用于治疗或预防纤维化、肥大或心力衰竭的髓源性生长因子的制作方法

1.本发明涉及用于治疗或预防纤维化和肥大的蛋白质髓源性生长因子(mydgf)或编码所述蛋白质的核酸。本发明还涉及用于治疗或预防心力衰竭的蛋白质mydgf或编码所述蛋白质的核酸。本发明还涉及包含该核酸的载体、表达该核酸的宿主细胞、和用于治疗纤维化和肥大以及用于治疗或预防心力衰竭的方法。
2.发明背景
3.髓源性生长因子(mydgf)，也称为因子1，是人类19号染色体(c19orf10)上开放阅读框10中编码的蛋白质。2007年，在所谓的成纤维细胞样滑膜细胞(fls细胞)的蛋白质组分析中，该蛋白质被描述为滑膜中的一种新的分泌因子。在没有任何实验或统计证据的情况下，已经假设了该蛋白质的分泌和关节炎症性疾病之间的相关性(weiler等人,arthritis research and therapy 2007,the identification and characterization of a novel protein,c19orf10,in the synovium)。相应的专利申请要求该蛋白质作为治疗剂，用于治疗关节和用于诊断正在经历生长改变的组织以及监测组织中的变化(us 2008/0004232 a1,characterization of cl9orfl0,a novel synovial protein)。另一篇科学出版物描述了该蛋白在肝癌细胞中的增强表达(sunagozaka等人，international journal of cancer,2010,identification of a secretariant protein c19orf10 activated in hepatocellular carcinoma)。重组蛋白对培养的肝癌细胞具有增殖促进作用。注意，c19orf10也指的是il-25、il-27和il-27w，因为它最初被认为是一种白细胞介素。然而，术语“il-25”和“il-27”在本领域中的使用不一致，它们被用来指代多种不同的蛋白质。例如，us 2004/0185049提到了一种称为il-27的蛋白质，并公开了其在调节免疫反应中的用途。这种蛋白质在结构上不同于因子1(将根据seq id no:1的因子1氨基酸序列与根据uniprot:q8nev9的“il-27”的氨基酸序列进行比较)。类似地，ep 2 130 547 a1提到一种称为il-25的蛋白质，并公开了其在治疗炎症中的用途。这种蛋白质在本领域中也称为il-17e，并且在结构上不同于因子1(将根据seq id no:1的因子1的氨基酸序列与根据uniprot:q9h293的“il-25”的氨基酸序列进行比较)。
4.wo 2014/111458公开了用于促进非转化组织或非转化细胞的增殖和抑制非转化组织或非转化细胞的凋亡的因子1，特别是用于治疗急性心肌梗死。还公开了医用因子1抑制剂，特别是用于治疗或预防一类疾病，其中血管生成有助于该类疾病的发展或进程。
5.korf-klingebiel等人(nature medicine，2015，vol.21(2):140-149)报道了心肌梗死后骨髓细胞分泌c19orf10，该蛋白促进心肌细胞存活和血管生成。作者表明，骨髓来源的单核细胞和巨噬细胞内源性产生这种蛋白，以保护和修复心肌梗死后的心脏，并提出了髓源性生长因子(mydgf)的名称。特别是，据报道用重组mydgf治疗可减少心肌梗死后的疤痕尺寸和收缩功能障碍。
6.心力衰竭是一种预后不良的临床综合征，可因持续血流动力学超负荷、心肌损伤或基因突变而发展。慢性炎症会促成心力衰竭的发病和发展，并已成为一个治疗目标(adamo等人，nat rev cardiol.2020；17:269-285)。心力衰竭和炎症之间的关系是双向的，
涉及心脏、免疫系统和外周器官之间的交互作用。在心肌中，炎症细胞衍生的细胞因子和生长因子通过作用于心脏实质和基质细胞促使收缩功能障碍和不利的左心室(lv)重构(bozkurt等人，circulation.1998；97:1382-1391；ismahil等人，circ res.2014；114:266-282；sager等人，circ res.2016；119:853-864；hulsmans等人，j exp med.2018；215:423-440；bajpai等人，nat med.2018；24:1234-1245)。
7.由小鼠的横向主动脉缩窄(tac)手术引起的心脏急性压力超负荷，引发涉及先天和适应性免疫系统的炎症反应(martini等人，circulation,2019；140:2089-2107)。应激但存活的心肌细胞发出的信号触发了炎症级联反应(suetomi等人,circulation.2018；138:2530-2544)。数小时内，心脏中促炎性细胞因子和趋化因子的表达水平增加(baumgarten等人，circulation.2002；105:2192-2197；xia等人,histochem cell biol.2009；131:471-481)，并且在一周内，在压力超负荷的心脏中，大多数主要免疫细胞亚群在尺寸上扩大和/或显示出活化的迹象(xia 2009；liao等人，proc natl acad sci u s a.2018；115:e4661-e4669；patel等人，jacc basic transl sci.2018；3:230-244)。
8.在例如反应性、良性或病理状态的修复或反应过程中，器官或组织中过量纤维结缔组织的形成称为纤维化。纤维化过程中沉积的结缔组织会干扰或抑制下层器官或组织的正常结构和功能。
9.肥大是指器官或组织的体积由于其组成细胞的增大而增加。
10.治疗肥大和纤维化的手段和方法及治疗心力衰竭的手段和方法仍被需要。


技术实现要素：

11.本发明在第一方面提供了髓源性生长因子(mydgf)或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体，用于治疗或预防纤维化或肥大。
12.根据一个实施方案，mydgf蛋白或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体用于治疗或预防心力衰竭。根据优选的实施方案，心力衰竭是慢性心力衰竭。根据进一步的实施方案，心力衰竭或慢性心力衰竭是射血分数保留的心力衰竭(hfpef)、射血分数降低的心力衰竭(hfref)或射血分数中等的心力衰竭(hfmref)。
13.根据优选的实施方案，mydgf蛋白包含seq id no:1。或者，mydgf蛋白包含表现出mydgf的生物学功能的seq id no:1的片段或变体，其中变体包含与seq id no:1具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
14.根据一个优选的实施方案，纤维化是心脏、肾脏、肺和/或肝脏的纤维化。根据一个实施方案，纤维化是间质性肺病，优选地是进行性纤维化间质性肺病，更优选地是特发性肺纤维化。
15.根据一个优选的实施方案，肥大是心肌细胞肥大。
16.根据另一方面，本发明提供了编码生长因子蛋白mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体的核酸，用于治疗或预防纤维化或肥大。
17.根据另一方面，本发明提供了编码生长因子蛋白mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体的核酸，用于治疗心力衰竭。
18.根据一个实施方案，核酸编码与seq id no:1具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
19.根据另一方面，本发明提供了载体，其包含本发明的核酸，用于治疗或预防纤维化或肥大。
20.根据另一方面，本发明提供了载体，其包含本发明的核酸，用于治疗心力衰竭。
21.根据另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的核酸或本发明的载体，用于治疗或预防纤维化或肥大。优选地，宿主细胞表达核酸。
22.根据另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的mydgf蛋白、核酸、载体或宿主细胞以及任选地合适的药物赋形剂，用于治疗或预防纤维化或肥大。
23.根据另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的mydgf蛋白、核酸、载体或宿主细胞以及任选地合适的药物赋形剂，用于改善心脏功能。
24.根据优选的实施方案，所用的药物组合物是通过口服、静脉内、皮下、黏膜内、动脉内、肌内或冠状动脉内途径施用。优选通过一次或多于一次弹丸式注射和/或输液施用的。
25.根据另一方面，本发明提供了治疗纤维化的方法。该方法包括给有需要的患者施用治疗有效量的mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体。
26.根据一个实施方案，mydgf包含seq id no:1或表现出mydgf生物学功能的seq id no:1的片段或变体。该变体包含与seq id no:1具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
27.根据一个实施方案，纤维化是心脏、肾脏、肺和/或肝脏的纤维化。
28.根据另一个实施方案，mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体优选在药学上可接受的载剂中通过一次或多于一次弹丸式注射和/或输液施用。
29.根据另一方面，本发明提供了治疗肥大的方法。该方法包括给有需要的患者施用治疗有效量的mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体。
30.根据一个实施方案，mydgf包含seq id no:1或表现出mydgf的生物学功能的seq id no:1的片段或变体。该变体包含与seq id no:1具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
31.根据一个优选的实施方案，肥大是心肌细胞肥大。
32.根据另一个实施方案，mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体是通过一次或多于一次弹丸式注射和/或输液施用的，优选在药学上可接受的载剂中施用的。
33.根据另一方面，本发明提供了治疗或预防心力衰竭的方法，包括给有需要的患者施用治疗有效量的生长因子mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体。根据一个优选的实施方案，心力衰竭是慢性心力衰竭。根据进一步优选的实施方案，心力衰竭或慢性心力衰竭是hfpef或hfref，优选地其中hfpef是c期或d期hfpef，或其中hfref是c期或d期hfref。
34.根据一个实施方案，mydgf包含seq id no:1或表现出mydgf生物学功能的seq id no:1的片段或变体。该变体包含与seq id no:1具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
35.根据另一个实施方案，mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体优选在药学上可接受的载剂中通过一次或多于一次弹丸式注射和/或输液施用。
附图说明
36.图1：髓源性生长因子抑制转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的来自特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞中的smad磷酸化。在存在或不存在tgfβ1和/或mydgf的情况下培养的来自特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞中的smad2(ser465/467)和smad3(ser423/425)磷酸化(归一化为α-微管蛋白表达)。
37.图2：髓源性生长因子抑制转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的来自终末期心力衰竭患者的左心室成纤维细胞中的smad磷酸化。在存在或不存在tgfβ1和/或mydgf的情况下培养的来自终末期心力衰竭患者的左心室成纤维细胞中的smad2(ser465/467)和smad3(ser423/425)磷酸化(归一化为未磷酸化的smad2/3的表达)。
38.图3：髓源性生长因子抑制转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的来自终末期心力衰竭患者的左心室成纤维细胞中的smad磷酸化。在存在或不存在tgfβ1和/或mydgf的情况下培养的来自终末期心力衰竭患者的左心室成纤维细胞中的smad2(ser465/467)和smad3(ser423/425)磷酸化(归一化为未磷酸化的smad2/3的表达)。
39.图4：小鼠髓源性生长因子抑制转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的小鼠胚胎成纤维细胞中的smad磷酸化。
40.图5：mydgf减轻压力超负荷时的左心室(lv)重构。(a)对mydgf野生型(wt)和敲除(ko)小鼠进行横向主动脉缩窄(tac)或假手术(第7天)。左心室质量与胫骨长度之比。示例性纵向组织切片(第7天，比例尺，1mm)和来自每组6只至15只小鼠的汇总数据。与相同基因型的假手术组的比较
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p《0.001(采用dunnett事后检验的单因素方差分析)；
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p《0.05，
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p《0.01(2个独立样品t检验)。(b)左心室心肌细胞横截面积。用麦胚凝集素染色的示例性组织切片(wga；比例尺，50μm)和每组3只至7只小鼠的汇总数据。与相同基因型的假手术组的比较
*
p《0.05，
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p《0.001(采用dunnett事后检验的单因素方差分析)；
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p《0.05，
###
p《0.001(2个独立样品t检验)。(c)分离的心室心肌细胞的尺寸。示例性相差显微图像(第7天；比例尺：100μm)和每组3只至8只小鼠的汇总数据。与相同基因型假手术组的比较
***
p《0.001(统计测试)；#p《0.05(统计测试)。(d)假手术或tac手术后7天的示例性左心室压力-容量环。
41.图6：骨髓来源的mydgf减轻左心室(lv)重构。(a至e)来自mydgf野生型(wt)或敲除(ko)小鼠的骨髓细胞(bmc)被移植到(
→
)ko或wt受体中。骨髓重建后，小鼠接受横向主动脉缩窄(tac)手术，并追踪14天。
*
p《0.05，
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p《0.01(2个独立样品t检验)。(a)左心室质量与胫骨长度之比。每组7只至18只小鼠。(b)左心室心肌细胞横截面积。每组4只至5只小鼠。(c)左心室同工凝集素b4(ib4)
+
内皮细胞密度。每组4只至6只小鼠。(d)由超声心动图确定的左心室舒张末期面积(lveda)和左心室收缩末期面积(lvesa)。每组5只至10只小鼠。lveda:p《0.05,wt
→
ko与ko
→
ko相比。lvesa:p《0.01,wt
→
ko与ko
→
ko相比(两个独立样品t检验)。(e)面积变化分数(fac)。与(d)中的动物相同。圆圈代表单个的老鼠。水平条是平均值。*p＜0.05，**p＜0.01。(f)在(g至n)中使用的实验方法，通过慢病毒基因转导在炎症细胞中过量表达mydgf(hsc表示造血干细胞)。(g)(四个的)示例性免疫印迹，显示在来自wt受体的骨髓和脾细胞中mydgf和α-微管蛋白的表达，该小鼠在移植慢病毒转导的bmc6周后，接着用多西环素处理或不处理1周。(h)在移植慢病毒转导的bmc 6周后，接着进行多西环素处理或不处理1周，wt受体中的mydgf血浆水平。(i至m)所有动物均接受多西环素处理。(i)示例性免疫印迹显示在移植慢病毒转导的bmc 6周后，接着进行多西环素处理或不处理1周，wt受体中
左心室mydgf和gapdh的表达。(j至l和n)
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p《0.05,
