铜损失减轻的制作方法

铜损失减轻
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年4月15日提交的美国临时专利申请号63/010532的优先权，该美国临时申请的内容全文以引用方式并入本文。
3.本公开部分涉及防止溶液中的铜损失的方法。还提供了在不损失可溶性铜的情况下制备包含铜(ii)、半胱氨酸和其他组分的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的方法。细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂可以是可获得的或通过这些方法获得。细胞可以在根据此类方法制备的培养基中培养，并且生物产物可以通过所述细胞制造。


背景技术：

4.细胞培养可用于产生产物(诸如重组蛋白)，或者实际上培养的细胞本身也可以是一种产物。细胞培养可以使用真核细胞，诸如哺乳动物细胞，或原核细胞，诸如细菌细胞。
5.细胞培养依赖于使用培养基在受控条件下支持和生长细胞。培养基和相关的饲料、补充剂或添加剂需要存在许多不同的组分才能成功进行细胞培养。可以支持重组蛋白的商业生产的用于动物细胞培养的化学成分确定的培养基(cdm)的开发是生物技术行业的一个重要里程碑。cdm消除了含有血清/裂解物的培养基中固有的可变性(price pj,gregory ea.relationship between in vitro growth promotion and biophysical and biochemical properties of the serum supplement,in vitro cellular&developmental biology-plant,1982；18(6)，其通过引用整体并入本文)并且大大降低了外来因子的风险(van der valk j,mellor d,brands r,等人,the humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture,toxicology in vitro.2004；18(1):1-12，其通过引用整体并入本文)。在cdm之前，依靠血清或裂解物来递送细胞生长所需的一系列营养物和组分。
6.cdm提供了研究与未定义培养基(例如，含有血清或水解物)相关的培养基组分相互作用的机会。然而，含有血清/裂解物的培养基的一个优点是化合物通常已经是生物可用的形式。例如，铁虽然是许多细胞功能的重要辅助因子，但可能对细胞有毒。在未确定的培养基中，依靠生物螯合剂(诸如转铁蛋白)来递送铁且没有毒性(bjare u.serum-free cell culture.pharmacology&therapeutics.1992；53(3):355-374，其通过引用整体并入本文)。在cdm中，必须研究和实施非蛋白质螯合剂(诸如柠檬酸盐)以防止铁毒性。cdm通常含有大量组分，这些组分能以不一定显而易见的各种方式进行相互作用。cdm的成功实施需要了解组分如何化学相互作用以及如何将它们保持在生物可用的形式中。因此，了解组分如何相互作用对于获得最佳培养基和构成未限定培养基的补充剂也很重要。
7.因此，需要改进的制备细胞培养基、饲料和补充剂的方法，以减少由于组分之间的相互作用而引起的潜在问题。


技术实现要素：

8.我们已经确定，在包含半胱氨酸的细胞培养基、饲料或添加剂中，在痕量金属催化
剂(主要是铜和铁)存在下容易发生半胱氨酸向胱氨酸的氧化。当铜催化半胱氨酸氧化时，它会转化为不溶性铜(i)形式。一旦没有半胱氨酸被氧化，铜通常会恢复为可溶形式。然而，如果在发生半胱氨酸氧化的同时溶液经过无菌过滤，则至少一部分铜通常会处于不溶形式并且将从培养基中去除，从而降低培养基中铜的含量。这是不希望的，因为铜是许多细胞培养物中所需的痕量金属，因此溶液中的铜损失意味着所得培养基将为任何培养的细胞提供比预期更少的铜。这通常会导致较低的生产率。因此，本公开的目的是在过滤期间最小化和/或避免铜从溶液(诸如细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂)中的损失。
9.在第一方面，本公开提供了一种防止溶液中的铜损失的方法。溶液是包含铜(ii)和半胱氨酸的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。方法包括在过滤所述溶液之前和之后具有基本上相同量的可溶性铜。
10.在一实施例中，使用包含至少指定水平的溶解氧(do2)的溶液进行过滤。将氧气水平保持在至少指定水平可以迅速将铜(i)转化为可溶性铜(ii)，从而防止大量不溶性铜(i)的积累。指定水平可以是至少约6％do2的水平。指定水平可以是至少约8％do2的水平，例如，至少约10％do2的水平或至少约12％do2的水平。可以使用包含至少约6％do2的溶解氧(do2)水平的溶液进行过滤。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约8％do2(例如至少约10％do2的水平或至少约12％do2的水平)至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约6％do2至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约8％do2(例如至少约10％do2的水平或至少约12％do2的水平)至少约15分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约6％do2至少约15分钟。
11.指定水平可以是至少约0.4mg/l do2的水平，例如，至少约0.6mg/l do2的水平或至少约0.8mg/l do2的水平。可以使用包含至少约0.3mg/l do2的溶解氧(do2)水平的溶液进行过滤。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.4mg/l do2(例如至少约0.6mg/l do2的水平或至少约0.8mg/l do2的水平)至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.3mg/l do2至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.4mg/l do2(例如至少约0.6mg/l do2的水平或至少约0.8mg/l do2的水平)至少约15分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.3mg/l do2至少约15分钟。
12.在一实施例中，通过向溶液供氧和/或优化过滤，将do2水平至少保持在所需水平。所需水平可以是约6％do2、约8％do2、约10％do2或约12％do2。所需水平可以是约8％do2。所需水平可以是约0.3mg/l do2、约0.4mg/l do2、约0.6mg/l do2或约0.8mg/l do2。所需水平可以是约0.4mg/l do2。
13.供氧可以包括用包含氧气的气体对溶液进行喷射。供氧可以包括搅拌和/或混合溶液以增加溶液与包含氧气的气体的接触。供氧可以包括用包含氧气的气体对溶液进行喷射并搅拌或混合溶液以增加溶液与包含氧气的气体的接触。包含氧气的气体可以是大气。
14.优化过滤可以包括增加过滤速率、和/或过滤器大小、和/或过滤器容量，使得在过滤期间do2水平不会下降至低于指定水平。指定水平可以是约6％do2、约8％do2、约10％do2或约12％do2。指定水平可以是约8％do2。指定可以是约0.3mg/l do2、约0.4mg/l do2、约0.6mg/l do2或约0.8mg/l do2。指定水平可以是约0.4mg/l do2。
15.增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约10％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约15％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约20％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约25％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约30％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约50％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约75％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约100％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约10％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约15％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约20％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约25％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约30％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约50％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约75％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约100％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约10％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约15％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约20％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约25％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约30％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约50％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约75％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约100％。
