了该研究的结果。sda代表ph 6.5的喷雾干燥的seq id no:2的多肽。sdb代表ph 4.5的含20％固体进料的喷雾干燥的seq id no:2的多肽。
[0216]
凝胶硬度
[0217]
可以评估本公开的非天然存在的多肽在溶液中的凝胶硬度。简言之，用100u转谷氨酰胺酶交联5％的蛋白质溶液(含有seq id no:2的多肽)。将蛋白质和酶混合物在12孔细胞板中沉积，并且在50℃孵育2小时。将凝胶加热至100℃，持续10分钟，以使转谷氨酰胺酶失活。将凝胶在环境温度下冷却，并且在4℃保存过夜。通过在23mm直径的孔中模制4ml的凝胶混合物来评估凝胶硬度。在测量之前使凝胶恢复至环境温度，并且使用ta.xt plus质感分析仪(texture analyzer)仪器将凝胶的硬度记录为以1mm/秒将1/2”不锈钢球探针(ta-18)压入凝胶中2mm的力。在去离子水或10mm磷酸钠缓冲液(ph 7.2)中制备蛋白质溶液。在加入酶之前，使用1m hcl或2n naoh将溶液调节至目标ph。该研究的结果如图9所示。
[0218]
在去离子水或10mm磷酸钠缓冲液(ph 7.2)中制备蛋白质溶液。在加入酶之前，使用1m hcl或2n naoh将溶液调节至目标ph。结果如图10a和图10b所示。在ph 5.5时，交联的
gl21凝胶的硬度范围为27-35g。在ph 6.3-6.4之间时，交联的多肽凝胶的硬度范围为20-31g。
[0219]
乳液特性
[0220]
可以评估本文所述的非天然存在的多肽在溶液中的乳液特性。将ph 4.5的蛋白质溶液与芥花油以5∶1的比例混合，并且使用ika ultra turrax在10000rpm下搅匀10min。24小时后，在环境温度下在12ml锥形管中评估乳液的稳定性。
[0221]
起泡性和泡沫稳定性
[0222]
可以评估本文所述的非天然存在的多肽在溶液中的起泡特性。将不同批次的10ml的5％w/w的seq id no:2的多肽溶液在50ml锥形管中摇动2分钟。记录泡沫的体积和泡沫破裂的时间，结果如表5所示。表5.泡沫的体积和泡沫破裂的时间。表5.泡沫的体积和泡沫破裂的时间。
[0223]
感官注释
[0224]
可以评估本公开的非天然存在的多肽的感官特性，包括气味和口味。干燥或在溶液中评估了不同批次的喷雾干燥的seq id no:2的多肽，结果如表6所示。表6.感官注释。
[0225]
溶解度
[0226]
可以评估本公开的非天然存在的多肽的溶解度。评估卵磷脂溶液凝聚对seq id no:2的多肽的压实粉末形式增加颗粒大小和改善溶解度的影响。将2.5g蛋白质粉末滴入至50ml水中。通过在20秒内观察下沉来评估润湿性。用40秒的缓慢搅拌和60秒的静止评估溶解。结果如表7所示。表7.seq id no:2的多肽的溶解度。
[0227]
在25℃下还测定了seq id no:2的多肽在20％w/w溶液中的溶液粘度，结果如图11所示。
[0228]
将ph 5.5的8％w/w蛋白质溶液(含有seq id no:2的多肽)和100u转谷氨酰胺酶与50％w/w油用polytron在26000rpm下在冰上搅匀1分钟。将4g混合物沉积至12孔细胞板的每个孔中，并且在50℃孵育2小时。将凝胶加热至100℃，持续10分钟，以使酶失活。将凝胶在环境温度下冷却，并且在4℃保存过夜。seq id no:2的多肽在交联反应期间稳定了高油乳液，以形成蛋白质油凝胶。结果如图所示。
[0229]
实施例8.产品的多肽序列确认和羟脯氨酸残基的缺失
[0230]
使用质谱确认根据本公开的方法产生的seq id no:2的多肽序列。表8和表9提供了该多肽的肽图谱结果。表8.seq id no:2的多肽的肽图谱。
表9.seq id no:2的多肽的肽图谱。
[0231]
还进行分析以评估产生的seq id no:2的多肽中存在的任何氨基酸或肽修饰。(表10)。在一些情况下，进行了另外的验证分析，以区分甲硫氨酸氧化与羟脯氨酸残基的存在。例如，基于ms/ms扫描的片段化结果，胰蛋白酶肽t1(序列dtgfpgmpgr)显示出含有甲硫氨酸氧化而不是脯氨酸羟基化。基于这些结果，最终确定胰蛋白酶肽1(t1)在第7位甲硫氨酸处具有氧化而在第5位或第8位处没有羟脯氨酸的证据。类似地，在胰蛋白酶肽9(t9)的第83位存在另一个甲硫氨酸的情况下，多肽的第77、85、92、95和97位处没有可检测水平的甲硫氨酸氧化、羟脯氨酸或第98位处没有可检测水平的羟赖氨酸。因此，本公开的截短的胶原蛋白多肽与天然存在的胶原蛋白多肽的不同之处还在于他们缺乏羟脯氨酸残基。表10.seq id no:2的多肽的氨基酸和肽修饰的分析。
[0232]
尽管本文已经示出和描述了本公开的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不背离本公开的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本公开的实施方案时，可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代。以下权利要求旨在限定本公开的范围，并且因此涵盖这些权利要求及其等效物的范围内的方法和结构。