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p《0.01,
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p《0.001与相同的慢病毒假手术组的比较；
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p《0.01,
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p《0.001(采用tukey事后检验的双因素方差分析)。(j)左心室质量与胫骨长度之比。每组6只小鼠。(k)左心室心肌细胞横截面积。每组5只小鼠。(l)ib4
+
内皮细胞密度。每组6只至7只小鼠。(m)lveda和lvesa。每组6只至8只小鼠。lveda和lvesa:p《0.001,lenti.对照组tac与lenti.对照组假手术组的比较。lveda:p《0.05,tac lenti.mydgf组与tac lenti.对照组的比较。lvesa:p《0.01,tac lenti.mydgf组与tac lenti.对照组的比较。(n)fac。与(m)中的动物相同。
42.图7：心肌细胞肥大。新生大鼠心室心肌细胞用内皮素1(et1，100nmol/l)、血管紧张素ii(ang ii，100nmol/l)、胰岛素样生长因子(igf，50ng/ml)和/或mydgf(100ng/ml，除非另有说明)刺激24小时。(a)示例性免疫荧光显微图像。比例尺：50mm。4次至6次实验的汇总数据。(b)剂量反应曲线。来自4个实验的数据。通过4参数逻辑回归计算半最大抑制浓度(ic50)。对照组表示未刺激细胞的尺寸。(c)蛋白质含量。来自3个实验的数据。(d)通过rt-qpcr确定的myh7(β肌球蛋白重链)、nppa(利尿钠肽a型)和gapdh mrna表达水平。来自7个至13个实验的数据。
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p《0.05,
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p《0.001与未刺激对照组的比较；
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p《0.05,
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p《0.01,
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p《0.001(采用tukey事后检验的单因素方差分析)。
43.图8：磷酸化蛋白质组分析确定pim1是mydgf的信号靶点。(a至d)用内皮素1(et1，100nmol/l)和/或mydgf(100ng/ml)刺激8小时的新生大鼠心室心肌细胞(nrcm)的磷酸化蛋白质组分析。(a)说明从磷酸化蛋白质组数据和激酶底物相互作用的现有知识推断激酶活性的自下而上方法的流程图。(b)磷酸化蛋白质组数据集的主成分分析(每个条件4个生物学重复)。(c)说明磷酸蛋白质组变化的直方图。红条代表所有受et1显著调节的磷酸化位点与未受刺激的对照组相比(n＝120，p《0.05，log2倍数变化大于1)。蓝条描述了在et1加mydgf与仅et1刺激的细胞相比的这些位点的调节。(d)基于底物推断的et1加mydgf与仅et1刺激的细胞相比的激酶活性。(e)用et1和/或mydgf刺激16小时的nrcm中的pim1蛋白表达和(f)激酶活性。6个实验。
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p《0.05,
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p《0.01,
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p《0.001(2个独立样品t检验)。(g)用et1、mydgf和/或smi4a(10μmol/l)刺激24小时后的nrcm尺寸。3个实验。
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p《0.05与对照组的比较,
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p《0.05(采用tukey事后检验的单因素方差分析)。(h)用scrambled(scr)或pim1小干扰(si)rna转染并用et1和/或mydgf刺激24小时后的nrcm尺寸。示例性免疫印迹描述了sirna转染后pim1和β-肌动蛋白的表达。4个实验。
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p《0.001与对照组的比较,
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p《0.01(采用tukey事后检验的单因素方差分析)。
44.图9：mydgf通过pim1增强serca2a表达。(a)显示用mydgf(100ng/ml)刺激的新生大鼠心室心肌细胞(nrcm)中pim1、肌质网/内质网ca
2+
atp酶2a(serca2a)和β-肌动蛋白表达的示例性免疫印迹和汇总数据。4个至5个实验。*p《0.05与基线的比较(采用dunnett事后检验的单因素方差分析)。(b)显示用mydgf和/或smi4a(10mol/l)刺激16小时的nrcm中serca2a和β-肌动蛋白表达的(三个的)示例性免疫印迹。在指示处，首先用scrambled(scr)或pim1小干扰(si)rna转染细胞。(c)示例性免疫印迹和汇总数据，显示了接受假手术或横向主动脉缩窄(tac)手术的mydgf野生型(wt)和敲除型(ko)小鼠中左心室(lv)serca2a和黏着斑蛋白的表达。每组9只小鼠。
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p《0.001与相同基因型假手术组的比较(采用dunnett事后检验的单因素方差分析)；
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p《0.05(2个独立样品t检验)。(d)显示假手术或tac手术后7天从wt和ko小鼠分离的心肌细胞中serca2a、pim1和α-微管蛋白表达的示例性免疫印迹和汇总数据。
每组5只至6只小鼠。
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p《0.05,
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p《0.001与相同基因型假手术组的比较；
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p《0.05,
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p《0.01(采用tukey事后检验的双因素方差分析)。(e)将来自wt或ko小鼠的骨髓细胞移植到(
→
)致死性辐射的ko或wt受体中。骨髓重建后，小鼠接受tac手术，并追踪14天。显示左心室serca2a、pim1和α-微管蛋白表达的示例性免疫印迹和汇总数据。每组8只小鼠。
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p《0.05(2个独立样品t检验)。(f)显示tac后7天左心室serca2a、pim1和β-肌动蛋白表达的示例性免疫印迹和汇总数据。小鼠被移植了lenti.对照组或lenti.mydgf转导组的骨髓细胞，并在手术前1周开始用多西环素处理。
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p《0.001(2个独立样品t检验)。
45.图10：mydgf蛋白疗法。(a)治疗方案。在横向主动脉缩窄(tac)手术后，小鼠接受重组mydgf(10μg)的左心室(lv)腔内弹丸注射，然后皮下输注3天(b)、7天(c)或42天(d至i)(10μg/天)。tac手术的对照小鼠仅用稀释剂处理(弹丸注射和输液)。(b)mydgf血浆水平。每组5只至7只小鼠。***p《0.001(检验)。(c)显示左心室肌质网/内质网ca
2+-atp酶2a(serca2a)和α-微管蛋白表达的示例性免疫印迹和汇总数据。每组5只至7只小鼠。
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p《0.05(2个独立样品t检验)。(d)在tac后7天和42天(每组16只至22只小鼠)或假手术后7天(9只小鼠)通过系列超声心动图确定的左心室舒张末期面积(lveda)和左心室收缩末期面积(lvesa)。lveda:p《0.01,在第28天tac(对照组和mydgf组)与假手术组的比较。lvesa:p《0.01,在第7天和第28天tac(对照组和mydgf组)与假手术组的比较(采用dunnett事后检验的单因素方差分析)。lveda:p《0.01，在第28天mydgf组与对照组的比较；lvesa:p《0.001在第28天mydgf组与对照组的比较(两个独立的样品t检验)。(e)面积变化分数(fac)。与(c)中的动物相同。
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p《0.001与所有tac组的比较(采用dunnett事后检验的单因素方差分析)；
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p《0.01,
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p《0.001ko组与wt组的比较(2个独立的样品检验)。(f)28天时左心室质量与胫骨长度的比。每组6只至12只小鼠。(g)28天时的左心室心肌细胞横截面积。每组6只小鼠。(h)28天时左心室中的异凝集素b4(ib4)
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内皮细胞密度。每组6只小鼠。(e至g)
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p《0.05,
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p《0.01，
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p《0.001与假手术组的比较(采用dunnett事后检验的单因素方差分析)；
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p《0.05，
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p《0.001(2个独立样品t检验)。(i)27只对照组小鼠和17只mydgf处理组小鼠tac后的累积存活率。
*
p＝0.05(对数秩检验)。
具体实施方式
46.在下面详细描述本发明之前，应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
47.定义
48.优选地，本文使用的术语按照"a multilingual glossary of biotechnological terms:(iup ac recommendations)"中描述的被定义，h.g.w.leuenberger、b.nagel和h.编辑，瑞士化学学报，ch-4010巴塞尔，瑞士(1995年)。
49.为了实施本发明，除非另有说明，否则使用化学、生物化学、细胞生物学和重组dna技术的常规方法，这些方法在本领域的文献中有所解释(参见，例如，molecular cloning:a laboratory manual,第二版,j.sambrook等人编辑,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor 1989)。此外，采用了临床心脏病学的常规方法，这些方法在本
领域的文献中也有解释(参见，例如，braunwald’s heart disease.a textbook of cardiovascular medicine，第9版，p.libby等人编辑，saunders elsevier philadelphia，2011)。
50.在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文需要否则单词“包含”将被理解为意味着收录所陈述的整数或步骤或整数或步骤组但不排除任意其他整数或步骤或整数或步骤组。如本说明书和所附权利要求书中所使用的，要素前无数量词包括复数指代，除非内容另有明确说明。
51.核酸分子被理解为由核苷酸单体制成的聚合大分子。核苷酸单体由核碱基、五碳糖(例如但不限于核糖或2'-脱氧核糖)和一个至三个磷酸基团组成。通常，多核苷酸通过各个核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成。在本发明背景下，所指的核酸分子包括但不限于核糖核酸(rna)和脱氧核糖核酸(dna)。术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。
52.术语“开放阅读框”(orf)是指可以翻译成氨基酸的核苷酸序列。通常，这样的orf在给定的阅读框中包含起始密码子、长度通常是3个核苷酸的倍数的后续区域，但不包含终止密码子(tag、taa、tga、uag、uaa或uga)。通常，orf天然存在或是人工构建的，即通过基因技术手段构建。orf编码蛋白质，其中翻译成的氨基酸形成肽连接的链。
53.无论长度或翻译后修饰如何，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，其是指任意肽键连接的氨基酸链。可用于本发明的蛋白质(包括蛋白质衍生物、蛋白质变体、蛋白质片段、蛋白质段、蛋白质表位和蛋白质结构域)还可以通过化学修饰被修饰。这意味着这种化学修饰的多肽包含除了20种天然存在的氨基酸之外的其他化学基团。这种其他化学基团的实例包括但不限于糖基化氨基酸和磷酸化氨基酸。与亲本多肽相比，多肽的化学修饰可提供有利的性质，例如增强的稳定性、增加的生物半衰期或增加的水溶性中的一种或多于一种。适用于本发明的变体的适用的化学修饰包括但不限于：聚乙二醇化、非糖基化亲代多肽的糖基化、与治疗性小分子如包括艾塞那肽、阿必鲁肽、他司鲁肽、dpp4抑制剂、肠促胰岛素和利拉鲁肽的胰高血糖素样肽1激动剂的共价偶联，或亲本多肽中存在的糖基化模式的修饰。适用于本发明的适用的变体的这种化学修饰可以发生在翻译时或翻译后。
54.术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸以及氨基酸衍生物。在本发明背景下，疏水性非芳香族氨基酸优选为kyte-doolittle亲水指数高于0.5，更优选高于1.0，甚至更优选高于1.5并且不是芳香族的任意氨基酸。优选地，在本发明背景下，疏水性非芳香族氨基酸选自氨基酸丙氨酸(kyte doolittle亲水指数1.8)、蛋氨酸(kyte doolittle亲水指数1.9)、异亮氨酸(kyte doolittle亲水指数4.5)、亮氨酸(kyte doolittle亲水指数3.8)和缬氨酸(kyte doolittle亲水指数4.2)，或其具有如上定义的kyte doolittle亲水指数的衍生物。
55.术语“变体”在本文中用于指与通过氨基酸序列中的一个或多于一个改变而衍生该“变体”的多肽或其片段相比不同的多肽。衍生蛋白质变体的多肽也称为亲本多肽。同样，衍生蛋白质片段变体的片段称为亲本片段。通常，变体是人工构建的，优选通过基因技术手段。通常，亲本多肽是野生型蛋白质或野生型蛋白质结构域。此外，可用于本发明的变体还可以衍生自亲本多肽的同源物、直系同源物或旁系同源物，或衍生自人工构建的变体，条件是该变体表现出亲本多肽的至少一种生物活性。氨基酸序列的变化可以是氨基酸交换、插入、缺失、n-末端截短或c-末端截短、或这些变化的任意组合并且可以在一个或几个位点发
生。在优选的实施方案中，可用于本发明的变体在氨基酸序列中表现出总数高达23个(高达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个)的改变(即交换、插入、缺失、n末端截短和/或c末端截短)。氨基酸置换可以是保守的、和/或半保守的、和/或非保守的。在优选的实施方案中，可用于本发明的变体与衍生它的蛋白质或结构域有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个氨基酸交换的区别，优选保守氨基酸改变。