16.过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约24小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约18小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约12小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约9小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约6小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约5小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约4小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约3小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约2小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约1小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约30分钟完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约20分钟完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约15分钟完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约10分钟完成。
17.过滤可以在不超过约100,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约50,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约25,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约25,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约15,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约10,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约5,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约4,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约3,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约2,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约1,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约500l的体积上进行。过滤可以在不超过约250l的体积上进行。过滤可以在不超过约100l的体积上进行。
18.过滤可以在至少约50l的体积上进行。过滤能以至少约100l的体积进行。例如，过滤可以在约100l至约2,000l的体积上进行，或者过滤能以约100l至约25,000l的体积进行。过滤可以在至少1,000l的体积上进行。例如，过滤可以在约1,000l至约2,000l的体积上进行，或者过滤能以约1,000l至约25,000l的体积进行。
19.过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约25,000l体积的溶液的约18小时之内(例如约12小时之内、约9小时之内或约6小时之内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约15,000l体积的溶液的约12小时之内(例如约9小时之内、约6小时之内或约3小时之内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约10,000l体积的溶液的约9小时之内(例如约6小时之内、约3小时之内或约1小时之内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约5,000l体积的溶液的约9小时之内(例如约6小时之内、约3小时之内或约1小时之内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约2,000l体积的溶液的约1小时之内(例如约30分钟内或约20分钟内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约1,000l体积的溶液的约30分钟之内(例如约20分钟内或约10分钟内)完成。
20.过滤能以至少约5l/min、10l/min、约20l/min、约30l/min、约40l/min、约50l/min、约60l/min、约70l/min、或约80l/min的速率进行。过滤能以至少10l/min的速率进行。过滤能以至少20l/min的速率进行。过滤能以至少30l/min的速率进行。过滤能以至少40l/min的速率进行。过滤能以至少50l/min的速率进行。
21.过滤能以不超过约170l/min、约150l/min、约130l/min、约110l/min、约100l/min、约90l/min、或约80l/min的速率进行。过滤能以不超过约170l/min的速率进行。过滤能以不超过约150l/min的速率进行。过滤能以不超过约130l/min的速率进行。过滤能以不超过约110l/min的速率进行。过滤能以不超过约100l/min的速率进行。
22.过滤能以从约5l/min至约170l/min的速率进行。过滤能以从约10l/min至约150l/min的速率进行。过滤能以从约20l/min至约150l/min的速率进行。过滤能以从约30l/min至约150l/min的速率进行。过滤能以从约40l/min至约150l/min的速率进行。过滤能以从约50l/min至约150l/min的速率进行。过滤能以从约10l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约20l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约30l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约40l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约50l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约10l/min至约100l/min的速率进行。过滤能以从约20l/min至约100l/min的速率进行。过滤能以从约30l/min至约100l/min的速率进行。过滤能以从约40l/min至约100l/min的速率进行。过滤能以从约50l/min至约100l/min的速率进行。
23.过滤能以每分钟总体积的至少0.1％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少0.25％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少0.5％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少1％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少2.5％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少5％的速率进行。
24.方法可以包括在开始过滤之前监测氧气水平，例如在开始过滤之前监测氧气水平至少约10分钟(例如至少约15分钟)。方法可以包括在过滤期间监测do2的水平。方法可以包括在开始过滤之前监测氧气水平以及在过滤期间监测do2水平。当方法包括监测氧气水平时，将氧气水平保持在至少指定水平可以包括响应于监测的氧气水平接近指定水平而向溶液添加氧气。当方法包括监测氧气水平时，将氧气水平保持在至少指定水平可以包括响应于监测的氧气水平接近指定水平而增加向溶液供氧和/或优化过滤。可以使用任何合适的技术监测do2水平。可以用电化学氧传感器或光学氧传感器监测do2水平。do2的水平可以用电化学氧传感器监测。do2的水平可以用光学氧传感器监测。
25.在实施例中，方法包括提供半胱氨酸溶液和铜(ii)溶液；并且过滤包括分别过滤
半胱氨酸溶液和铜(ii)溶液，并且接着将过滤的半胱氨酸溶液和经过滤的铜(ii)溶液合并以形成细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。通过将铜(ii)溶液和半胱氨酸溶液保持分离直到过滤之后，将铜在过滤之前和过滤期间保留在可溶性铜(ii)中。
26.半胱氨酸溶液可以包含除铜以外的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的至少大部分组分。半胱氨酸溶液可以包含细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的除铜和其他微量元素(诸如铁)以外的基本上全部组分。半胱氨酸溶液可以包含细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的除铜和铁以外的基本上全部组分。半胱氨酸溶液可以包含细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的除铜以外的基本上全部组分。
27.铜溶液可以包含除半胱氨酸以外的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的至少大部分组分。
28.铜(ii)溶液中铜的浓度可以在约0.005μm至约1.5m的范围内，例如0.005μm至约1m。该范围的上限可以取决于温度。因此，旨在在至少约30℃的温度使用的溶液可能具有至多约1.5m的浓度，而旨在在低于室温(诸如低于约20℃，例如在约10℃的温度)使用或存储的化合物可以具有至多约1m的浓度。在最终溶液是细胞培养基的情况下，铜(ii)溶液中铜的浓度可以在约0.005μm至约5μm的范围内。在最终溶液是细胞培养饲料的情况下，铜(ii)溶液中铜的浓度可以在约0.1mm至约150mm的范围内。在最终溶液是细胞培养添加剂的情况下，铜(ii)溶液中铜的浓度可以在约1mm至约1.5m的范围内，例如约1mm至约1m。
29.在实施例中，过滤包括无菌过滤。无菌过滤可以包括使用孔径不超过约0.5μm的过滤介质。无菌过滤可以包括使用孔径不超过约0.2μm的过滤介质。无菌过滤可以包括使用孔径不超过约0.1μm的过滤介质。无菌过滤可以包括使用孔径不超过约0.1μm的过滤介质。在实施例中，过滤介质包括一种或多种膜、中空纤维、柱、螺旋膜、管、毛细管、胶囊、盒、盘、熔块或塞。
30.在实施例中，半胱氨酸实质上作为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物提供。例如，半胱氨酸可以包含少于约1mm的游离半胱氨酸，例如半胱氨酸可以包含少于0.5mm的游离半胱氨酸(或少于0.1mm的游离半胱氨酸)。不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物不与铜(ii)反应形成不溶性铜(i)。
31.在向溶液添加铜(ii)之前，半胱氨酸可以实质上被转化为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物。半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物和/或噻唑烷部分。
32.半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物。例如，半胱氨酸衍生物可以包括胱氨酸、s-磺基半胱氨酸、s-磺基半胱氨酰甘氨酸、l-半胱氨酸混合二硫化物和/或s-磺基谷胱甘肽。半胱氨酸衍生物可以包括胱氨酸。
33.半胱氨酸衍生物可以包含噻唑烷部分。例如，半胱氨酸衍生物可以包括4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-羧酸盐、2-甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、2-(2-羧基乙基)21,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、l-2-氧代噻唑烷-4-甲酸、2-烷基-噻唑烷-4(r)-甲酸、2-芳基-噻唑烷-4(r)-甲酸和基于碳水化合物的噻唑烷(例如d-核糖-l-半胱氨酸)。半胱氨酸衍生物可以包括4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-羧酸盐。
34.半胱氨酸衍生物可以包含以下项中的至少一项：胱氨酸、4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-甲酸盐、s-磺基半胱氨酸、s-磺基半胱氨酰甘氨酸、半胱氨酸s-连接的n-乙酰葡萄糖胺(glcnac-cys)、同型半胱氨酸、l-半胱氨酸混合的二硫化物、l-半胱氨酸混合的肽、s-烷基
化半胱氨酸、具有硫醇保护基团的半胱氨酸(例如fmoc保护的半胱氨酸)、2-甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、2-(2-羧基乙基)21,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、还原型和氧化型谷胱甘肽(gsh)、s-磺基谷胱甘肽、s-酰基-gsh、s-羧基-l-半胱氨酸、l-2-氧代噻唑烷-4-甲酸、2-烷基-噻唑烷-4(r)-甲酸、2-芳基-噻唑烷-4(r)-甲酸或基于碳水化合物的噻唑烷(例如d-核糖-l-半胱氨酸)。
35.在实施例中，铜可以呈铜(ii)螯合物的形式。螯合物可以包含选自以下项的至少一种螯合剂：乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、新亚铜试剂、浴铜灵、d-青霉胺、三亚乙基四胺(teta)、二巯基丙醇(bal)、8-羟基喹啉、氯碘羟喹和5,7-二氯-2-[(二甲基氨基)甲基]-8-喹啉醇(pbt2)。
[0036]
在第二方面，本公开提供了在不损失可溶性铜的情况下制备包含铜(ii)、半胱氨酸和其他组分的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的方法。方法包括提供包含半胱氨酸和其他组分的水溶液；提供包含含铜(ii)的水溶液；分别过滤包含半胱氨酸和其他组分的水溶液和包含铜(ii)的水溶液；和将经过滤的溶液合并以提供细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。
[0037]
包含半胱氨酸和其他组分的水溶液的制备可以包括将半胱氨酸和其他组分在水性溶剂体系(例如水)中溶解和/或增溶。包含半胱氨酸和其他组分的溶液的制备可以包括将半胱氨酸和其他组分在包含酸、碱或水混溶性有机溶剂的初始溶剂体系中溶解和/或增溶，然后用水和任选的其他组分稀释初始溶剂体系以形成水溶液。
[0038]
包含铜(ii)的水溶液的制备可以包括将铜(ii)盐溶解在水性溶剂体系(例如水)中。包含铜(ii)的溶液的制备可以包括将铜(ii)盐在包含酸、碱或水混溶性有机溶剂的初始溶剂体系中溶解和/或增溶，然后用水和任选的其他组分稀释初始溶剂体系以形成水溶液。
[0039]
酸可以是无机酸或有机酸。示例性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氢盐、磷酸、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、硫酸、硫酸氢盐、氢碘酸或亚磷酸等。示例性有机酸包括相对无毒的有机酸，如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。示例性碱包括氨；钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁等的氢氧化物；钠、钾或铵的碳酸盐或碳酸氢盐。示例性的水混溶性有机溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮、二甲亚砜(dmso)和二甲基甲胺。
[0040]
铜(ii)溶液中铜的浓度可以在约0.005μm至约1m的范围内。当最终溶液是细胞培养基时，铜(ii)溶液中铜的浓度可以在约0.005μm至约5μm的范围内。在最终溶液是细胞培养饲料的情况下，铜(ii)溶液中铜的浓度可以在约0.1mm至约150mm的范围内。在最终溶液是细胞培养添加剂的情况下，铜(ii)溶液中铜的浓度可以在约1mm至约1m的范围内。
[0041]
在一实施例中，使用包含至少指定水平的溶解氧(do2)的溶液进行过滤。将氧气水平保持在至少指定水平可以迅速将铜(i)转化为可溶性铜(ii)，从而防止大量不溶性铜(i)的积累。指定水平可以是至少约6％do2的水平。指定水平可以是至少约8％do2的水平，例如，至少约10％do2的水平或至少约12％do2的水平。可以使用包含至少约6％do2的溶解氧(do2)水平的溶液进行过滤。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约8％do2(例如至少约10％do2的水平或至少约12％do2的水平)至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约6％do2至少约10分钟。方法可以
进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约8％do2(例如至少约10％do2的水平或至少约12％do2的水平)至少约15分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约6％do2至少约15分钟。
[0042]
指定水平可以是至少约0.4mg/l do2的水平，例如，至少约0.6mg/l do2的水平或至少约0.8mg/l do2的水平。可以使用包含至少约0.3mg/l do2的溶解氧(do2)水平的溶液进行过滤。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.4mg/l do2(例如至少约0.6mg/l do2的水平或至少约0.8mg/l do2的水平)至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.3mg/l do2至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.4mg/l do2(例如至少约0.6mg/l do2的水平或至少约0.8mg/l do2的水平)至少约15分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.3mg/l do2至少约15分钟。
[0043]
在一实施例中，通过向溶液供氧和/或优化过滤，将do2水平至少保持在所需水平。所需水平可以是约6％do2、约8％do2、约10％do2或约12％do2。所需水平可以是约8％do2。所需水平可以是约0.3mg/l do2、约0.4mg/l do2、约0.6mg/l do2或约0.8mg/l do2。所需水平可以是约0.4mg/l do2。
[0044]
供氧可以包括用包含氧气的气体对溶液进行喷射。供氧可以包括搅拌和/或混合溶液以增加溶液与包含氧气的气体的接触。供氧可以包括用包含氧气的气体对溶液进行喷射并搅拌或混合溶液以增加溶液与包含氧气的气体的接触。包含氧气的气体可以是大气。
[0045]
优化过滤可以包括增加过滤速率、和/或过滤器大小、和/或过滤器容量，使得在过滤期间do2水平不会下降至低于指定水平。指定水平可以是约6％do2、约8％do2、约10％do2或约12％do2。指定水平可以是约8％do2。指定可以是约0.3mg/l do2、约0.4mg/l do2、约0.6mg/l do2或约0.8mg/l do2。指定水平可以是约0.4mg/l do2。
[0046]