56.典型的置换发生在脂肪族氨基酸中、具有脂肪族羟基侧链的氨基酸中、具有酸性残基的氨基酸中、酰胺衍生物中、具有碱性残基的氨基酸或具有芳香族残基的氨基酸中。典型的半保守和保守置换是：
[0057][0057][0058]
如果新的半胱氨酸保持为游离巯基，则从a、f、h、i、l、m、p、v、w或y变为c是半保守的。此外，技术人员应该会知道在空间要求高的位置上的甘氨酸不应该被取代，并且p不应该被引入到具有α-螺旋或β-折叠结构的蛋白质部分中。
[0059]
替代地或另外地，如本文所用的“变体”可以通过与衍生其的亲本多肽或亲本多核苷酸的一定程度的序列同一性来表征。更确切地说，本发明背景下的蛋白质变体表现出与其亲本多肽具有至少85％的序列同一性。优选地，所讨论的多肽和参考多肽在20个、30个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或多于100个氨基酸的连续序列上或在参考多肽的全长上表现出所示的序列同一性。优选地，所讨论的多核苷酸和参考多核苷酸在60
个、90个、120个、135个、150个、180个、210个、240个、270个、300个或多于300个核苷酸的连续片段上或在参考多肽的全长上表现出所示的序列同一性。
[0060]
术语“至少85％的序列同一性”在整个说明书中用于多肽和多核苷酸序列的比较。该表述优选指针对相应参考多肽或相应参考多核苷酸具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
[0061]
蛋白质片段包含氨基酸的缺失，其可以是n-末端截短、c-末端截短或内部缺失或这些的任意组合。在本技术背景下，包含n-末端截短、c-末端截短和/或内部缺失的这种变体被称为“片段”。片段可以是天然存在的(例如剪接变体)或也可以是人工构建的，优选通过基因技术手段。优选地，与亲本多肽相比，片段(或缺失变体)在其n-末端和/或其c-末端和/或内部缺失多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个氨基酸，优选在n-末端、n-和c-末端、或c-末端。
[0062]
在比较两个序列并且未指定与待计算序列比较同一性百分比的参考序列的情况下，如果没有特别指出，则参考两个待比较序列中较长的序列来计算序列同一性。
[0063]
核苷酸和氨基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比，可以通过序列比对来确定。这种比对可以用几种本领域已知的算法进行，优选用karlin和altschul的数学算法(karlin&altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa.90:5873-5877)，用hmmalign(hmmer package,http://hmmer.wustl.edu/)或用clustal算法(thompson,j.d.,higgins,d.g.&gibson,t.j.(1994),nucleic acids res,22,4673-80)或clustalw2算法(larkin ma,blackshields g,brown np,chenna r,mcgettigan pa,mcwilliam h,valentin f,wallace im,wilm a,lopez r,thompson jd,gibson tj,higgins dg.(2007),clustal w and clustal x version 2.0.bioinformatics,23,2947-2948.)，可在http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/npsa/npsa_clustalw.html或http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html上获得。优选地，使用http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html上的clustalw2算法，其中所使用的参数是在http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html上设置的默认参数：比对类型＝慢速、蛋白质权重矩阵＝gonnet、间隙开放＝10、间隙延伸＝0，1对于慢速成对比对选项以及蛋白质权重矩阵＝gonnet、间隙开放＝10、间隙延伸＝0，20、间隙距离＝5、无末端间隙＝无、输出选项：格式＝aln w/numbers、顺序＝已比对。
[0064]
序列同一性的等级(序列匹配)可以使用例如blast、blat或blastz(或blastx)来计算。altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-410的blastn和blastp程序中包含了类似的算法。blast蛋白质搜索使用blastp程序进行，可获得自例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastp&blast_programs＝blastp&page_type＝blastsearch&show_defaults＝on&link_loc＝blasthome。所用的优选算法参数是在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastp&blast_programs＝blastp&page_type＝blastsearch&show_defaults＝on&link_loc＝blasthome设置的默认参数：期望阈值＝10、字号＝3、查询范围内的最大匹配数＝0、矩阵＝blosum62、间隙成本＝存在:11延伸:1、组成调整＝条件组成分数矩阵调整与非冗余蛋白质序列(nr)数据库一起
获得与因子1和因子2多肽同源的氨基酸序列。
[0065]
为了获得用于比较目的的间隙比对，如altschul等人(1997)nucleic acids res.25:3389-3402中所述使用gapped blast。当使用blast和gapped blast程序时，使用各自程序的默认参数。序列匹配分析可以通过已建立的同源性映射技术来补充，如shuffle-lagan(brudno m，bioinformatics 2003b，19suppl 1:i54-i62)或马尔可夫随机场。当在本技术中提到序列同一性的百分比时，如果没有特别指出，这些百分比是相对于较长序列的全长计算的。
[0066]
本文使用的术语“宿主细胞”是指含有本发明核酸的细胞(例如，以质粒或病毒的形式)。这样的宿主细胞可以是原核细胞(例如细菌细胞)或真核细胞(例如真菌、植物或动物细胞)。细胞可以是转化的或非转化的。细胞可以是例如细胞培养物或组织的一部分的分离细胞，其本身可以是分离的或更复杂的组织结构如器官或个体的一部分。
[0067]
术语“髓源性生长因子”、“mydgf”、“因子1”、“mydgf多肽或蛋白质”或“因子1多肽或蛋白质”可互换使用，指ncbi参考序列nm_019107.3(人类同源物)中所示的蛋白质及其哺乳动物同源物，特别是来自小鼠或大鼠的蛋白质。人类同源物的氨基酸序列在人类染色体19(c19orf10)上的开放阅读框10中编码。优选地，mydgf和因子1蛋白是指蛋白，其包含、基本组成或组成为具有根据seq id no:1的氨基酸序列的人因子1的核心片段。
[0068]
蛋白质、变体或片段是否表现出mydgf的生物学功能可以通过以下实施方案中描述的任意一种试验来确定。根据本发明，如果用这种肽或蛋白质获得的结果与用在本文下面给出的至少一个实施方案中示出的本发明的mydgf蛋白质获得的结果相比，实现了指定对照组中所报道的mydgf的效果的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％，则该肽或蛋白质显示出mydgf的生物学功能。
[0069]
如本文所用，术语“mydgf”和“mydgf”都表示髓源性生长因子，其中“mydgf”在本发明中用于指人变体，而“mydgf”用于指髓源性生长因子的小鼠变体。
[0070]
本文所用术语“改善心脏功能”是指例如改善心脏收缩和/或舒张功能，其可以通过例如超声心动图、心脏磁共振成像、心脏计算机体层成像或心室血管造影术来评估。例如，左心室尺寸和心脏收缩功能的增加表明心脏功能的改善，并且可以按照例如下面的实施例10所示进行测量。
[0071]
术语“纤维化”描述了作为修复或反应过程的纤维组织的形成，而不是作为器官或组织的正常成分的纤维组织的形成。它具有例如在farlex partner medical dictionary、american heritage medical dictionary或pschyrembel klinisches,第261版,2007中定义的相同含义。
[0072]
术语“肥大”描述了由于其组成细胞的增大而导致的器官或组织体积的异常高增长。与过度增殖相反，肥大的特征是组织或器官的体积增加，这完全是由现有细胞的增大产生的，而不是由快速分裂引起的细胞的高速增殖产生的。本文使用的术语“肥大”与例如在farlex partner medical dictionary、american heritage medical dictionary或pschyrembel klinisches，第261版,2007中定义的含义相同。可以通过将例如患有肥大的细胞或组织的表面积、横截面积或尺寸与未患有肥大的对照组细胞或组织的表面积、横截面积或尺寸进行比较，或者通过将患病细胞的蛋白质含量与对照组进行比较，来评估或测量肥大。根据本发明治疗的肥大优选为病理性肥大，例如由et1和/或ang ii引起
的肥大，已知et1和/或ang ii会促进病理性心脏肥大。
[0073]
术语“间质性肺病”或“ild”应理解为如lederer等人,new england journal of medicine,2018,vol.378(19):1811-1823或van cleemput j等人,idiopathic pulmonary fibrosis for cardiologists:differential diagnosis,cardiovascular comorbidities,and patient management；adv ther.2019feb；36(2):298-317中描述的。
[0074]
本文使用的术语“心力衰竭”以及“治疗和/或预防心力衰竭”的上下文中应理解为在2016 esc guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure(european heart journal,2016；vol.37(27):2129-2200)中定义的，且包括慢性心力衰竭、射血分数保留的心力衰竭(hfpef)、射血分数降低的心力衰竭(hfref)、射血分数中等的心力衰竭(hfmref)。在本发明的上下文中，该术语还旨在指hfpef或hfref，特别是指c期或d期hfpef和c期或d期hfref，如2017acc/ahh/hfsa focused update of the 2013accf/aha guideline for the management of heart failure(journal of american college of cardiology,2017；vol.70(6):776-803)中所描述的。实施方案的描述还包括整个申请中使用的术语的定义和解释。除非另有说明，否则这些描述和定义对整个申请都有效。
[0075]
序列
[0076]
下面列出了本发明中使用的序列。
[0077]
seq id no:1(人因子1的氨基酸序列，缺少31个氨基酸的n-末端信号肽)：
[0078][0079]
seq id no:2(因子1的小鼠同源物的氨基酸序列，缺少24个氨基酸的n-末端信号肽)：
[0080][0081]
seq id no:3(人因子1的氨基酸序列，包括n-末端信号肽(以粗体和下划线显示)；uniprotkb-q969h8)：
[0082][0083]
seq id no:4(因子1的小鼠同源物的氨基酸序列，包括n-末端信号肽(以粗体和下划线显示)；uniprotkb-q9cpt4)：
[0084][0085]
seq id no:5显示了编码seq id no:3的mydgf的人因子1的核酸序列(ncbi基因id:56005)。
[0086]
seq id no:6显示了编码seq id no:4的mydgf的小鼠因子1的核酸序列(ncbi基因id:28106)。
[0087]
实施方案
[0088]
在下文中，将描述本发明的元素。这些元素与特定实施方案一起列出，但应该理解的是，它们可以以任意方式和任意数量组合以创建额外的实施方案。各种描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选元素相结合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本技术的描述中公开了本技术中所有所描述元素的任意排列和组合。
[0089]
本发明人首次显示了mydgf的抗纤维化和抗肥大作用。本发明人特别表明，在小鼠模型中施用mydgf抑制了肥大和纤维化。这些效果尤其可用于改善心脏功能。因此，在第一个方面，本发明提供了用于治疗或预防纤维化或肥大的蛋白髓源性生长因子(mydgf)或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体。
[0090]
因此，在第二个方面，本发明提供了用于治疗或预防心力衰竭的蛋白髓源性生长因子(mydgf)或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体。根据一个优选的实施方案，心力衰竭是慢性心力衰竭或急性心力衰竭，其中急性心力衰竭不包括心肌梗死。根据一个优选的实施方案，急性心力衰竭是急性压力超负荷诱发的心力衰竭。还提供了用于该用途的mydgf或其片段或变体，其中心力衰竭或慢性心力衰竭是射血分数保留的心力衰竭(hfpef)、射血分数降低的心力衰竭(hfref)、射血分数中等的心力衰竭(hfmref)。不希望受任意理论的束缚，减弱与心力衰竭相关的纤维化和/或肥大和/或通过改善心脏功能，治疗或预防心力衰竭。
[0091]
在本发明的特别优选的实施方案中，蛋白质包含氨基酸序列seq id no:1或其片段。优选地，该蛋白质与seq id no:1具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
[0092]
在本发明这方面的一个优选实施方案中，蛋白质包含氨基酸序列seq id no:1，其显示mydgf生物学功能的与seq id no:1具有至少85％的序列同一性的片段或变体。本领域技术人员能够在没有过度负担的情况下决定亲本多肽中的哪些位置可以突变到何种程度，以及哪些位置必须保持以保持多肽的功能性。这种信息可以从例如同源序列中获得，同源序列可以通过本领域众所周知的生物信息学方法进行鉴定、比对和分析。wo 2014/111458的实施方案7和图6和图7中示例性地描述了这种分析。优选在蛋白质的在物种之间，优选在哺乳动物之间不完全保守的这些区域中引入突变。在本发明的一个特别优选的实施方案中，mydgf蛋白包含、基本组成或组成为氨基酸序列seq id no:1或其显示mydgf生物学功能
的片段或变体。优选地，蛋白质与seq id no:1具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
[0093]
n-末端缺失变体也包括在内，其可以例如从氨基酸位置1至24(基于seq id no:1)，即从n-末端保守区缺失一个或多于一个氨基酸。
[0094]
也包括c-末端缺失变体，其可以例如从氨基酸位置114至142缺少一个或多于一个氨基酸(基于seq id no:1)。
[0095]
另一方面，氨基酸可以添加到mydgf蛋白中。这种添加包括在氨基酸序列内的n-末端、c-末端或其组合的添加。因此，本发明第一方面的蛋白质还可包含额外的氨基酸序列，例如用于稳定或纯化所得蛋白质。这种氨基酸的实例有6xhis-标签、myc-标签或flag-标签，它们是本领域众所周知的，并且可以存在于蛋白质中的任意位置，优选在n-末端或c-末端。特别优选的附加序列是6xhis-标签。优选地，所述6xhis-标签存在于mydgf蛋白的c末端。根据所用的表达系统和额外的氨基酸(如果存在的话，如上述标签)，一个或多于一个残留氨基酸可以保留在蛋白质的n-末端和/或c-末端。需要强调的是，在根据本发明的mydgf蛋白和mydgf蛋白中，可能存在这样的人工产物，例如在ebenhoch r等人,nat commun.2019nov 26；10(1):5379和polten f等人,anal chem.2019jan 15；91(2):1302-1308中所展示的。