增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约10％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约15％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约20％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约25％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约30％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约50％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约75％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约100％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约10％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约15％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约20％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约25％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约30％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约50％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约75％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约100％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约10％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约15％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约20％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约25％。增加可以包括将过滤器容量增加至
少约30％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约50％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约75％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约100％。
[0047]
方法可以包括在开始过滤之前监测氧气水平，例如在开始过滤之前监测氧气水平至少约10分钟(例如至少约15分钟)。方法可以包括在过滤期间监测do2的水平。方法可以包括在开始过滤之前监测氧气水平以及在过滤期间监测do2水平。当方法包括监测氧气水平时，将氧气水平保持在至少指定水平可以包括响应于监测的氧气水平接近指定水平而向溶液添加氧气。当方法包括监测氧气水平时，将氧气水平保持在至少指定水平可以包括响应于监测的氧气水平接近指定水平而增加向溶液供氧和/或优化过滤。可以使用任何合适的技术监测do2水平。可以用电化学氧传感器或光学氧传感器监测do2水平。do2的水平可以用电化学氧传感器监测。do2的水平可以用光学氧传感器监测。
[0048]
在实施例中，半胱氨酸实质上作为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物提供。例如，半胱氨酸可以包含少于约1mm的游离半胱氨酸，例如半胱氨酸可以包含少于0.5mm的游离半胱氨酸(或少于0.1mm的游离半胱氨酸)。不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物不与铜(ii)反应形成不溶性铜(i)。
[0049]
在向溶液添加铜(ii)之前，半胱氨酸可以实质上被转化为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物。半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物和/或噻唑烷部分。
[0050]
半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物。例如，半胱氨酸衍生物可以包括胱氨酸、s-磺基半胱氨酸、s-磺基半胱氨酰甘氨酸、l-半胱氨酸混合二硫化物和/或s-磺基谷胱甘肽。半胱氨酸衍生物可以包括胱氨酸。
[0051]
半胱氨酸衍生物可以包含噻唑烷部分。例如，半胱氨酸衍生物可以包括4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-羧酸盐、2-甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、2-(2-羧基乙基)21,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、l-2-氧代噻唑烷-4-甲酸、2-烷基-噻唑烷-4(r)-甲酸、2-芳基-噻唑烷-4(r)-甲酸和基于碳水化合物的噻唑烷(例如d-核糖-l-半胱氨酸)。半胱氨酸衍生物可以包括4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-羧酸盐。
[0052]
半胱氨酸衍生物可以包含以下项中的至少一项：胱氨酸、4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-甲酸盐、s-磺基半胱氨酸、s-磺基半胱氨酰甘氨酸、半胱氨酸s-连接的n-乙酰葡萄糖胺(glcnac-cys)、同型半胱氨酸、l-半胱氨酸混合的二硫化物、l-半胱氨酸混合的肽、s-烷基化半胱氨酸、具有硫醇保护基团的半胱氨酸(例如fmoc保护的半胱氨酸)、2-甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、2-(2-羧基乙基)21,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、还原型和氧化型谷胱甘肽(gsh)、s-磺基谷胱甘肽、s-酰基-gsh、s-羧基-l-半胱氨酸、l-2-氧代噻唑烷-4-甲酸、2-烷基-噻唑烷-4(r)-甲酸、2-芳基-噻唑烷-4(r)-甲酸或基于碳水化合物的噻唑烷(例如d-核糖-l-半胱氨酸)。
[0053]
在实施例中，铜可以呈铜(ii)螯合物的形式。螯合物可以包含选自以下项的至少一种螯合剂：乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、新亚铜试剂、浴铜灵、d-青霉胺、三亚乙基四胺(teta)、二巯基丙醇(bal)、8-羟基喹啉、氯碘羟喹和5,7-二氯-2-[(二甲基氨基)甲基]-8-喹啉醇(pbt2)。
[0054]
在第三方面，本公开提供了在不损失可溶性铜的情况下制备包含铜(ii)、半胱氨酸和其他组分的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的方法。方法包括过滤包含铜(ii)、半胱氨酸和其他组分的溶液以提供细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。
[0055]
过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约24小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约18小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约12小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约9小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约6小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约5小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约4小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约3小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约2小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约1小时内完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约30分钟完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约20分钟完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约15分钟完成。过滤可以在将铜(ii)添加至溶液之后约10分钟完成。
[0056]
过滤可以在不超过约100,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约50,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约25,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约25,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约15,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约10,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约5,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约4,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约3,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约2,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约1,000l的体积上进行。过滤可以在不超过约500l的体积上进行。过滤可以在不超过约250l的体积上进行。过滤可以在不超过约100l的体积上进行。
[0057]
过滤可以在至少约50l的体积上进行。过滤能以至少约100l的体积进行。例如，过滤可以在约100l至约2,000l的体积上进行，或者过滤能以约100l至约25,000l的体积进行。过滤可以在至少1,000l的体积上进行。例如，过滤可以在约1,000l至约2,000l的体积上进行，或者过滤能以约1,000l至约25,000l的体积进行。
[0058]
过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约25,000l体积的溶液的约18小时之内(例如约12小时之内、约9小时之内或约6小时之内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约15,000l体积的溶液的约12小时之内(例如约9小时之内、约6小时之内或约3小时之内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约10,000l体积的溶液的约9小时之内(例如约6小时之内、约3小时之内或约1小时之内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约5,000l体积的溶液的约9小时之内(例如约6小时之内、约3小时之内或约1小时之内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约2,000l体积的溶液的约1小时之内(例如约30分钟内或约20分钟内)完成。过滤可以在将铜(ii)添加至包含不超过约1,000l体积的溶液的约30分钟之内(例如约20分钟内或约10分钟内)完成。
[0059]
过滤能以至少约5l/min、10l/min、约20l/min、约30l/min、约40l/min、约50l/min、约60l/min、约70l/min、或约80l/min的速率进行。过滤能以至少10l/min的速率进行。过滤能以至少20l/min的速率进行。过滤能以至少30l/min的速率进行。过滤能以至少40l/min的速率进行。过滤能以至少50l/min的速率进行。
[0060]
过滤能以不超过约170l/min、约150l/min、约130l/min、约110l/min、约100l/min、约90l/min、或约80l/min的速率进行。过滤能以不超过约170l/min的速率进行。过滤能以不超过约150l/min的速率进行。过滤能以不超过约130l/min的速率进行。过滤能以不超过约110l/min的速率进行。过滤能以不超过约100l/min的速率进行。
[0061]
过滤能以从约5l/min至约170l/min的速率进行。过滤能以从约10l/min至约150l/min的速率进行。过滤能以从约20l/min至约150l/min的速率进行。过滤能以从约30l/min至
约150l/min的速率进行。过滤能以从约40l/min至约150l/min的速率进行。过滤能以从约50l/min至约150l/min的速率进行。过滤能以从约10l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约20l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约30l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约40l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约50l/min至约130l/min的速率进行。过滤能以从约10l/min至约100l/min的速率进行。过滤能以从约20l/min至约100l/min的速率进行。过滤能以从约30l/min至约100l/min的速率进行。过滤能以从约40l/min至约100l/min的速率进行。过滤能以从约50l/min至约100l/min的速率进行。
[0062]
过滤能以每分钟总体积的至少0.1％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少0.25％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少0.5％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少1％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少2.5％的速率进行。过滤能以每分钟总体积的至少5％的速率进行。
[0063]
在实施例中，过滤包括无菌过滤。无菌过滤可以包括使用孔径不超过约0.5μm的过滤介质。无菌过滤可以包括使用孔径不超过约0.2μm的过滤介质。无菌过滤可以包括使用孔径不超过约0.1μm的过滤介质。无菌过滤可以包括使用孔径不超过约0.1μm的过滤介质。
[0064]
在一实施例中，使用包含至少指定水平的溶解氧(do2)的溶液进行过滤。将氧气水平保持在至少指定水平可以迅速将铜(i)转化为可溶性铜(ii)，从而防止大量不溶性铜(i)的积累。指定水平可以是至少约6％do2的水平。指定水平可以是至少约8％do2的水平，例如，至少约10％do2的水平或至少约12％do2的水平。可以使用包含至少约6％do2的溶解氧(do2)水平的溶液进行过滤。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约8％do2(例如至少约10％do2的水平或至少约12％do2的水平)至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约6％do2至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约8％do2(例如至少约10％do2的水平或至少约12％do2的水平)至少约15分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约6％do2至少约15分钟。
[0065]
指定水平可以是至少约0.4mg/l do2的水平，例如，至少约0.6mg/l do2的水平或至少约0.8mg/l do2的水平。可以使用包含至少约0.3mg/l do2的溶解氧(do2)水平的溶液进行过滤。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.4mg/l do2(例如至少约0.6mg/l do2的水平或至少约0.8mg/l do2的水平)至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.3mg/l do2至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.4mg/l do2(例如至少约0.6mg/l do2的水平或至少约0.8mg/l do2的水平)至少约15分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的do2水平保持在至少约0.3mg/l do2至少约15分钟。
[0066]
在一实施例中，通过向溶液供氧和/或优化过滤，将do2水平至少保持在所需水平。所需水平可以是约6％do2、约8％do2、约10％do2或约12％do2。所需水平可以是约8％do2。所需水平可以是约0.3mg/l do2、约0.4mg/l do2、约0.6mg/l do2或约0.8mg/l do2。所需水平可以是约0.4mg/l do2。
[0067]
供氧可以包括用包含氧气的气体对溶液进行喷射。供氧可以包括搅拌和/或混合溶液以增加溶液与包含氧气的气体的接触。供氧可以包括用包含氧气的气体对溶液进行喷射并搅拌或混合溶液以增加溶液与包含氧气的气体的接触。包含氧气的气体可以是大气。
[0068]
优化过滤可以包括增加过滤速率、和/或过滤器大小、和/或过滤器容量，使得在过滤期间do2水平不会下降至低于指定水平。指定水平可以是约6％do2、约8％do2、约10％do2或约12％do2。指定水平可以是约8％do2。指定可以是约0.3mg/l do2、约0.4mg/l do2、约0.6mg/l do2或约0.8mg/l do2。指定水平可以是约0.4mg/l do2。
[0069]
增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约10％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约15％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约20％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约25％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约30％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约50％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约75％。增加可以包括将过滤速率(和任选的过滤器大小，和/或任选的过滤器容量)增加至少约100％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约10％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约15％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约20％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约25％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约30％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约50％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约75％。增加可以包括将过滤器大小(和任选的过滤器容量)增加至少约100％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约10％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约15％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约20％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约25％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约30％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约50％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约75％。增加可以包括将过滤器容量增加至少约100％。
[0070]
方法可以包括在开始过滤之前监测氧气水平，例如在开始过滤之前监测氧气水平至少约10分钟(例如至少约15分钟)。方法可以包括在过滤期间监测do2的水平。方法可以包括在开始过滤之前监测氧气水平以及在过滤期间监测do2水平。当方法包括监测氧气水平时，将氧气水平保持在至少指定水平可以包括响应于监测的氧气水平接近指定水平而向溶液添加氧气。当方法包括监测氧气水平时，将氧气水平保持在至少指定水平可以包括响应于监测的氧气水平接近指定水平而增加向溶液供氧和/或优化过滤。可以使用任何合适的技术监测do2水平。可以用电化学氧传感器或光学氧传感器监测do2水平。do2的水平可以用电化学氧传感器监测。do2的水平可以用光学氧传感器监测。
[0071]