[0096]
一些情况下，在本发明第一方面的mydgf蛋白内优选突变蛋白酶切割位点，以稳定该蛋白(参见segers等人，circulation 2007,2011)。技术人员知道如何确定蛋白质中潜在的蛋白水解切割位点。例如，可以将蛋白质序列提交给提供这种分析的网站，例如http://web.expasy.org/peptide_cutter/或http://pmap.burnham.org/proteases。如果将根据seq id no:1的蛋白质序列提交给http://web.expasy.org/peptide_cutter/，将确定以下具有较低频率(小于10)的切割位点：
[0097]
表1
[0098][0099]
可以改变这些位点以去除相应地鉴定的蛋白酶中的识别/切割序列，从而增加蛋白质的血清半衰期。
[0100]
本发明显示mydgf以抑制或预防纤维化，特别是心脏纤维化。因此，本发明提供了用于治疗或预防纤维化的mydgf蛋白或其表现出mydgf的生物学功能的片段或变体。
[0101]
在本发明背景下，治疗或预防纤维化是指例如减少纤维化组织的量，或者预防或减少纤维化组织的形成。与未用活性药物处理的对照组织相比，减少优选为减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0102]
不希望受任意理论的束缚，mydgf抑制转化生长因子β，从而预防和/或治疗纤维化，转化生长因子是一种普遍的促纤维化生长因子。
[0103]
在本发明中还显示mydgf可以抑制或预防肥大，特别是心肌细胞肥大。因此，本发明提供了用于治疗或预防肥大的mydgf蛋白或其表现出mydgf的生物学功能的片段或变体。如果治疗或预防心肌细胞肥大，心肌细胞优选为左心室或右心室的心肌细胞或心房的心肌细胞。
[0104]
治疗和/或预防心脏组织和/或细胞如心肌细胞的肥大和纤维化也可用于改善心脏功能。因此，本发明还提供mydgf用于改善心脏功能。本发明意义上的心脏功能涉及心脏收缩和/或心脏舒张功能，其可以通过例如超声心动图、心脏磁共振成像、心脏计算机体层成像或心室血管造影术来评估。用于评估心脏功能的优选方法是高分辨率经胸2d超声心动图(例如，描述于例如lang等人,eur heart j cardiovasc imaging,2015；16:233-270中)，例如在小鼠中使用线性30mhz换能器(vevo 3100，visualsonics)。在这样实验中，从长轴视图确定左心室(lv)舒张末期面积(lveda)和左心室收缩末期面积(lvesa)。lveda(mm2)是左心室舒张末期容积的二维近似值；lvesa(mm2)是左心室收缩末期容积的二维近似值。然后计算面积变化分数(fac)作为收缩功能的量度，即心脏的泵送或收缩功能[(lveda
–
lvesa)/lveda]x100。因此，改善心脏功能意味着，通过例如fac的评估测量，与用本发明的mydgf治疗前同一心脏的心脏功能相比，心脏收缩和/或心脏舒张功能改善至少10％或多于10％，例如15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％，例如110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或超过200％。
[0105]
mydgf蛋白还可包含额外的氨基酸序列，例如用于稳定或纯化所得蛋白。例如，在mydgf蛋白中优选突变蛋白酶切割位点以稳定该蛋白。如上所述，可以鉴定合适的蛋白水解切割位点。
[0106]
mydgf蛋白或包含该蛋白的组合物可以体内、离体或体外施用，优选体内施用。
[0107]
纤维化或肥大的细胞或组织优选属于或衍生于个体身体的特定系统，所述系统选自消化、内分泌、排泄、免疫、外皮、肌肉、神经、生殖、呼吸和骨骼系统或其组合。或者，纤维化或肥大的细胞或组织优选属于或衍生于个体身体的特定部分或器官，所述特定部分或器官选自：皮肤、骨、心脏、软骨、血管、食道、胃、肠、腺体、肝、肾、肺、脑和脾。在一个特别优选的实施方案中，细胞或组织属于或衍生于心脏。
[0108]
纤维化或肥大的细胞或组织可以是受损或患病的细胞或组织。优选地，所述损伤或疾病是由基因的/遗传性疾病或获得性疾病引起的，所述获得性疾病由例如缺血、再灌注损伤、炎症、感染、创伤、机械超负荷、中毒或手术引起。在一个特别优选的实施方案中，损伤是由梗塞引起的，特别是心肌梗塞。在另一个特别优选的实施方案中，损伤是由再灌注损伤引起的。
[0109]
在一个特别优选的实施方案中，患有纤维化的细胞或组织选自心脏、肾脏、肺和肝脏细胞或组织，最优选心脏细胞或组织。基于来自ipf患者的细胞的实施方案15至18中所示的结果高度表明了在ild背景下对纤维化的适用性。基于胚胎成纤维细胞的实施例21和22中所示的结果也适用于其他组织，如肾和肝纤维化。
[0110]
在优选的实施方案中，纤维化是间质性肺病(ild)。根据一个优选的实施方案，ild是进行性纤维化间质性肺病，并且更优选为特发性肺纤维化(ipf)。因此，根据一个实施方案，mydgf蛋白或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体用于预防或治疗间质性肺病，如
lederer等人,new england journal of medicine,2018,vol.378(19):1811-1823和van cleemput,j等人，idiopathic pulmonary fibrosis for cardiologists:differential diagnosis,cardiovascular comorbidities,and patient management.adv ther.2019feb；36(2):298-317中所述的。根据其他实施方案，ild是进行性纤维化ild(pf-ild)，并且特别是特发性非特异性间质性肺炎(insip)、不可分类的特发性间质性肺炎(不可分类的iip)、具有自身免疫特征的特发性肺炎(ipaf)、慢性过敏性肺炎(chp)、环境/职业纤维化肺病、系统性硬化间质性肺病(ssc-ild)或类风湿性关节炎间质性肺病(ra-ild)。
[0111]
在一个特别优选的实施方案中，患有肥大的细胞或组织是心脏细胞或组织，更优选为心肌细胞。
[0112]
在另外的方面，本发明提供了编码mydgf蛋白或其表现出如本文所述的mydgf的生物学功能的片段或变体的核酸，用于治疗或预防纤维化或肥大。本发明还提供了编码mydgf蛋白或其表现出如本文所述的mydgf的生物学功能的片段或变体的核酸，用于治疗或预防心力衰竭。根据本发明使用的核酸优选编码与seq id no:1具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[0113]
可以优化核酸序列以增强在宿主细胞中的表达。要考虑的参数包括c:g含量、偏好的密码子和抑制性二级结构的避免。这些因素可以以不同的方式组合，以试图获得在特定宿主中增强表达的核酸序列(参见例如donnelly等人,international publication number wo 97/47358)。特定序列在特定宿主中增强表达的能力涉及一些经验实验。这种实验包括测量预期核酸序列的表达，如果需要，改变该序列。从特定的氨基酸序列和已知的遗传密码简并性开始，可以获得大量不同的编码核酸序列。遗传密码的简并性出现是因为几乎所有的氨基酸都是由核苷酸三联体或“密码子”的不同组合编码的。特定密码子翻译成特定氨基酸是本领域众所周知的(参见，例如，lewin genes iv,p.119,oxford university press,1990)。
[0114]
根据本发明使用的核酸还可以包含被定位以控制蛋白质表达的转录控制元件或表达控制序列。这种核酸与控制元件一起通常被称为表达系统。本文所用的术语“表达系统”是指设计用于产生一种或多于一种目的基因产物的系统。通常，这种系统是“人工”设计的，即通过可用于在体内、体外或离体产生目的基因产物的基因技术手段。术语“表达系统”还包括目的基因产物的表达，包括多核苷酸的转录、mrna剪接、翻译成多肽、多肽或蛋白质的翻译时和翻译后修饰以及蛋白质靶向细胞内的一个或多于一个区室、细胞的分泌和同一细胞或另一细胞的蛋白质摄取。本概述涉及用于真核细胞、组织或生物体的表达系统。原核系统的表达系统可以不同，其中如何构建原核细胞的表达系统是本领域众所周知的。
[0115]
基因表达盒中存在的调节元件通常包括：(a)与编码多肽的核苷酸序列转录偶联的启动子、(b)与核苷酸序列功能性偶联的5’核糖体结合位点、(c)与核苷酸序列3’末端连接的终止子和(d)与核苷酸序列功能性偶联的3’多聚腺苷酸化信号。还存在用于增强或调节基因表达或多肽加工的其他调节元件。启动子是被rna聚合酶识别并介导下游区域转录的遗传元件。优选的启动子是提供增加的转录水平的强启动子。强启动子的实例是极早期人巨细胞病毒启动子(cmv)和带有内含子a的cmv(chapman等人,nucl.acids res.19:3979-3986,1991)。另外的启动子的实例包括天然存在的启动子，如ef1α启动子、鼠cmv启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、和sv40早期/晚期启动子和[β]-肌动蛋白启动子；和人工启动子，如合
成的肌肉特异性启动子和嵌合的肌肉特异性/cmv启动子(li等人,nat.biotechnol.17:241-245,1999,hagstrom等人,blood 95:2536-2542,2000)。
[0116]
核糖体结合位点位于起始密码子处或附近。优选的核糖体结合位点的实例包括ccaccaugg、ccgccaugg和accaugg，其中aug是起始密码子(kozak,cell 44:283-292,1986)。多聚腺苷酸化信号负责切割转录的rna并向rna添加多聚腺苷酸尾。高等真核生物中的多聚腺苷酸化信号包含离多聚腺苷酸化添加位点约11个至30个核苷酸的aauaaa序列。aauaaa序列参与信号传导rna切割(lewin，genes iv，oxford university press，ny，1990)。多聚腺苷酸尾对于mrna的加工、从细胞核输出、翻译和稳定性是重要的。
[0117]
可用作基因表达盒一部分的多聚腺苷酸化信号包括最小兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号和牛生长激素多聚腺苷酸化(bgh)(xu等人,gene 272:149-156,2001,post等人,u.s.patent u.s.5122458)。
[0118]
可能存在的用于增强或调节基因表达或多肽加工的另外的调节元件的实例包括增强子、前导序列和操纵子。增强子区域增加转录。增强子区域的实例包括cmv增强子和sv40增强子(hitt等人,methods in molecular genetics 7:13-30,1995,xu,等人,gene 272:149-156,2001)。增强子区域可以与启动子相关联。
[0119]
根据本发明的mydgf蛋白或其变体的表达可以被调节。这种调节可以在基因表达的许多步骤中完成。可能的调节步骤是，例如但不限于，转录起始、启动子清除、转录延伸、剪接、从细胞核输出、mrna稳定性、翻译起始、翻译效率、翻译延伸和蛋白质折叠。影响细胞内mydgf多肽浓度的其他调节步骤会影响蛋白质的半衰期。这种调节步骤例如是蛋白质的受调节的变性。由于本发明的蛋白包含分泌蛋白，因此该蛋白可被导向宿主细胞的分泌途径。分泌效率与涉及表达和蛋白质稳定性的调节步骤一起调节细胞外相应蛋白质的浓度。细胞外可以指，例如但不限于，培养基、组织、细胞内基质或空间或体液如血液或淋巴。
[0120]
上述调节步骤的控制可以是，例如，细胞类型或组织类型独立的或细胞类型或组织类型特异性的。在本发明的一个特别优选的实施方案中，调节步骤的控制是细胞类型或组织类型特异性的。这种细胞类型或组织类型特异性调节优选通过涉及核酸转录的调节步骤来完成。这种转录调节可以通过使用细胞类型或组织类型特异性启动子序列来完成。这种细胞类型或组织类型特异性调节的结果可以具有不同等级的特异性。这意味着，与其他细胞或组织类型相比，相应多肽在相应细胞或组织中的表达增强，或者表达限于相应细胞或组织类型。细胞或组织类型特异性启动子序列是本领域众所周知的并且可用于多种细胞或组织类型。
[0121]
该表达不一定是细胞类型或组织类型特异性的，但可能取决于生理条件。这种条件例如是炎症或伤口。这种生理条件特异性表达也可以通过在所有上述调节步骤中的调节来实现。调节生理条件特异性表达的优选方式是转录调节。为此，可以使用创伤或炎症特异性启动子。相应的启动子是例如天然存在的序列，其可以例如衍生自在免疫反应和/或创伤组织再生过程中特异性表达的基因。另一种可能性是使用人工启动子序列，其例如通过两种或多于两种种天然存在的序列的组合来构建。
[0122]
该调节可以是细胞类型或组织类型特异性的和生理条件特异性的。特别地，该表达可以是心脏特异性表达。优选地，该表达是心脏特异性的和/或伤口特异性的。
[0123]
根据本发明，调节mydgf蛋白或其变体表达的另一种可能性是基因表达的条件性
调节。为了实现条件调节，可以使用操纵子序列。例如，tet操纵子序列可用于抑制基因表达。通过tet操纵子和tet阻遏物对基因表达的条件性调节是本领域众所周知的，并且已经为多种原核和真核生物建立了许多相应的系统。本领域技术人员知道如何选择合适的系统并使其适应相应应用的特殊需要。
[0124]
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的核酸的用途包括应用于个体，优选患有纤维化或肥大的个体。
[0125]
根据另一方面，本发明提供了包含本文所述核酸或表达系统的载体，用于治疗或预防纤维化或肥大，或用于治疗心力衰竭。
[0126]
本文所用的术语“载体”是指能够被引入或能够将包含在其中的蛋白质和/或核酸引入细胞的蛋白质或多核苷酸或其混合物。在本发明的上下文中，优选的是，在导入一个或多个载体时，由导入的多核苷酸编码的目的基因在宿主细胞中表达。合适载体的实例包括但不限于质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体如λ噬菌体、丝状噬菌体载体、病毒载体、病毒样颗粒和细菌孢子。
[0127]
在本发明的优选实施方案中，载体是病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、甲病毒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、痘病毒载体、水泡性口炎病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。
[0128]
在本发明特别优选的实施方案中，载体是腺病毒或腺相关病毒(aav)载体。
[0129]
使用适于治疗性施用的载体，可以将编码本发明的一种或多于一种mydgf蛋白或其变体的核酸导入宿主细胞、组织或个体。合适的载体可以优选地将核酸递送到靶细胞中，而不会引起不可接受的副作用。
[0130]
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的载体的使用包括应用于有需要的个体。
[0131]
包含编码mydgf蛋白或显示出上述mydgf的生物学功能的片段或变体的核酸的载体，优选用于治疗或预防肥大性纤维化，或用于治疗心力衰竭。
[0132]
根据另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含如本文所述的载体，并表达编码mydgf蛋白或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体的核酸，用于治疗或预防肥大性纤维化，或用于治疗心力衰竭。
[0133]
根据另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防纤维化或肥大，或用于治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含mydgf蛋白或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体以及任选地合适的药物赋形剂。
[0134]
如本文所用，术语“合适的药物赋形剂”是指药学上无活性的物质，例如但不限于稀释剂、赋形剂、表面活性剂、稳定剂、生理缓冲溶液或用于施用治疗性活性成分的载剂。“药物赋形剂”也称为“药物载剂”可以是液体或固体。液体载剂包括但不限于无菌液体，例如水和油中的盐溶液，包括但不限于石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。也可以将盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液用作液体药物载剂，特别是用于可注射溶液。当静脉内施用药物组合物时，盐溶液是优选的载剂。合适的药物载剂的实例描述于e.w.martin的“remington's pharmaceutical sciences”中。在本发明的优选实施方案中，载剂是合适的药物赋形剂。合适的药物“赋形剂”包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳
粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。这种合适的药物赋形剂优选是药学上可接受的。
[0135]“药学上可接受的”指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，更特别是人类的药物。
[0136]
术语“组合物”旨在包括以包封材料作为药物载剂以提供胶囊的活性化合物制剂，其中含有或不含有其他药物载剂的活性成分被药物载剂包围，因此该载剂与活性化合物相关联。
[0137]
术语“活性成分”是指药物组合物或制剂中具有生物活性的物质，即提供药物价值的物质。在本发明的上下文中，活性成分是mydgf蛋白或其显示mydgf生物学功能的片段或变体。药物组合物可包含一种或多于一种活性成分，其可彼此结合地或彼此独立地起作用。活性成分可以配制成中性形式或盐形式。盐形式优选为药学上可接受的盐。
[0138]
术语“药学上可接受的盐”是指，例如但不限于，本发明的mydgf多肽的盐，包括本文所述的其片段和变体。合适的药学上可接受的盐包括酸加成盐，其可以例如通过将本发明多肽的溶液与药学上可接受的酸如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸的溶液混合而形成。此外，当肽带有酸性部分时，其合适的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如，钙盐或镁盐)；以及与合适的有机配体形成的盐(例如，使用抗衡阴离子如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的铵、季铵和胺阳离子)。药学上可接受的盐的说明性实例包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、依地酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甲磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖庚酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、甘醇对氨基苯胂酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚、海巴胺、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月硅酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基磺酸盐、甲基硫酸盐、黏液酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、n-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘、十一烷酸盐、戊酸盐等(参见例如s.m.berge等人,"pharmaceutical salts",j.pharm.sci.,66,pp.1-19(1977))。
[0139]
根据一个实施方案，活性成分以有效量施用至细胞、组织或个体。“有效量”是指足以达到预期目的的活性成分的量。活性成分可以是治疗剂。给定活性成分的有效量将随参数如成分的性质、施用途径、接受活性成分的个体的尺寸和种类以及施用目的而变化。每种个体情况下的有效量可以由技术人员根据本领域已建立的方法凭经验确定。如在本发明的上下文中所使用的，“施用”包括对个体的体内施用以及对体外或离体的细胞或组织的直接施用。
[0140]
在本发明的优选实施方案中，药物组合物是为治疗疾病或障碍而定制的。本文所用的疾病或障碍的“治疗”、“处理”是指实现以下一项或多于一项：(a)减轻病症的严重程度；(b)限制或预防病症的症状发展；(c)抑制病症的症状恶化；(d)限制或预防先前患有病
症的患者的病症复发；(e)限制或防止先前有病症症状的患者的症状复发；(f)降低疾病或症状发生后的死亡率；(g)愈合；和(h)疾病的预防。术语“改善”也包含在术语“治疗”中。如本文所用，“预防”或“防止”疾病或病症指防止患者中发生此类疾病或病症。
[0141]
在本发明的特别优选的实施方案中，用根据本发明的药物组合物进行的治疗包括对需要这种治疗的个体进行治疗。
[0142]
本发明预期的药物组合物可以以本领域技术人员熟知的各种方式配制。例如，本发明的药物组合物可以是液体形式，例如溶液、乳剂或混悬剂的形式。优选地，本发明的药物组合物被配制用于非肠道施用，优选用于静脉内、动脉内、肌内、皮下、经皮、肺内、腹膜内、冠状动脉内、心脏内施用，或通过黏膜施用，优选用于静脉内、皮下或腹膜内施用。口服或肛门施用的制剂也是可能的。优选地，本发明的药物组合物是无菌水溶液的形式，其可以含有其他物质，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。如果必要的话，应该适当地缓冲水溶液(优选ph值为3至9，更优选ph值为5至7)。优选地，药物组合物为单位剂型。在这种形式中，药物组合物被细分成含有适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装含有离散量的药物组合物，例如包装的小瓶或安瓿。
[0143]
药物组合物优选通过静脉内、动脉内、肌内、皮下、经皮、肺内、腹膜内、冠状动脉内或心脏内途径施用，其中也包括本领域已知的其他施用途径。
[0144]
如果所述药物组合物用作个体的治疗，则所述药物组合物的使用可以代替相应疾病或病症的标准治疗，或者可以在标准治疗的基础上额外施用。在药物组合物的额外用途的情况下，药物组合物可以在标准治疗之前、同时或之后施用。
[0145]
还优选的是药物组合物施用一次或多于一次。这包括2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、25次、30次、35次、40次、45次或50次。药物施用的时间跨度不受限制。优选地，施用不超过1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。
[0146]
单一剂量的药物组合物可以独立地形成施用剂量的总量，或者相应的施用时间跨度可以包括作为一次或多于一次弹丸式注射和/或输液的施用。
[0147]
根据另一方面，本发明提供了治疗纤维化的方法，包括给有需要的患者施用治疗有效量的mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体。在所述方法中，mydgf优选包含seq id no:1，或其显示seq id no:1的mydgf的生物学功能的片段或变体。在这方面，该片段或变体包含的氨基酸序列与seq id no:1具有至少85％序列同一性。
[0148]
在本发明方法的优选实施方案中，纤维化是心脏、肾脏、肺和/或肝脏的纤维化。根据优选实施方案，纤维化是间质性肺病，进行性纤维化间质性肺病为更优选，特发性肺纤维化为最优选。
[0149]
根据本发明方法的优选实施方案，mydgf蛋白或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体通过一次或多于一次弹丸式注射和/或输液施用，优选在药学上可接受的载剂中施用。
[0150]
根据另一方面，本发明提供了治疗肥大的方法，该方法包括给有需要的患者施用治疗有效量的mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体。在所述方法中，mydgf优选包含seq id no:1，或其显示seq id no:1的mydgf的生物学功能的片段或变体。在这方面，该片段或变体包含的氨基酸序列与seq id no:1具有至少85％序列同一性。
[0151]
根据本发明方法的优选实施方案，肥大是心肌细胞肥大。
[0152]
根据本发明方法的优选实施方案，mydgf蛋白或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体通过一次或多于一次弹丸式注射和/或输液施用，优选在药学上可接受的载剂中施用。
[0153]
根据另一方面，本发明提供了治疗或预防心力衰竭的方法，包括给有需要的患者施用治疗有效量的生长因子mydgf或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体，优选地，其中心力衰竭是慢性心力衰竭。根据优选的实施方案，在治疗心力衰竭的方法中，心力衰竭或慢性心力衰竭是hfpef或hfref，hfpef中优选c期或d期hfpef，或hfref中优选c期或d期hfref。在这方面，该片段或变体包含的氨基酸序列与seq id no:1具有至少85％序列同一性。
[0154]
根据本发明方法的优选实施方案，mydgf蛋白或其表现出mydgf生物学功能的片段或变体通过一次或多于一次弹丸式注射和/或输液施用，优选在药学上可接受的载剂中施用。
[0155]
实施例
[0156]
这些实施例旨在进一步说明本发明并有助于更好的理解。它们不应以任意方式被解释为限制本发明的范围。
[0157]
实施例中的材料和方法：
[0158]
除非另有说明，以下材料和方法用于实施例中。
[0159]
内皮素1(et1)和血管紧张素ii(ang ii)购自sigma-aldrich公司，鼠胰岛素样生长因子1(igf1)购自r&d systems公司，smi4a购自selleckchem公司(目录号[#]s8005)。抗体购自abcam(肌质网/内质网ca
2+
atp酶2a[serca2a]，多克隆，#ab91032；α-微管蛋白，克隆epr13478(b))、cell signaling technology(β肌动蛋白，克隆13e5；黏着斑蛋白，克隆e1e9v)，eurogentech(鼠mydgf，多克隆，定制)(korf-klingebiel，2015)和thermo fisher(pim1，克隆g.360.1)。
[0160]
重组mydgf。在hek293-6e细胞中产生具有c-末端8xhis-标签的重组鼠mydgf，所述hek 293-6e细胞在无动物来源、化学成分确定、无蛋白质的freestyle f17表达培养基(gibco)中培养(karste等人methods mol biol.2017；1586:313-324)。通过共转染编码gfp的对照质粒来评估转染效率。通过离心收获细胞培养物上清液(6l)，并通过在proflux m12错流超滤装置(millipore)中使用5kda pellicon 2过滤器(millipore)对含300mmol/l nacl的pbs(ph 7.4)渗滤浓缩15倍。使用0.45/0.2μm sartobran 300过滤胶囊(sartorius)过滤浓缩物，并加入叠氮化钠(0.05％)。通过使用pure 25m系统(cytiva)和5ml histrap excel柱(cytiva)捕获mydgf。用pbs/nacl洗涤该柱，直到达到基线紫外信号。合并用咪唑(30mmol/l)洗脱的含有重组蛋白的级分，并使用vivaspin 20(5000mwco)超滤装置(sartorius)浓缩。使用hiload 26/600superdex 75柱(ge healthcare)，通过分子排阻层析法(sec)进一步纯化该蛋白质。mydgf以单峰洗脱，并使用vivaspin 20(5000mwco)超滤装置浓缩至2mg/ml。通过分子消光系数(1mg/ml＝abs
280nm 0.95)计算蛋白质浓度。重组蛋白(总产率5.95mg/l)通过sds-page和使用质谱(bruker)的胰蛋白酶指纹图谱进行表征。蛋白质样品在液氮中速冻，并储存在零下80℃。
[0161]
mydgf缺陷小鼠。先前已经描述了具有mydgf基因缺失的小鼠(mydgf tm1kcw，小鼠
基因组信息学id:5688472)。18将动物(balb/c
×
c57bl/6j背景)与c57bl/6n菌株回交10代，并通过杂合交配保持在该背景上。所有实验都使用同窝出生的老鼠。通过基因组pcr检测野生型和靶向等位基因(korf-klingebiel，2015)。
[0162]
小鼠手术和功能评估。所有手术程序都得到德国汉诺威当局的批准(landesamt f
ü
r verbraucherschutz und lebensmittelsicherheit)。在汉诺威医学院的中央动物设施中，小鼠被关在单独通风的笼子中，12小时光照/黑暗循环。食物和水是不限制提供的。横向主动脉缩窄(tac)手术(rockman等人，proc natl acad sci u s a.1991；88:8277-8281)在8至10周龄的c57bl/6n小鼠中进行。用0.02mg/kg阿托品(b.braun)和200mg/kg安乃近(zentiva)对动物进行皮下预处理。在诱导室中用3％至4％异氟烷(baxter)诱导麻醉。经口插管后，对小鼠进行机械通气(harvard apparatus，minivent 845型)，用1.5％至2％异氟醚维持麻醉。手术期间，将小鼠放在与温度控制器(fohr medical instruments)相连的加热垫上，以保持直肠温度在37℃。在手术显微镜下进行左前外侧胸廓切开术。从主动脉弓分离胸腺和脂肪组织后，将6-0丝线置于无名动脉和左颈动脉之间，并用26号钝针结扎。结打好后，拔掉针。伤口闭合后，将小鼠从呼吸机上断开，并在32℃的培养箱中恢复。在假手术对照组小鼠中，不结扎主动脉。小鼠接受为期3周的游泳训练方案以诱导生理性肥大(heineke，methods mol biol.2013；963:279-301)
[0163]
使用线性20mhz至46mhz换能器(mx400，vevo 3100，visualsonics)对通过面罩使用1％至2％异氟醚镇静的小鼠进行经胸2d超声心动图检查。在tac或假手术后立即通过多普勒超声确定主动脉缩窄部位的压力梯度和右至左颈总动脉峰值血流速度(vmax)比。从胸骨旁长轴切面记录左心室舒张末期面积(lveda)和左心室收缩末期面积(lvesa)。面积变化分数(％)计算为[(lveda
–
lvesa)/lveda]
×
100。
[0164]
对于左心室压力-容积测量，小鼠皮下注射2mg/kg布托啡诺(zoetis)。用4％异氟烷诱导麻醉。经口插管后，给小鼠腹膜内注射0.8mg/kg的潘库溴铵(actavis)，并用2％异氟醚维持麻醉。通过右颈动脉将1.4f微压力计尖端电导导管(spr-839，millar instruments)插入左心室。以1khz的速率对稳态压力-容积回路进行采样，并用labchart 7pro软件(adinstruments)进行分析。
[0165]
骨髓移植。从7周龄至9周龄的mydgf wt或ko供体小鼠的股骨和胫骨中抽取骨髓细胞(bmc)。通过nh4cl溶解来耗尽红细胞。对7周龄至9周龄的mydgf wt或ko受体小鼠进行致死性照射(9.5gy)，并通过尾静脉移植106个bmc。移植后，小鼠用环丙沙星(bayer)处理3周(100mg/l，在饮用水中)。移植后7周至8周进行tac手术。将该方案应用于对照实验，对cd45.2受体小鼠进行致死性照射，并移植来自同源cd45.1供体小鼠的bmc(b6.sjl-ptprca pepcb/boyj；jackson laboratory)。8周后，使用cd45.1(biolegend，克隆a20)(稀释，1:16)和cd45.2(bd biosciences，克隆104)(1:150)抗体的流式细胞仪显示，超过95％的血液白细胞的cd45.1是高的。23
[0166]
慢病毒基因转移。如前所述，在hek 293t细胞中产生了在teto/cmv启动子控制下编码全长鼠mydgf的慢病毒和空对照病毒(lachmann等人gene ther.2013；20:298-307)。为了使骨髓来源的炎症细胞中有条件地过表达mydgf，从7周龄至9周龄的r26-m2rtta小鼠中分离出造血干细胞(hsc),该小鼠在普遍活性的rosa26启动子的控制下表达反向四环素控制的反式激活因子(rtta-m2)蛋白。为此，使用miltenyi biotec公司的谱系细胞去除试剂
盒，通过磁激活细胞分选(macs)分离谱系阴性(lin
–
)骨髓细胞。细胞在补充有细胞因子(kit配体、白细胞介素-3、白细胞介素-11、flt3配体)的无血清stemspan培养基(stem cell technologies)中扩增，然后如前所述，在包被有纤连蛋白(takara bio)的平板中用含慢病毒载体颗粒的hek 293t细胞上清液转导(lachmann 2013；kustikova等人exp hematol.2014；42:505-515e507)。对wt受体小鼠进行致死性照射(9.5gy)并通过尾静脉移植1
×
106个lenti.对照转导的hsc或lenti.mydgf转导的hsc。移植后，小鼠用环丙沙星处理3周。移植后7周进行假手术或tac手术。为了在慢病毒转导的hsc衍生的炎症细胞中触发mydgf表达，在手术前1周开始用多西环素(在饮用水中2mg/ml)处理小鼠。
[0167]
mydgf蛋白疗法。tac手术后，立即将alzet渗透微型泵(型号2004，泵送速率0.25μl/h，持续28天，每6μl填充10μg mydgf或仅填充稀释剂)置于皮下肩胛间袋中。此后进行单次腹膜内弹丸式注射(10μg mydgf或仅稀释剂)。
[0168]
腺病毒。用adeasy腺病毒载体系统(agilent technologies)产生编码serca2a或红色荧光蛋白dsred的腺病毒。在tac手术前5天给小鼠注射腺病毒(通过尾静脉注射1
×
10
10
个噬斑形成单位)。tac后，小鼠立即接受第二次腺病毒注射。
[0169]
mydgf靶向液相色谱/多反应监测-质谱。通过靶向液相色谱/多反应监测-质谱(lc/mrm-ms)确定来自小鼠和患者的edta血浆样品中的mydgf浓度(polten等人anal chem.2019；91:1302-1308)。
[0170]
荧光激活细胞分类(facs)和流式细胞术。通过酶消化和facs从左心室分离炎症细胞(hulsmans 2018；korf-klingebiel等人circ res.2019；125:787-801)。在37℃下，在含有1mg/ml胶原酶d(roche)、2.4mg/ml分散酶(gibco)和100u/ml脱氧核糖核酸酶i(sigma-aldrich)的pbs中消化左心室30分钟。过滤细胞悬浮液(40μm细胞过滤器，falcon)，洗涤，并在含有4％fcs、2mmol/l edta和纯化的小鼠cd16/cd32抗体(bd biosciences，小鼠bd fc block，克隆2.4g2)(1:55)的pbs中于4℃孵育5分钟。然后将细胞与下列抗体在4℃孵育20分钟：来自bd biosciences的cd45r/b220-pe(克隆ra3-6b2)(1:500)、cd90.2/thy-1.2-pe(克隆53-2.1)(1:2500)、nk-1.1-pe(克隆pk136)(1:500)、cd49b/dx5-pe(克隆dx5)(1:500)、ly6g-pe(克隆1a8)(1:500)和cd11b-alexa fluor 700(克隆m1/70)(1∶50)；来自miltenyi biotec的ly6c-apc(克隆1g7.g10)(1:8)以及来自biolegend的cd45-亮紫570(克隆30-f11)(1∶33)、f4/80-fitc(克隆bm8)(1∶33)、cd3-pe/cy7(克隆17a2)(1∶33)和cd19-percp/cy5.5(克隆6d5)(1∶33)。洗涤后，在facsaria iiu仪器(becton dickinson)上分选细胞。单核细胞鉴定为cd45高cd11b高(cd45r/b220，cd90.2/thy-1.2，nk 1.1，cd49b/dx5，ly6g)低f4/80低ly6c高；巨噬细胞为cd45高cd11b高(cd45r/b220，cd90.2/thy-1.2，nk 1.1，cd49b/dx5，ly6g)低f4/80高或低ly6c低；中性粒细胞为cd45高cd11b高(cd45r/b220，cd90.2/thy-1.2，nk 1.1，cd49b/dx5，ly6g)高；t细胞为cd45高cd11b低(cd45r/b220，cd90.2/thy-1.2，nk 1.1，cd49b/dx5，ly6g)高cd3高cd19低；而b细胞为cd45高cd11b低(cd45r/b220，cd90.2/thy-1.2，nk 1.1，cd49b/dx5，ly6g)高cd3低cd19高。对于流式细胞术，炎症细胞与如上所述的标记抗体一起孵育。然后将细胞加入trucount管(bd biosciences)，在lsr ii流式细胞仪(becton dickinson)上计数，并用flowjo v10.6软件分析。
[0171]
macs分离内皮细胞和成纤维细胞。用胶原酶i(worthington)和dna酶i(sigma-aldrich)对左心室心肌进行酶消化。过滤细胞悬浮液(30μm细胞过滤器，falcon)，洗涤，与
cd45微珠一起孵育，并应用于ld柱。将流过的cd45低细胞流分洗涤，与cd146微珠一起孵育，并应用于ld柱。从柱上洗脱内皮细胞(cd45低cd146高)并用于rna分离(rneasy试剂盒，qiagen)。将流过的cd45低cd146高细胞流分洗涤，与饲养细胞去除微珠一起孵育，并应用于ls柱。从柱上洗脱成纤维细胞并用于rna分离(所有试剂和设备来自miltenyi biotec)。
[0172]
组织收集和分析。在tac或假手术后的不同时间点处死小鼠，取出左心室。使用rneasy试剂盒(qiagen)分离rna。在ripa缓冲液中制备蛋白质裂解物。将中心室切片包埋在oct化合物(组织tek)中，在液氮中速冻，并储存在-80℃。制备6μm冷冻切片。切片用罗丹明偶联的麦胚凝集素(wga，vector laboratories)染色，以突出心肌细胞边界。对200个至400个肌细胞的圆周进行追踪和数字化，以计算平均横截面积。切片用荧光素偶联的gsl i异凝集素b4(ib4，vector laboratories)染色以观察毛细血管。图像通过荧光显微镜(axio observer.z1)获得。在用来自eurogentec的多克隆抗体(1:100)18和fitc标记的多克隆二级抗体(invitrogen，#a24532)(1:200)染色后，在6μm冷冻切片(leica dm irb，具有tcs sp2 aobs扫描头)中通过共聚焦荧光显微镜观察mydgf。切片用cd11b抗体(invitrogen，克隆m1/70)(1∶200)和cy3标记的多克隆二级抗体(jackson immunoresearch，#712-165-153)(1∶200)共染色。在初步实验中，发现所有二级抗体产生低背景信号。切片用天狼星红(sigma-aldrich)染色以用光学显微镜定量间质胶原体积分数。
[0173]
心肌细胞分离和培养。使用alliance for cellular signaling的方案，通过酶消化分离成年小鼠心室心肌细胞(amcm)(http://www.signaling-gateway.org/data/cgi-bin/protocols.cgi？cat＝0)。将amcm铺在添加了5％fcs和10mmol/l 2,3-丁二酮一肟(sigma-aldrich)的培养基199(sigma-aldrich)中的层黏连蛋白包被的6孔板中，通过相差显微镜和数字图像分析仪(axiovision，zeiss)确定细胞长度和宽度。通过percoll密度梯度离心法从1日龄至3日龄的sprague-dawley大鼠中分离出新生大鼠心室心肌细胞(nrcm)(shubeita等人a paracrine mechanism for myocardial cell hypertrophy.j biol chem.1990；265:20555-20562)。将nrcm放置在dmem(capricorn scientific，4份)和199培养基(1份)的明胶包被培养皿中过夜，培养基补充有5％马血清、2.5％fcs、谷氨酰胺和抗生素。然后将细胞转移到仅补充了谷氨酰胺和抗生素的dmem和培养基199中，并用各种试剂刺激24小时。nrcm表面积通过平面测量法确定，蛋白质含量通过bradford测定法(bio-rad)测定。使用lipofectamine rnaimax试剂和来自thermo fisher的sirna(pim1:#4390771,id:s128205；scrambled:#4390843,沉默子选择sirna-阴性对照)，用sirna(50pmol/106细胞)转染nrcm。
[0174]
定量逆转录-聚合酶链反应(rt-qpcr)。用rneasy rna分离试剂盒(qiagen)从细胞和组织中分离总rna，然后逆转录成cdna(superscriptiii逆转录酶，thermo fisher)；用taq man或sybr green分析确定mrna浓度(退火，60℃1分钟；延伸，72℃1分钟)(所有试剂均来自thermo fisher)。使用标准曲线(taqman)或相对定量(sybr green)分析数据。
[0175]
蛋白质组学和磷酸蛋白质组学的样品制备。刺激后，用冰冷的pbs洗涤nrcm(每次重复2
×
106个细胞)两次；用含有24mmol/l tris-hcl(ph 7.6)、150mmol/l nacl、1％np-40、1％去氧胆酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、完全迷你蛋白酶抑制剂混合物(roche)和phosstop(roche)的400μl冰冷的ripa缓冲液溶解；并在-80℃冷冻过夜。解冻后，用ika ultra-turrax将样品分散在冰上，并在4℃下以14000g离心5分钟。将上清液转移到新的反
应管中，用dc蛋白测定法(bio-rad)测量蛋白浓度。对于蛋白质组学，如前所述，使用sds-page和凝胶内胰蛋白酶消化处理50μg蛋白质(polten等人anal chem.2019；91:1302-1308)。具体来说，将每个凝胶泳道切成六块，分别消化以产生六个肽样品。对于磷酸蛋白质组学，采用了改进的过滤法样品制备方案(nel等人j proteome res.2015；14:1637-1642)。简而言之，将300μg蛋白质与200μl尿素缓冲液(8mol/l尿素，0.1mol/l tris-hcl[ph 9.5])混合，并装载到10kda amicon ultra-0.5ml离心过滤器(merck)上。用200μl尿素缓冲液洗涤滤膜两次，通过在黑暗中向尿素缓冲液中加入100μl 50mmol/l碘乙酰胺20分钟，使游离半胱氨酸碘乙酰胺化。此后，用100μl尿素缓冲液洗涤滤膜两次，用100μl 40mmol/l nh4hco3洗涤两次。胰蛋白酶消化在120μl 40mmol/l nh4hco3中进行，其含有7μg质谱级胰蛋白酶(serva)。在37℃下过夜消化后，用40μl 40mmol/l nh4hco3洗脱肽两次。通过加入12μl 10％三氟乙酸(tfa)酸化合并的流通液，然后通过真空离心干燥。按照制造商的方案，使用来自thermo scientific的pierce fe-nta磷酸肽富集试剂盒和pierce tio2磷酸肽富集试剂盒富集磷酸化肽。简而言之，在平衡fe-nta柱后，将干燥的消化的肽溶解在200μl结合缓冲液中，施加到柱上，并在室温下孵育30分钟。离心后，收集流通液。在用100μl洗涤缓冲液a进行两次洗涤步骤和用200μl洗涤缓冲液b进行两次洗涤步骤后，将流通部分和洗涤部分合并，通过真空离心干燥，并装载到tio2磷酸肽富集旋转吸头上。洗涤后，洗脱结合到旋转吸头上的磷酸肽，并通过真空离心干燥。用100μl洗脱缓冲液将结合到fe-nta柱上的磷酸肽洗脱两次。合并洗脱部分，并通过真空离心干燥。使用pierce石墨旋转柱(thermo fisher)将来自基于fe-nta和tio2的富集步骤的磷酸肽洗脱液脱盐。
[0176]
液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)和数据处理。如前所述，每次重复的六个肽和两个磷酸肽样品各自在30μl高效液相色谱上样缓冲液(2％乙腈，0.1％tfa)中重构，并使用连接到ltq orbitrap velos质谱仪(thermo scientific)的ultimate 3000rslcnano系统(thermo scientific)单独分析，(junemann等人front microbiol.2018；9:3083)。用maxquant软件(版本1.6.1.0)分析产生的光谱，将整合的andromeda肽搜索引擎应用于大鼠uniprot知识库(tyanova等人nat protoc.2016；11:2301-2319；uniprot consortium.uniprot:a worldwide hub of protein knowledge.nucleic acids res.2019；47:d506-d515)。丙酰胺化(c)(蛋白质组分析)或碘乙酰胺化化(c)(磷酸蛋白质组分析)被设定为固定修饰；磷酸化(s/t/y)、氧化(m)、脱酰胺(n/q)和n-末端乙酰化作为可变修饰。允许超过六个氨基酸的肽长度和多至两次遗漏的胰蛋白酶裂解。肽和蛋白质水平的错误发现率(fdr)阈值均设置为0.01，并应用了游程间匹配(match-between-runs)算法。排除了潜在的杂质和反向数据库匹配。使用perseus软件(1.6.1.3版)基于所有测量的log
2-转化强度的正态分布输入缺失值，对每个重复分别应用0.3的宽度和1.8的下移(tyanova等人.nat methods.2016；13:731-740)。对于磷酸化蛋白质组分析，仅考虑定位概率大于0.75的磷酸化位点。在至少一个实验条件下的所有四个重复中未检测到磷酸化位点被滤出。磷酸化位点强度根据相应的蛋白质丰度进行归一化。主组分分析基于所有磷酸化位点，根据perseus的计算，方差分析p值《0.05。主组分空间中的聚类由基于重复值的线性回归描绘。使用中位数调整的磷酸化位点强度和行列树的欧几里得距离度量，通过r语言的complexheatmap包进行无监督的层次聚类(gu等人bioinformatics.2016；32:2847-2849)。对于成对比较，磷酸化强度的差异被归一化为蛋白质丰度的相应差异。在至少一种情况下
蛋白质组中缺失的定量值或非显著调节的蛋白质(2个独立样品的t检验p值》0.05)被认为是蛋白质丰度比为1。使用来自phosphositeplus数据库的perseus和磷酸化位点注释进行线性激酶结构域富集分析(hornbeck等人nucleic acids res.2015；43:d512-520；hogrebe等人nat commun.2018；9:1045)。激酶-底物关系是基于测量的磷酸化位点周围的序列识别结构域预测的。用fisher精确检验，显著调节的磷酸化位点的激酶底物结构域被分类富集。对于每个显著调节的激酶(benjamini-hochberg fdr《0.02)，提取所有潜在靶标(激酶-底物识别结构域阳性，定位概率》0.75，双尾不成对t检验p值《0.05)，并确定算术平均调节(hogrebe 2018)。
[0177]
pim激酶活性测定。用pim激酶酶系统和adp-glo激酶测定法(promega，#v4032)测量pim激酶活性。
[0178]
测量细胞内ca
2+
浓度。将amcm铺在添加了5％fcs和10mmol/l 2,3-丁二酮一肟的培养基199中的层黏连蛋白包被的盖玻片上。3小时后，将细胞切换至装有1.5μmol/l fura-2，am(invitrogen，#f1221)的培养基199，在37℃下持续20分钟，洗涤15分钟共两次，并转移至定制的灌注小室。用myopacerep刺激器(ionoptix)在等渗电解质溶液的持续再循环下电刺激细胞，所述等渗电解质溶液包含nacl 117mmol/l、kcl 5.7mmol/l、nah2po
4 1.2mmol/l、cacl
2 1.25mmol/l、mgso
4 0.66mmol/l、葡萄糖10mmol/l、丙酮酸钠5mmol/l、肌酸10mmol/l和hepes 20mmol/l(ph 7.4)(mutig等人mol immunol.2013；56:720-728)。随机选择对刺激(1hz，15v，4ms脉冲持续时间)有反应的具有明确条纹的杆状静止心肌细胞。如前所述，使用双激发荧光光电倍增管系统(ionoptix)，在用340nm和380nm的交替波长激发后，通过测量在510nm发射的荧光来记录单细胞ca
2+
瞬态(mutig 2013；dobson等人am j physiol heart circ physiol.2008；295:h2364-2372)。在计算340nm/380nm荧光比(r)之前，分别记录未加入fura-2、am的一组10个细胞的平均背景荧光，并减去平均背景荧光。对每个细胞20次钙瞬态的数据进行平均。使用ionwizard 6.5分析fura-2，am比率振幅、fura-2，am比率增加的最大速度以及fura-2，am比率衰减的时间常数(τ)。
[0179]