在实施例中，半胱氨酸实质上作为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物提供。例如，半胱氨酸可以包含少于约1mm的游离半胱氨酸，例如半胱氨酸可以包含少于0.5mm的游离半胱氨酸(或少于0.1mm的游离半胱氨酸)。不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物不与铜(ii)反应形成不溶性铜(i)。
[0072]
在向溶液添加铜(ii)之前，半胱氨酸可以实质上被转化为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物。半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物和/或噻唑烷部分。
[0073]
半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物。例如，半胱氨酸衍生物可以包括胱氨酸、s-磺基半胱氨酸、s-磺基半胱氨酰甘氨酸、l-半胱氨酸混合二硫化物和/或s-磺基谷胱甘肽。半
胱氨酸衍生物可以包括胱氨酸。
[0074]
半胱氨酸衍生物可以包含噻唑烷部分。例如，半胱氨酸衍生物可以包括4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-羧酸盐、2-甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、2-(2-羧基乙基)21,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、l-2-氧代噻唑烷-4-甲酸、2-烷基-噻唑烷-4(r)-甲酸、2-芳基-噻唑烷-4(r)-甲酸和基于碳水化合物的噻唑烷(例如d-核糖-l-半胱氨酸)。半胱氨酸衍生物可以包括4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-羧酸盐。
[0075]
半胱氨酸衍生物可以包含以下项中的至少一项：胱氨酸、4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-甲酸盐、s-磺基半胱氨酸、s-磺基半胱氨酰甘氨酸、半胱氨酸s-连接的n-乙酰葡萄糖胺(glcnac-cys)、同型半胱氨酸、l-半胱氨酸混合的二硫化物、l-半胱氨酸混合的肽、s-烷基化半胱氨酸、具有硫醇保护基团的半胱氨酸(例如fmoc保护的半胱氨酸)、2-甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、2-(2-羧基乙基)21,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、还原型和氧化型谷胱甘肽(gsh)、s-磺基谷胱甘肽、s-酰基-gsh、s-羧基-l-半胱氨酸、l-2-氧代噻唑烷-4-甲酸、2-烷基-噻唑烷-4(r)-甲酸、2-芳基-噻唑烷-4(r)-甲酸或基于碳水化合物的噻唑烷(例如d-核糖-l-半胱氨酸)。
[0076]
在实施例中，铜可以呈铜(ii)螯合物的形式。螯合物可以包含选自以下项的至少一种螯合剂：乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、新亚铜试剂、浴铜灵、d-青霉胺、三亚乙基四胺(teta)、二巯基丙醇(bal)、8-羟基喹啉、氯碘羟喹和5,7-二氯-2-[(二甲基氨基)甲基]-8-喹啉醇(pbt2)。
[0077]
在第一、第二或第三方面中任一个的实施例中，其他组分包含至少一种碳源，和/或至少一种氮源，和/或至少一种维生素，和/或至少一种缓冲剂，和/或至少一种无机盐，和/或至少一种痕量的除铜以外的金属，和/或至少一种多胺，和/或至少一种(必需的)脂肪酸，和/或至少一种抗氧化剂，和/或至少一种皮质类固醇，和/或至少一种螯合剂，和/或至少一种脂肪酶抑制剂。其他组分可以包含至少一种碳源，和/或至少一种氮源，和/或至少一种维生素，和/或至少一种缓冲剂，和/或至少一种无机盐，和/或至少一种痕量的除铜以外的金属，和/或至少一种多胺，和/或至少一种(必需)脂肪酸。其他组分可以包含至少一种碳源。其他组分可以包含至少一种氮源。其他组分可以包含至少一种维生素。其他组分可以包含至少一种缓冲剂。其他组分可以包含至少一种无机盐。其他组分可以包含至少一种痕量的除铜以外的金属。其他组分可以包含至少一种多胺。其他组分可以包含至少一种(必需)脂肪酸。其他组分可以包含至少一种碳源、至少一种氮源、至少一种维生素、至少一种缓冲剂、至少一种无机盐、至少一种痕量的除铜以外的金属、至少一种多胺和至少一种(必需)脂肪酸。
[0078]
至少一种碳源可以包含糖，任选单糖或二糖。糖可以包含葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、核糖和脱氧核糖中的至少一种(例如两种或更多种)。糖可以包括葡萄糖和/或脱氧核糖。
[0079]
至少一种氮源(例如两种或更多种氮源)可以包含至少一种氨基酸和/或氨/铵。至少一种氮源可以包含至少一种氨基酸。至少一种氨基酸可以选自l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-胱氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和l-缬氨酸。
[0080]
至少一种维生素(例如两种或更多种维生素)可以选自抗坏血酸(例如抗坏血酸镁盐)、生物素、胆碱(例如氯化胆碱)、d-ca2+-泛酸盐、叶酸、肌醇、甲萘醌、烟酰胺、烟酸、对氨基苯甲酸(paba)、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素a乙酸酯、维生素b12、维生素d2和具有类似维生素活性的物质(例如α硫辛酸或二氢硫辛酸(dhla))。
[0081]
至少一种缓冲剂可以包含能在约6至约8范围内的ph内进行缓冲的至少一种缓冲剂(例如两种或更多种缓冲剂)，诸如good's缓冲剂(例如公开于n.e.good,等人,“hydrogen ion buffers for biological research”,biochemistry(1966),5(2),467-477；n.e.good和s.izawa,“hydrogen ion buffers,methods in enzymology,(1972),vol.24,53-68；以及w.j.ferguson,等人,“hydrogen ion buffers for biological research”,analytical biochemistry,(1980),104(2),300-310)中。至少一种缓冲剂可以包含至少一种缓冲剂(例如两种或更多种缓冲剂)，其选自至少一种缓冲剂，该至少一种缓冲剂包含碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、乳酸盐、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(tes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)和2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(bis-tris)。
[0082]
至少一种无机盐(例如两种或更多种无机盐)可以包含钙、钾、镁、钠或铁的至少一种可溶性盐。可溶性盐可以是在25℃的水中具有至少1g/l的溶解度的盐。至少一种无机盐(例如两种或更多种无机盐)可以包含以下项中的至少一者：cacl2、kcl、mgcl2、mgso4、nacl、nahco3、na2hpo4、nah2po4和柠檬酸铁螯合物或硫酸亚铁螯合物。
[0083]
至少一种痕量的除铜以外的金属(例如两种或更多种痕量金属)可以包含以下项中的至少一者的离子：钡、溴、钴、碘、锰、铬、镍、硒、钒、钛、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锡、锆、镉、锌和铝。
[0084]
至少一种多胺(例如两种或更多种多胺)可以包含以下中的至少一者：腐胺、尸胺、精胺和亚精胺。
[0085]
至少一种(必需)脂肪酸(例如至少两种脂肪酸)可以选自n-3、n-6、n-9脂肪酸和胆固醇。至少一种(必需)脂肪酸(例如至少两种脂肪酸)可以选自亚油酸(ala)、亚麻酸(la)、二十二碳六烯酸(dha)、二十碳五烯酸(epa)和花生四烯酸(aa)。例如，至少一种必需脂肪酸(例如至少两种脂肪酸)可以选自ala和亚麻酸la。
[0086]
至少一种抗氧化剂(例如两种或更多种抗氧化剂)可以包含以下项中的至少一者：抗坏血酸、牛磺酸、亚牛磺酸、生育酚和生育三烯酚。
[0087]
至少一种皮质类固醇(例如两种或更多种皮质类固醇)可以包括至少一种糖皮质激素(例如氢化可的松)或盐皮质激素(例如醛固酮)。
[0088]
至少一种金属螯合剂(例如两种或更多种螯合剂)可以包含以下项中的至少一者：乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、新亚铜试剂、浴铜素、d-青霉胺、三亚乙基四胺(teta)、二巯基丙醇(bal)、8-羟基喹啉、氯碘羟喹和5,7-二氯-2-[(二甲基氨基)甲基]-8-喹啉醇(pbt2)、1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n
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,n
′‑
四乙酸(bapta)、1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸四(乙酰氧基甲酯)(bapta-am)、甲磺酸去铁胺，
[0089]
在第四方面，本公开提供了一种在培养基中培养细胞的方法。方法包括根据第一方面的方法防止培养基中的铜损失，或根据第二或第三方面的方法制备培养基；使细胞与
培养基接触；以及在培养基中培养细胞。
[0090]
细胞可以是真核细胞、原核细胞或古生菌细胞。真核细胞可以是哺乳动物细胞。细胞可以选自杂交瘤细胞、cho细胞、cos细胞、vero细胞、hela细胞、hek 293细胞、per-c6细胞、k562细胞、molt-4细胞、ml细胞、ns-1细胞、cos-7细胞、mdbk细胞、mdck细胞、mrc-5细胞、wi-38细胞、wehi细胞、sp2/0细胞、bhk细胞(包括bhk-21细胞)和它们的衍生物。
[0091]
在培养基中培养细胞可以包括使细胞倍增。方法可以进一步包括分离和/或纯化倍增的细胞。
[0092]
在第五方面，本公开提供了一种制造生物产物的方法。方法包括根据第一方面防止培养基中的铜损失，或根据第二或第三方面制备培养基；使被配置为表达所述生物产物的细胞与培养基接触；以及在培养基中培养细胞的条件下使得细胞表达生物产物。
[0093]
生物产物可以是多肽、蛋白质、肽、激素、病毒或病毒样颗粒、核酸或其片段；任选地是抗体或抗体的生物学功能片段。
[0094]
细胞可以是真核细胞、原核细胞或古生菌细胞。真核细胞可以是哺乳动物细胞。细胞可以选自杂交瘤细胞、cho细胞、cos细胞、vero细胞、hela细胞、hek 293细胞、per-c6细胞、k562细胞、molt-4细胞、ml细胞、ns-1细胞、cos-7细胞、mdbk细胞、mdck细胞、mrc-5细胞、wi-38细胞、wehi细胞、sp2/0细胞、bhk细胞(包括bhk-21细胞)和它们的衍生物。
[0095]
方法可以进一步包括分离和/或纯化产物。
[0096]
在第六方面，方法提供了通过第二或第三方面的方法能够获得或获得的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。
[0097]
在第七方面，本公开提供了第六方面的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂用于培养细胞的用途。培养可以包括从所述细胞产生生物产物。培养可以包括使所述细胞倍增。培养可以包括使所述细胞倍增以及从所述细胞产生生物产物。用途可以进一步包括分离生物产物。
附图说明
[0098]
下文将参考附图进一步描述本发明的实施例，其中：
[0099]
图1说明了在基因泰克基础培养基中通过过滤去除铜的时间过程。在每个时间点过滤等分试样(n＝3)，并将铜含量与未过滤的培养基进行比较。
[0100]
图2说明了在添加痕量金属之后示例性培养基中的若干参数如何随时间变化。a)提供半胱氨酸单体的浓度曲线，b)与饱和度百分比相比提供针对溶解氧(do2)浓度的曲线，c)提供氧化还原电位，以及d)提供铜去除、半胱氨酸单体和溶解氧的结果叠加图，允许比较这些参数中的每一个的相对水平。
[0101]
图3说明了通过以下方式扩展铜去除：a)增加未混合系统中的起始半胱氨酸浓度，b)增加混合系统中的起始半胱氨酸浓度，c)在半胱氨酸耗尽之后用氮气喷射，d)在半胱氨酸耗尽之前用氮气喷射。
[0102]
图4显示了半胱氨酸和丙酮酸盐的缩合反应形成2,4噻唑烷。
[0103]
图5提供了在简化培养基中通过ellman试剂测量的半胱氨酸单体曲线，比较了4个条件：简化培养基不含金属离子或丙酮酸盐，含丙酮酸盐，含金属离子，以及含丙酮酸盐和金属离子。
[0104]
图6提供了重复数据，示出了含半胱氨酸的细胞培养基的铜去除、半胱氨酸单体、溶解氧和氧化还原曲线的一致性(与图1和图2进行比较)。
具体实施方式
[0105]
在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包括”和“包含”及其变体表示“包括但不限于”，并且它们不旨在排除(也不排除)其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。在本说明书的整个描述和权利要求书中，单数包括复数，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书将被理解为考虑复数以及单数。
[0106]
结合本公开的特定方面、实施例或实例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施例或实例，除非与其不相容。本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的所有特征和/或由此公开的任何方法或过程的所有步骤可以任何组合进行组合，除了这些特征和/或步骤中的至少一些互相排斥的组合之外。本公开不限于任何前述实施例的细节。本公开扩展到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的特征的任何新颖特征或任何新颖组合，或者扩展到由此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖步骤或任何新颖组合。
[0107]
读者应注意与本说明书同时提交或在本说明书之前连同本技术一起提交并且与本说明书一起公开供公众查阅的所有文件和文档，并且所有这些文件和文档的内容通过引用并入本文。
[0108]
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文合并于本文。如有歧义，以本专利说明书(包括定义)为准。
[0109]
定义
[0110]
提供以下对术语和方法的解释以更好地描述本公开并指导本领域普通技术人员实施本公开。
[0111]
如本文所用，术语“可溶性铜”包括指代溶剂化的铜离子，即溶液中被溶剂分子包围或络合的铜离子。该溶液可以是水溶液，任选地包含极性有机溶剂(诸如乙醇)。可溶性铜可以包含铜(ii)离子或由其组成，例如在20℃在水中的溶解度大于1g/100ml的铜(ii)盐。
[0112]
如本文所用，术语“不溶性”包括指代在20℃在水中具有每100ml小于0.05g的溶解度的固体(例如包含铜(i)的种类)。
[0113]
如本文所用，术语“溶液”，除非上下文另有要求，包括指代含有多于一种物质的液相。当溶液为细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂时，溶剂通常为水，且溶液中的其他物质通常为溶质。溶质可能因沉淀而从溶液中损失。
[0114]
如本文所用，术语“过滤”包括指代使溶液通过多孔材料(过滤器)的过程。存在于溶液中的固体颗粒保留在过滤器上，特别是当颗粒大于过滤器的孔时。细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的过滤可以使用孔径不超过约0.5μm，诸如不超过约0.2μm(例如不超过约0.1μm)的过滤器进行。如本文所用，术语“无菌过滤”是指使用具有小到足以从溶液去除微生物，诸如病毒、细菌、真菌、支原体和传染性海绵状脑病试剂的孔径的过滤器进行的过滤。无菌过滤可以使用孔径不超过约0.1μm，诸如孔径不超过0.05μm的纳米过滤器。无菌过滤可以提供大于约4lrv的相关微生物的对数减少值(lrv)。
[0115]
关于溶液组分(诸如铜)的术语“可过滤的”是指该组分完全溶剂化并且/或者具有
足够小以使颗粒在过滤期间定量地通过过滤介质的孔的粒径。可过滤组分可以包含最大尺寸不超过过滤器孔径的90％(例如不超过70％)的颗粒。可过滤组分可以包含完全溶剂化种类和任选的最大尺寸不超过过滤器孔径的90％(例如不超过70％)的颗粒，或由它们组成。
[0116]
如本文所用，术语“溶解氧”(do2)包括指代溶解在溶液中的氧气水平。do2能以“％do
2”的相对单位提供，其表示基于在溶液温度(诸如约8℃至约40℃的范围内的温度)下212.2mbar的o2分压，o2在水中的饱和百分比。例如，do2可以是至少约8％的do2。do2能以“mg/l”的绝对单位提供。例如，do2在8℃的温度下可以是至少约1mg/l，并且/或者do2在40℃的温度下可以是至少约0.3mg/l。
[0117]
如本文所用，术语“大气”包括指代具有与海平面处地球大气的组分相似的组分的空气，包括氮气、氧气、水蒸气、氩气、二氧化碳和痕量气体。干燥气氛中的氧气含量通常为按体积基约20％至约21％。
[0118]
如本文所用，术语“螯合物”是指包含金属离子和至少一种多齿(例如二齿、三齿、四齿、五齿、六齿等)配体的络合物。铜(ii)中的示例性金属离子。示例性的多齿配体包括乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、新亚铜试剂、浴铜灵、d-青霉胺、三亚乙基四胺(teta)、二巯基丙醇(bal)、8-羟基喹啉、氯碘羟喹和5,7-二氯-2-[(二甲基氨基)甲基]-8-喹啉醇(pbt2)。虽然示例性多齿配体以特定酸或碱形式表示，但应理解配体能以任何合适的共轭酸或共轭碱形式提供。
[0119]
如本文所用，术语“半胱氨酸”包括指代氨基酸l-半胱氨酸、其互变异构体、几何异构体、盐或溶剂化物：
[0120][0121]
如本文所用，“半胱氨酸衍生物”包括指代其中二硫化物的氢已被与另一部分的键取代的胱氨酸衍生物，因此该半胱氨酸衍生物不包含巯基基团。例如，半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物或噻唑烷部分。
[0122]
如本文所用，术语“细胞培养基”是指用于培养细胞的营养溶液。“细胞培养饲料”和“细胞培养添加剂”表示可以添加到细胞培养基以改善培养基性能的营养补充剂。例如，细胞培养饲料和/或细胞培养添加剂可以在细胞的分批培养期间添加到细胞培养基。细胞培养基可以是化学成分确定的或可以包含未确定的组分。
[0123]
如本文所用，术语“接触”包括指代将待体外培养的细胞置于具有待对细胞进行培养的培养基的培养容器中。术语“接触”包括将细胞与培养基混合、将培养基移液到培养容器中的细胞上以及将细胞浸没在培养基中。
[0124]
如本文所用，术语“组合”是指细胞培养基制剂中的成分的混合或共混。
[0125]
如本文所用，“化学成分确定的”培养基是其中每种成分都是已知的培养基。化学成分确定的培养基与各自均含有未知组分的血清、胚胎提取物和水解物不同。本公开的细胞培养基可以是化学成分确定的培养基。本公开的细胞培养饲料可以是化学成分确定的。本公开的细胞培养添加剂可以是化学成分确定的。
[0126]
如本文所用，“未确定的培养基”或“包含未确定组分的培养基”包括指代包含一种或多种未知成分的培养基。例如，血清、蛋白胨、水解产物(诸如酵母、植物或血清水解产物)
和胚胎提取物可以提供未确定的组分。
[0127]
如本文所用，术语“成分”是指可用于细胞培养基、饲料或添加剂中以维持或促进细胞生长或增殖或由细胞表达产物的任何化合物，无论是化学来源还是生物来源。术语“组分”、“营养物”和“成分”可以互换使用，并且均意指此类化合物。用于细胞培养基的典型成分包括碳源(诸如简单碳水化合物，如糖)、氮源(诸如氨基酸)、维生素、缓冲剂、无机盐、痕量金属、多胺、脂、脂肪酸。示例性成分包括氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白质等。本领域技术人员可以根据具体需要选择促进或维持离体培养细胞的其他成分。
[0128]
细胞培养基由多种成分组成，且这些成分因培养基而异。如本文所用，“1x制剂”意指包含在工作浓度在细胞培养基中发现的一些或所有成分的任何水溶液。“1x制剂”可以指例如细胞培养基或用于该培养基的任何成分亚组。成分在1x溶液中的浓度与在用于体外维持或培养细胞的细胞培养制剂中发现的该成分的浓度大致相同。根据定义，用于体外培养细胞的细胞培养基是1x制剂。当存在多种成分时，1x制剂中的每种成分的浓度大约等于细胞培养基中这些成分的浓度。因此，当提及“1x制剂”时，意指溶液中的每种成分具有与所描述的细胞培养基中发现的相同或大致相同的浓度。细胞培养基的1x制剂中的成分浓度为本领域普通技术人员所熟知，其中相关组分和组分浓度取决于细胞类型和应用。参见，例如，methods for preparation of media,supplements and substrate for serum-free animal cell culture,new york:allen r.liss(1984)；h.j.morton,“a survey of commercially available tissue culture media”,in vitro(1970),6(2),89-108；和j.van der valk,等人,(2010),“optimization of chemically defined cell culture media