单细胞肌节收缩和松弛分析。将amcm铺在添加了5％fcs和10mmol/l 2,3-丁二酮一肟的培养基199中的层黏连蛋白包被的盖玻片上。3小时后，将细胞切换至培养基199，转移至定制的灌注小室，并如上所述进行电刺激。对于每个细胞，定义包含15个至20个肌节的矩形目的区域，用连接到倒置显微镜(olympus ix71)的可变速率ccd摄像机(myocam-s，ionoptix)记录肌节长度的变化。快速傅立叶变换(fft)算法用于记录电起搏收缩期间肌节长度的变化。对每个细胞20次至30次抽动的数据进行平均。收缩幅度、最大缩短速度和最大舒张速度用ionwizard 6.5软件(ionoptics)分析。
[0180]
人类血浆样品。edta处理的血浆样品来自11名患者(年龄范围76岁至86岁，3名男性和8名女性)，这些患者的超声心动图证据显示存在严重的高梯度主动脉瓣狭窄(瓣膜面积0.65
±
0.05cm2，平均压力梯度51
±
3mmhg)，他们计划在汉诺威医学院接受选择性经导管主动脉瓣植入术(tavi)。排除患有冠状动脉疾病(任意管腔直径狭窄》50％)、活动性炎症或恶性疾病、肾小球滤过率预估低于30ml/min/1.73m2、或心脏代偿失调迹象的患者。第二份血浆样品是在tavi后3个月的常规追踪检查中抽取的。此外，edta血浆样品从海德堡大学招募的13名表面健康的个体(75至84岁，3名男性和10名女性)中获得(giannitsis等人clin biochem.2020；78:18-24)。血浆样品储存在-80℃。所有参与者都提供了书面知情同意书，
spectrometry.anal chem.2019jan 15；91(2):1302-1308；下同)。et1是一种肽类激素，是体外和体内心肌细胞肥大的典型诱导剂(综述于heineke j&molkentin jd.regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways.nat rev mol cell biol 2006；7:589-600)。通过平面测量法(终点，细胞面积)确定心肌细胞肥大。结果如下表2所示。
[0189]
表2：分别在et1和/或mydgf或mydgf不存在(对照)或存在下培养的nrvm的细胞面积
[0190][0191]
实施例3：
[0192]
小鼠和人髓源性生长因子抑制内皮素1(et1)刺激的新生大鼠心室肌细胞(nrvm)的肥大(终点，蛋白质含量)。分别用100nmol/l et1和/或100ng/ml重组小鼠或人髓源性生长因子(即分别为mydgf或mydgf)刺激nrvm持续24小时。结果如下表3所示。
[0193]
表3：分别在et1和/或mydgf或mydgf不存在(对照)或存在下培养的nrvm的蛋白质含量
[0194][0195]
实施例4：
[0196]
小鼠髓源性生长因子抑制内皮素1(et1)刺激的成年大鼠心室肌细胞(arvm)的肥大(终点，细胞尺寸)。用100nmol/l et1和/或100ng/ml重组小鼠髓源性生长因子(即mydgf)刺激arvm持续24小时。心肌细胞肥大是通过形态计量法(细胞长度和细胞宽度)和平面测量法(细胞面积)来确定的。结果如下表4所示。
[0197]
表4：在et1和/或mydgf不存在(对照)或存在下培养的arvm的细胞尺寸
[0198][0199]
实施例5：
[0200]
小鼠髓源性生长因子增加内皮素1(et1)刺激的新生大鼠心室肌细胞(nrvm)中肌质网/内质网ca
2+-atp酶(serca2a)蛋白的表达。用100nmol/l et1和/或100ng/ml重组小鼠髓源性生长因子(即mydgf)刺激nrvm持续24小时。然后通过免疫印迹法确定serca2a和黏着斑蛋白的蛋白表达水平。serca2a是心肌细胞钙稳态的关键调节因子。在实验性心力衰竭模
型和人类心力衰竭中，心肌细胞中的serca2a(人类中的serca2a)表达减少，从而促使功能减退和心力衰竭。因此，提出将serca2a作为心力衰竭的治疗靶点(综述于kawase y&hajjar rj.the cardiac sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium atpase:a potent target for cardiovascular diseases.nat clin pract cardiovasc med 2008；5:554-65)。结果如下表5所示。
[0201]
表5：在et1和/或mydgf不存在(对照)或存在下培养的nrvm中的serca2a蛋白表达(归一化为黏着斑蛋白表达)
[0202][0203]
实施例6：
[0204]
肌质网/内质网ca
2+-atp酶(serca2a)的下调消除了小鼠髓源性生长因子在内皮素1(et1)刺激的新生大鼠心室肌细胞(nrvm)中的抗肥大作用。用靶向serca2a(购自thermo fisher scientific,目录号4390771,id:s132037)的小干扰(si)rna或对照sirna(thermo fisher scientific,目录号4390843)转染nrvm。此后，用100nmol/l et1和/或100ng/ml重组小鼠髓源性生长因子(即mydgf)刺激nrvm持续24小时。通过平面测量法(终点，细胞面积)确定心肌细胞肥大。结果如下表6所示。
[0205]
表6：用serca2a sirna或对照sirna转染后，在et1和/或mydgf不存在(对照)或存在下培养的nrvm的细胞尺寸
[0206][0207]
实施例7：
[0208]
小鼠髓源性生长因子促进转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的分离自新生大鼠心室的成纤维细胞(nrvf)的抗纤维化作用(终点，胶原1a1和结缔组织生长因子[tgfβ1]mrna表
达)。用重组小鼠tgfβ1(2ng/ml；购自r&d systems，下同)和/或100ng/ml重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)刺激nrvf持续24小时。tgfβ1是器官纤维化的关键诱导剂(综述于border wa&noble na.transforming growth factor beta in tissue fibrosis.n engl j med 1994；331:1286-92)。结果如下表7所示。
[0209]
表7：在不存在(对照)或存在tgfβ1和/或mydgf的情况下培养的nrvf中胶原1a1和ctgf的mrna表达(rt-qpcr)
[0210][0211]
实施例8：
[0212]
小鼠髓源性生长因子促进转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的分离自新生大鼠心室的成纤维细胞(nrvf)的抗纤维化作用(终点，α-平滑肌肌动蛋白[sma]启动子活性)。在人αsma启动子片段(-259/+51碱基对)的控制下，用编码萤火虫荧光素酶的报告质粒转染nrvf，然后用重组小鼠tgfβ1(2ng/ml)和/或100ng/ml重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)刺激24小时。结果如下表8所示。
[0213]
表8：在不存在(对照)或存在tgfβ1和/或mydgf的情况下培养的nrvf中αsma启动子活性
[0214][0215]
实施例9：
[0216]
人髓源性生长因子部分减弱转化生长因子β1(tgfβ1)诱导的分离自新生大鼠心室的成纤维细胞(nrvf)基因表达变化。将nrvf与重组小鼠tgfβ1(2ng/ml)和/或100ng/ml重组人髓源性生长因子(mydgf)共孵育4小时。分离多聚腺苷酸rna，转化为cdna，并在使用下一代测序分析基因表达之前进行文库制备。将读取与大鼠参考基因组进行比对，计算映射至每个基因的读取数量，用bioconductor limma软件包计算不同处理条件下的差异基因(如表9所示)，应用校正p值临界值0.1和倍数变化临界值1.5。26个tgfβ1下调基因被mydgf上
调，30个tgfβ1诱导基因被mydgf下调。
[0217]
表9：
[0218]
[0219][0220]
实施例10：
[0221]
在经受横向主动脉缩窄(tac)的小鼠中，小鼠髓源性生长因子蛋白疗法促进抗肥大和抗纤维化作用。c57bl6/n野生型小鼠进行了tac手术(首次描述于rockman ha等人segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo mouse model of cardiac hypertrophy,proc natl acad sci usa 1991；88:8277-81)。tac使心脏左心室暴露于慢性压力超负荷，并导致左心室(lv)肥大和间质纤维化(综述于houser sr等人animal models of heart failure:a scientific statement from the american heart association.circ res 2012；111:131-50)。对照组小鼠接受假手术(不进行主动脉缩窄的开胸术)。tac后，小鼠立即接受重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)的10μg腹膜内弹丸式注射。此后，皮下输液mydgf(10μg/天，通过渗透微型泵)七天处理小鼠。另外的tac小鼠仅注射和输液载剂(0.9％nacl)。42天后，通过重力测量学确定左心室肥大(终点，左心室质量/体重，使用可商购获得的标准天平)；通过天狼星红染色对左心室间质纤维化进行定量。结果
如下表10所示。
[0222]
表10：假手术或tac后左心室肥大和间质纤维化
[0223][0224]
实施例11：
[0225]
在经受横向主动脉缩窄(tac)的小鼠中，小鼠髓源性生长因子蛋白疗法改善心脏功能。c57bl6/n野生型小鼠进行了tac手术。对照组小鼠接受假手术(不进行主动脉缩窄的开胸术)。tac后，小鼠立即接受重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)的10μg腹膜内弹丸式注射。此后，皮下输液mydgf(10μg/天，通过渗透微型泵)七天处理小鼠。另外的tac小鼠仅注射和输液载剂(0.9％nacl)。42天后，使用线性30mhz换能器(vevo 3100，visualsonics)对小鼠进行高分辨率经胸2d超声心动图检查。从长轴视图确定左心室(lv)舒张末期面积(lveda)和左心室收缩末期面积(lvesa)。通过计算面积变化分数(fac)测量收缩功能[(lveda
–
lvesa)/lveda]x100。结果如下表11所示。
[0226]
表11：假手术或tac后左心室尺寸和收缩功能
[0227] 小鼠数量平均值
±
semp值左心室舒张末期面积(mm2)
ꢀꢀꢀ
假手术1023.2
±
04 tac，nacl634.2
±
2.3与假手术相比＜0.01tac，mydgf929.2
±
1.5 左心室收缩末期面积(mm2)
ꢀꢀꢀ
假手术1012.1
±
0.2 tac，nacl632.1
±
2.5与假手术相比＜0.001tac，mydgf923.1
±
1.8与tac，nacl相比＜0.05fac(％)
ꢀꢀꢀ
假手术1048
±
1 tac，nacl66
±
1与假手术相比＜0.001tac，mydgf918
±
3与tac，nacl相比＜0.01
[0228]
实施例12：
[0229]
小鼠髓源性生长因子蛋白治疗增加了从经受横向主动脉缩窄(tac)的小鼠中分离的左心室心肌细胞中的肌质网/内质网ca
2+-atp酶(scrca2a)蛋白表达。c57bl6/n野生型小鼠进行了tac手术。对照组小鼠接受假手术(进行开胸术但没有主动脉缩窄)。tac后，小鼠立即接受重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)的10μg腹膜内弹丸式注射。此后，皮下输液mydgf
(10μg/天，通过渗透微型泵)7天处理小鼠。另外的tac小鼠仅注射和输液载剂(0.9％nacl)。7天后，通过免疫印迹法测定分离的左心室心肌细胞中scrca2a和β-肌动蛋白的表达水平。结果如下表12所示。
[0230]
表12：假手术或tac后左心室心肌细胞的serca2a蛋白表达(归一化为β-肌动蛋白表达)
[0231][0232]
实施例13：
[0233]
在经受横向主动脉缩窄(tac)的小鼠中，小鼠髓源性生长因子蛋白治疗减少左心室心肌细胞肥大。c57bl6/n野生型小鼠进行了tac手术。对照组小鼠接受假手术(进行开胸术但没有主动脉缩窄)。tac后，小鼠立即接受重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)的10μg腹膜内弹丸式注射。此后，皮下输液mydgf(10μg/天，通过渗透微型泵)7天治疗小鼠。另外的tac小鼠仅注射和输液载剂(0.9％nacl)。42天后，在麦胚凝集素染色的组织切片中确定左心室心肌细胞横截面积。结果如下表13所示。
[0234]
表13：tac后心肌细胞横截面积
[0235][0236]
实施例14：
[0237]
小鼠髓源性生长因子基因治疗改善心脏功能，并在经受横向主动脉缩窄(tac)小鼠中促进抗肥大和抗纤维化作用。c57bl6/n野生型小鼠被致死性照射并移植骨髓干细胞，所述骨髓干细胞已经用编码小鼠髓源性生长因子(mydgf)的慢病毒或编码绿色荧光蛋白(gfp对照)的慢病毒转导。这种慢病毒系统之前已有描述(magnusson m等人hoxa10 is a critical regulator for hematopoietic stem cells and erythroid/megakaryocyte development.blood 2007；109:3687-96)。移植后6周，小鼠接受tac手术。对照组小鼠接受假手术(进行开胸术但没有主动脉缩窄)。42天后，使用线性30mhz换能器(vevo 3100，visualsonics)对小鼠进行高分辨率经胸2d超声心动图检查。从长轴视图确定左心室(lv)舒张末期面积(lveda)和左心室收缩末期面积(lvesa)。通过计算面积变化分数(fac)测量收缩功能[(lveda
–
lvesa)/lveda]x100。从短轴视图确定左心室舒张末期后壁厚度作为左心室肥大的量度。通过天狼星红染色对左心室间质纤维化进行定量。结果如下表14所示。
[0238]
表14：假手术或tac后左心室收缩功能、肥大和间质纤维化
[0239][0240]
实施例15：
[0241]
人髓源性生长因子抑制特发性肺纤维化患者肺成纤维细胞中转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的smad磷酸化。在不存在或存在100ng/ml重组人髓源性生长因子(mydgf；产生于hek 293细胞，下同)的情况下，用2ng/ml重组人tgfβ1(购自r&d systems，下同)刺激两名特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞15分钟、30分钟或60分钟。通过免疫印迹确定smad磷酸化(活化)。smad信号传导通路是tgfβ1促纤维化作用的关键介质(综述于walton kl等人targeting tgfβmediated smad signaling for the prevention of fibrosis.front pharmacol 2017；8:461)。结果如下表15所示。
[0242]
表15：在不存在(对照)或存在tgfβ1和/或mydgf的情况下培养的两名特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞中smad2(ser465/467)和smad3(ser423/425)磷酸化(归一化为α-微管蛋白的表达)
[0243][0244]
实施例16：
[0245]
人髓源性生长因子抑制特发性肺纤维化患者肺成纤维细胞的迁移。来自两名特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞生长至汇合。用200μl移液管尖端尖刮取单层，洗涤，并在不存在或存在2ng/ml人转化生长因子β1(tgfβ1)和/或100ng/ml重组人髓源性生长因子(mydgf)的情况下培养16小时。在刺激前(0小时)和刺激后(16小时)，捕捉数字相差图像。恢复(％)计算为[(0小时的无细胞面积-16小时的无细胞面积)/0小时的无细胞面积]
×
100。结果如下表16所示。
[0246]
表16：两名特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞在不存在(对照)或存在tgfβ1和/或mydgf条件下划痕损伤后的迁移
[0247][0248]
实施例17：
[0249]
小鼠髓源性生长因子抑制特发性肺纤维化患者肺成纤维细胞的迁移。来自两名特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞生长至汇合。用200μl移液管尖端刮取单层，洗涤，并在不存在或存在2ng/ml人转化生长因子β1(tgfβ1)和/或100ng/ml重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)的情况下培养16小时。在刺激前(0小时)和刺激后(16小时)，捕捉数字相差图像。恢复(％)计算为[(0小时的无细胞面积-16小时的无细胞面积)/0小时的无细胞面积]
×
100。结果如下表17所示。
[0250]
表17：两名特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞在不存在(对照)或存在tgfβ1和/或mydgf条件下划痕损伤后的迁移
[0251][0252]
实施例18：
[0253]
人髓源性生长因子抑制特发性肺纤维化患者肺成纤维细胞中转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的smad磷酸化。在不存在或存在100ng/ml重组人髓源性生长因子(mydgf)的情况下，用2ng/ml重组人tgfβ1刺激特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞5分钟、15分钟、30分钟或60分钟。通过免疫印迹测定smad磷酸化(活化)。小分子alk5/tgfβi型受体抑制剂sb431542(10μmol/l；购自sigma-aldrich，下同)用作阳性对照。结果示于图1。
[0254]
实施例19：
[0255]
小鼠髓源性生长因子抑制转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的终末期心力衰竭患者左心室成纤维细胞smad磷酸化。在不存在或存在100ng/ml重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)的情况下，用2ng/ml重组人tgfβ1刺激来自终末期心力衰竭患者的左心室成纤维细胞30分钟。通过免疫印迹确定smad磷酸化(活化)。小分子alk5/tgfβi型受体抑制剂sb431542(10μmol/l)用作阳性对照。结果示于图2。
[0256]
实施例20：
[0257]
人髓源性生长因子抑制转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的终末期心力衰竭患者左心室成纤维细胞smad磷酸化。在不存在或存在100ng/ml重组人髓源性生长因子(mydgf)的情况下，用2ng/ml重组人tgfβ1刺激来自终末期心力衰竭患者的左心室成纤维细胞30分钟。通过免疫印迹确定smad磷酸化(活化)。小分子alk5/tgfβi型受体抑制剂sb431542(10μmol/l)用作阳性对照。结果示于图3。
[0258]
实施例21：
[0259]
小鼠髓源性生长因子抑制小鼠胚胎成纤维细胞(mef)的迁移。mef生长至汇合。用200μl移液管尖端刮取单层，洗涤，并在不存在或存在2ng/ml小鼠转化生长因子β1(tgfβ1)和/或100ng/ml重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)的情况下培养16小时。在刺激前(0小时)和刺激后(16小时)，捕捉数字相差图像。恢复(％)计算为[(0小时的无细胞面积-16小时的无细胞面积)/0小时的无细胞面积]
×
100。结果如下表21所示。
[0260]
表21：在不存在(对照)或存在tgfβ1和/或mydgf的情况下培养的小鼠胚胎成纤维细胞在划痕损伤后的迁移
[0261][0262]
实施例22：
[0263]
小鼠髓源性生长因子抑制转化生长因子β1(tgfβ1)刺激的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)smad磷酸化。在不存在或存在100ng/ml重组小鼠髓源性生长因子(mydgf)的情况下，用2ng/ml重组小鼠tgfβ1刺激mef 30分钟。通过免疫印迹确定smad磷酸化(活化)。结果示于图4。
[0264]
实施例23：
[0265]
炎症细胞衍生的mydgf减轻压力超负荷期间的心脏重构。为了探索mydgf在压力超负荷期间的功能，对mydgf ko小鼠及其wt同窝鼠进行了tac手术。mydgf ko小鼠正常繁殖和发育，在基线时没有表现出明显的心血管表型(korf-klingebiel 2015)。主动脉缩窄部位的压力梯度和右至左颈总动脉峰值血流速度比在wt和ko小鼠中是相似的。尽管主动脉狭窄的严重程度相当，但ko小鼠比wt小鼠出现更明显的左心室肥大(图5a)，tac后7天和42天的组织学和单细胞检查显示心肌细胞尺寸增加更多(图5b和图5c)。在两个时间点，与wt小鼠相比，ko小鼠在第7天显示myh6(α肌球蛋白重链)mrna表达的更强的下降，在第7天和第42天
myh7(β肌球蛋白重链)mrna更强的增加，在第42天nppa(a型利钠肽)mrna的更多的增加，以及nppb(b型利尿钠肽)mrna相似的增加。
[0266]
左心室压力-容积测量显示，与wt对照组相比，ko小鼠在tac后出现更明显的收缩和舒张功能障碍(图5d；表22)。
[0267]
表22：mydgf野生型和基因敲除小鼠的左心室容积测量
[0268] wt，假手术ko，假手术wt，tacko，tac心率(min-1
)499
±
15500
±
19483
±
7486
±
10lvedp(mmhg)5
±
15
±
19
±
119
±4**，#
lvesp(mmhg)98
±
4103
±
4150
±7***
149
±
11
**
lvedv(μl)40
±
341
±
345
±
350
±
7lvesv(μl)14
±
114
±
228
±
342
±6***
lvef(％)71
±
271
±
348
±3***
29
±5***，##
dp/dt
max
(mmhg/s)9,836
±
45710,472
±
4727,536
±
323
**
6,455
±
273
***
dp/dt
min
(mmhg/s)-8,645
±
382-8,764
±
341-7,923
±
358-5,341
±
406
***，###
τ(ms)7.2
±
0.37.2
±
0.48.1
±
0.412.0
±
1.1
***，##
[0269]
在mydgf野生型(wt)和敲除型(ko)小鼠(两组均为8只小鼠)中诱导横向主动脉缩窄(tac)。另外的小鼠接受假手术(每组6只小鼠)。7天后记录左心室(lv)压力-容积环。lvedp，左心室舒张末期压力；lvesp，左心室收缩末期压力；lvedv，左心室舒张末期容积；lvesv，左心室收缩末期容积；lvef，左心室射血分数；dp/dt
max
，左心室压力变化的最大速率；dp/dt
min
，左心室压力变化的最小速率。**p＜0.01，***p＜0.001与相同基因型假手术组相比；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001ko tac组与wt tac组相比(tukey的事后检验的双因素方差分析)。
[0270]
此外，产生了骨髓嵌合小鼠，以明确炎症细胞衍生的mydgf在压力超负荷期间调节左心室肥大和心脏功能中的重要性。将wt骨髓细胞(bmc)移植到ko小鼠中抑制了左心室肥大(图6a)和心肌细胞肥大(图6b)，增强了心肌毛细血管化(图6c)，并减弱了tac处理后的左心室扩张(图6d)和收缩功能障碍(图6e)。相反，将ko bmc移植到wt小鼠中增加肥大，降低毛细血管密度，并恶化左心室重构和收缩功能障碍(图6a至6e)。采用慢病毒基因转移来实现wt小鼠中mydgf的可诱导的炎症细胞特异性过表达(图6f)。
[0271]
在移植了经lenti.mydgf转导的bmc的小鼠中，将多西环素添加到饮用水中增强了bmc(与无多西环素的lenti.mydgf相比为5.8
±
2.2倍)和脾细胞(与无多西环素的lenti.mydgf相比为9.1
±
2.7倍)中的mydgf蛋白表达(图6g)。tac手术后，与多西环素处理的lenti.对照小鼠相比，多西环素处理的lenti.mydgf小鼠具有更高的mydgf血浆浓度(图6h)和更高的左心室mydgf表达水平(图6i)。与多西环素处理的lenti.对照小鼠相比，多西环素处理的lenti.mydgf小鼠在tac手术后出现了较轻的左心室肥大(图6j)，心肌细胞较小(图6k)，毛细血管密度稍高(p＝0.11，图6l)，左心室扩张较小(图6m)，收缩功能保留较多(图6n)。因此可以得出结论，炎症细胞衍生的mydgf对于限制慢性压力超负荷期间的适应不良肥大和重塑是必需的和充分的。
[0272]
实施例24：
[0273]
磷酸化蛋白质组分析鉴定pim1是心肌细胞mydgf的信号靶点。建立体外肥大模型
以评估mydgf是否直接靶向心肌细胞。et1刺激24小时增加了新生大鼠心室心肌细胞(nrcm)的尺寸(图7b)，蛋白质含量(图7c)，以及myh7和nppa mrna基因表达(图7d)。虽然单独的重组mydgf不影响这些终点，但与mydgf共同治疗几乎完全阻止了对et1的肥大反应；mydgf的抗肥大作用具有浓度依赖性，并且在半最大抑制浓度为7.6ng/ml时达到饱和(图7b)。mydgf类似地抑制ang ii诱导的肥大，但不减弱对igf1的应答中的肥大(图7a)。与et1和ang ii促进病理类型的心脏肥大不同，胰岛素样生长因子1(igf1)促进新生大鼠心肌细胞的生理类型的心脏肥大，这种肥大不被mydgf减弱。
[0274]
为了鉴定由mydgf激活的信号传导中间体，进行了磷酸化蛋白质组分析，随后进行了基于计算底物的激酶活性推断(图8a)(hogrebe等人nat commun.2018；9:1045；strasser等人integr biol.2019；11:301-314)。在mydgf存在或不存在的情况下，用et1刺激nrcm的8小时后，收集高含量的lc-ms/ms数据。在分布于1110种不同蛋白质中的2308个量化磷酸化位点中，当换算成蛋白质丰度的相应差异时，423个在四个实验条件下被差异磷酸化。
[0275]
无监督的分级聚类和主组分分析(图8b)表明，每种条件下的生物复制物聚集在一起，从而验证了工作流程的再现性。这四种条件在主组分空间中被很好地分离，表明它们与不同的磷酸蛋白质组信号相关。使用欧几里德距离作为相似性度量，我们观察到用et1和m ydgf共处理的nrcm表现出位于et1和未刺激对照之间的中间表型(图8b)。事实上，m ydgf逆转了许多由et1诱导的磷酸化蛋白质组变化：在et1处理的细胞中磷酸化程度更高的磷酸化位点(与未刺激的对照组相比)在et1和mydgf共刺激的细胞中往往磷酸化程度较低(与单独的et1相比)，反之亦然(图8c)。将激酶-底物相互作用的现有知识(hornbeck等人nucleic acids res.2015；43:d512-520)应用于磷酸蛋白质组数据集，推断了在et1处理的细胞中由mydgf诱导的激酶活性变化。基于不同调节的磷酸化位点及其各自激酶底物结构域的富集，预测mydgf会改变几种蛋白激酶的活性，包括丝氨酸/苏氨酸激酶pim1的强烈激活(图8d)。
[0276]
pim1及其亚型pim2和pim3具有相似的底物偏好，但组织表达谱不同(selten等人cell.1986；46:603-611；qian等人j biol chem.2005；280:6130-6137；nawijn等人nat rev cancer.2011；11:23-34)，pim1是心脏中的主要亚型(muraski等人nat med.2007；13:1467-1475)。pim激酶具有组成型活性，并在蛋白质表达水平上受到调节(nawijn 2011)。在早期的研究中，过表达pim1保护nrcm免受et1诱导的肥大(muraski 2007)，因此pim1成为介导心肌细胞mydgf效应的潜在候选物。mydgf增加了未刺激和et1刺激的nrcm中pim1的表达(图8e)和激酶活性(图8f)，证实我们的磷酸化蛋白质组数据。小分子pim激酶抑制剂smi4a(beharry等人mol cancer ther.2009；8:1473-1483；xia等人j med chem.2009；52:74-86)(图8g)和sirna介导的pim1下调(图8h)抑制了mydgf的抗高血压作用，表明mydgf确实通过pim1传递信号。
[0277]
实施例25：
[0278]
mydgf通过pim1增强心肌细胞serca2a的表达。ca
2+
循环异常导致心肌细胞收缩和舒张变慢，这在肥大和衰竭的心脏中很常见(houser等人j mol cell cardiol.2000；32:1595-1607)。肌质网/内质网ca
2+-atp酶2a(serca2a)表达和/或活性降低，阻碍ca
2+
隔离至肌质网/内质网中，可能导致心力衰竭中ca
2+
调节缺陷(luo等人circ res.2013；113:690-708)。由于先前已报道pim1刺激serca2a表达(muraski等人nat med.2007；13:1467-1475)，因此探索serca2a丰度是否受mydgf控制。事实上，mydgf刺激的nrcm中pim1表达的增加与
serca2a蛋白表达的增加是并行的(图9a)。pim1的抑制或sirna介导的下调阻止了serca2a的升高，表明mydgf通过pim1控制serca2a的表达(图9b)。
[0279]
在体内，假手术的wt和mydgf ko小鼠的左心室心肌细胞serca2a蛋白水平相当(图9c)。tac手术后，野生型小鼠在第7天仍保持serca2a表达(-17％，p＝0.14)，但在第42天减少。在这两个时间点，ko小鼠的serca2a表达显著低于wt小鼠(图9c)。假手术的wt和ko小鼠在分离的左心室心肌细胞中具有相似的pim1和serca2a蛋白表达水平(图9d)。tac后野生型小鼠心肌细胞中pim1的表达增加，但ko小鼠中没有。ko小鼠在tac后不能上调pim1与心肌细胞中serca2a丰度显著降低有关(图9d)。
[0280]
为了明确炎症细胞衍生的mydgf是否调节压力超负荷心脏中pim1和serca2a的表达，对mydgf骨髓嵌合和骨髓条件转基因小鼠进行了tac手术。将wt bmc移植到mydgf ko小鼠中增强了tac后左心室pim1和serca2a的丰度，而将ko bmc移植到wt小鼠中减少了tac后左心室pim1和serca2a的丰度(图9e)。此外，多西环素处理lenti.mydgf小鼠的左心室pim1和serca2a表达水平高于多西环素处理的lenti.对照小鼠(图9f)。结论是炎症细胞衍生的mydgf对于增强压力超负荷左心室中pim1和serca2a的表达是必需的和充分的。
[0281]
实施例26：
[0282]
探讨了压力超负荷时mydgf的治疗潜力。在tac手术后，使用皮下植入的渗透微型泵用重组mydgf治疗小鼠28天，以确保持续的蛋白质递送(10μg/天)(图10a)。tac后三天，mydgf处理的小鼠比仅用稀释剂处理的对照小鼠具有更高的mydgf血浆浓度(图10b)。tac后七天，mydgf处理的小鼠在分离的心室心肌细胞中具有更丰富的serca2a蛋白表达(图10c)，并且在28天的过程中，这些动物出现较不明显的左心室扩张(图10d)和收缩功能障碍(图10e)。抗重塑效应与肥大反应减弱(图10f)、心肌细胞变小(图10g)、左心室心肌毛细血管密度增加(图10h)和显著的存活获益(图10i)相关。
[0283]
特别是实施例23、实施例24、实施例25和实施例26表明mydgf对小鼠压力超负荷诱导的心力衰竭有保护作用。通过tac手术实施急性压力超负荷触发了左心室中mydgf丰度快速增加，单核细胞和巨噬细胞成为产生mydgf的主要细胞类型。循环ccr2
高
单核细胞的募集和分化以及心脏内巨噬细胞的增殖导致压力超负荷期间巨噬细胞库显著扩张。
[0284]
tac刺激后，mydgf ko小鼠比野生型小鼠出现更严重的左心室肥大，心肌细胞更大。ko小鼠更大的肥大以受损的ca
2+
循环和肌节功能、更显著的胎儿基因激活、降低的毛细血管密度、增强的间质纤维化、以及增强的左心室扩张和收缩及舒张功能障碍为特征，所有这些都是对压力超负荷的不适应反应的标志。
[0285]
运动训练没有引起心脏髓样细胞的扩张。因此，mydgf在训练和未训练小鼠的左心室中的表达相对较低，并且训练的mydgf ko小鼠像其野生型同窝出生的小鼠一样出现生理性肥大。
[0286]
作用于心肌细胞，mydgf通过增强serca2a表达减少细胞肥大并改善ca
2+
循环和肌节功能。磷酸蛋白质组学发现组成型活性丝氨酸/苏氨酸激酶pim1是一个潜在的mydgf下游靶点。事实上，抑制或下调pim1消除了mydgf在培养心肌细胞中的抗高血压和serca2a诱导作用。
[0287]
已有研究表明，在持续后负荷应激期间，重组mydgf治疗对左心室形状、收缩功能和存活率产生有益影响。