–
replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods,”toxicology in vitro,24(4),1053-1063；所有这些都通过引用整体并入本文。然而，与培养基相比，1x制剂中的渗透压和/或ph可能不同，特别是当1x制剂中含有较少成分时。
[0129]
如本文所用，“nnx制剂”，其中“nn”是大于1的整数，是指一种溶液，其中该溶液中的每种成分比1x制剂中的相应成分浓约nn倍。细胞培养饲料和细胞培养添加剂能以1x至1.5x109x的制剂提供，例如作为1x到10,000x的制剂。例如，细胞培养饲料能以1x至1,000x的制剂提供。如本领域技术人员将理解的，给定制剂的“nnx”上限将取决于制剂中每种组分的溶解度以及相应1x制剂中每种组分的所需浓度。因此，较高的“nn”通常可以用于仅包含具有相对高溶解度的组分的饲料和添加剂，这些组分在相应的1x制剂中也需要相对低的浓度。
[0130]
如本文所用，术语“细胞”包括指代真核细胞、原核细胞和古生菌细胞。除非上下文另有要求，否则指代细胞可以包括指代多个(细胞)。真核细胞可以是哺乳动物细胞，诸如杂交瘤细胞、cho细胞、cos细胞、vero细胞、hela细胞、hek 293细胞、per-c6细胞、k562细胞、molt-4细胞、ml细胞、ns-1细胞、cos-7细胞、mdbk细胞、mdck细胞、mrc-5细胞、wi-38细胞、wehi细胞、sp2/0细胞、bhk细胞(包括bhk-21细胞)和它们的衍生物。原核细胞可以是大肠杆菌(eschericia coli)、假单胞菌属(pseudomonas sp)、芽孢杆菌属(bacillus sp)、链霉菌属(streptomyces sp)、乳杆菌属(lactobacillus sp)、乳球菌属(lactoccocus sp)和它们的衍生物。古生菌细胞可以是卤代古菌及其衍生物。
[0131]
细胞培养基
[0132]
细胞培养基含有许多组分。细胞培养基提供了在受控、人工和体外环境中细胞维持和生长所必需的营养物。细胞培养基的特性和组成因特定的细胞需求而异。重要参数包括渗透压、ph和营养配方。
[0133]
培养基含有氨基酸、葡萄糖、盐、维生素和其他营养物的混合物，且可以从商业供应商处以粉末或液体形式获得。这些组分的要求因细胞系而异。调节ph对于最佳培养条件至关重要，通常使用合适的缓冲体系来实现。虽然由于cdm在无菌条件下制备和使用时可提供可重复的无污染培养基，cdm是治疗和相关应用的首选，但对于某些细胞类型，可能需要使用包含血清、蛋白质或其他生物提取物(诸如酵母提取物或植物或动物物质的酶消化物)的培养基。
[0134]
一些基本上由维生素、氨基酸、有机和无机盐以及缓冲液组成的非常简单的限定培养基已用于细胞培养。然而，此类培养基(通常称为“基础培养基”)通常严重缺乏大多数动物细胞所需的营养成分。因此，这些培养基通常需要补充例如饲料或其他添加剂，以形成完整的培养基。此外，分批培养系统通常包括用浓缩饲料或添加剂定期补充培养基，以维持培养细胞的活力和/或生物产物的产生，诸如多肽(例如抗体或抗体的生物功能片段)、蛋白质、肽、激素、病毒或病毒样颗粒、核酸或其片段。
[0135]
基础培养基中可能存在的成分包括氨基酸(氮源)、维生素、无机盐、糖(碳源)、缓冲盐和脂质。用于某些哺乳动物细胞培养系统的基础培养基可能含有乙醇胺、d-葡萄糖、n-[2-羟乙基]-哌嗪-n
′‑
[2-乙磺酸](hepes)、亚油酸、硫辛酸、酚红、pluronlc f68、腐胺、丙酮酸钠。
[0136]
培养基中可能包含的氨基酸成分包括l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸和它们的衍生物。这些氨基酸可以商购获得，例如从sigma(saint louis,missouri)。
[0137]
培养基中可能包含的维生素成分包括生物素、氯化胆碱、d-ca
2+-泛酸盐、叶酸、异肌醇、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素和维生素b12。这些维生素商购获得，例如从sigma(saint louis,missouri)。
[0138]
可用于培养基的无机盐成分包括一种或多种钙盐(例如cacl2)、fe(no3)3、kcl、一种或多种镁盐(例如mgcl2和/或mgso4)、一种或多种锰盐(例如mncl2)、nacl、nahco3、n2hpo4和痕量元素硒、钒、锌和铜的离子。这些痕量元素能以多种形式提供，优选以盐的形式，诸如na2seo3、nh4vo3、znso4和cuso4。这些无机盐和痕量元素可以商购获得，例如从sigma(saint louis,missouri)。
[0139]
可用于哺乳动物培养的示例性培养基包括市售培养基诸如ham's f10(sigma)、基本必需培养基((mem)，sigma)、rpmi-1640(sigma)和杜尔贝科改进伊格尔培养基((dmem)，sigma)，其适用于培养宿主细胞。此外，在ham和wallace(1979),meth.in enz.58:44；barnes和sato(1980),anal.biochem.102:255；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；wo 90/03430；wo 87/00195；美国专利号re.30,985；或美国专利号5,122,469中描述的培养基中的任一者(所有这些的公开内容通过引用并入本文)可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如
hepes)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如gentamycin
tm
药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。也能以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件诸如温度、ph值等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，对于普通技术人员而言是显而易见的。示例性的培养条件于m.takagi和k.ueda,“comparison of the optimal culture conditions for cell growth and tissue plasminogen activator production by human embryo lung cells on microcarriers”,biotechnology,(1994),41,565-570；h.j.morton,“a survey of commercially available tissue culture media”,in vitro(1970),6(2),89-108；j.van der valk,等人,(2010),“optimization of chemically defined cell culture media
–
replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods,”toxicology in vitro,24(4),1053-1063；r.j.graham等人.,“consequences of trace metal variability and supplementation on chinese hamster ovary(cho)cell culture performance:a review of key mechanisms and considerations”,biotechnol.bioeng.(2019),116(12),3446-3456；s.janoschek等人,a protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode:the benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model”,biotechnol.prog.,(2019),35(2),e2757；以及m.kuiper等人,“repurposing fed-batch media and feeds for highly productive cho perfusion processes”,biotechnology progress,2019年4月15日,https://doi.org/10.1002/btpr.2821中提供；所有这些都通过引用整体并入本文。
[0140]
本公开和发明的细胞培养基、饲料和添加剂包含铜(ii)和半胱氨酸。示例性培养基、饲料和添加剂中存在的铜(ii)和半胱氨酸(包括半胱氨酸衍生物)的量示于表1中。
[0141]
表1：铜(ii)和半胱氨酸的示例性浓度
[0142][0143][0144]
半胱氨酸可以作为l-半胱氨酸提供，能以多种水合和/或盐形式提供。如果溶剂在工艺工作浓度下与培养物和/或产物接触时不影响细胞培养性能或产物质量，则这些含半胱氨酸形式可以溶解在水、有机溶剂、碱性溶剂或酸性溶剂中以提高溶解度。对于某些细胞类型，至少一部分半胱氨酸(例如基本上所有的半胱氨酸)可以作为半胱氨酸衍生物提供。
例如，如本文所公开的，基本上全部半胱氨酸可以作为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物提供。铜(ii)能以多种水合和/或盐形式(通常为具有一些水含量的硫酸盐)提供。如果溶剂在工艺工作浓度下与培养物和/或产物接触时不影响细胞培养性能或产物质量，则这些含铜形式可以溶解在水、有机溶剂、碱性溶剂或酸性溶剂中以提高溶解度。
[0145]
细胞培养基、饲料和添加剂的其他组分包括至少一种碳源，和/或至少一种氮源，和/或至少一种维生素，和/或至少一种缓冲剂，和/或至少一种无机盐，和/或至少一种痕量的除铜以外的金属，和/或至少一种多胺，和/或至少一种(必需)脂肪酸。其他组分可以包含至少一种碳源。其他组分可以包含至少一种氮源。其他组分可以包含至少一种维生素。其他组分可以包含至少一种缓冲剂。其他组分可以包含至少一种无机盐。其他组分可以包含至少一种痕量的除铜以外的金属。其他组分可以包含至少一种多胺。其他组分可以包含至少一种(必需)脂肪酸。其他组分可以包含至少一种碳源、至少一种氮源、至少一种维生素、至少一种缓冲剂、至少一种无机盐、至少一种痕量的除铜以外的金属、至少一种多胺和至少一种(必需)脂肪酸。
[0146]
至少一种碳源可以包含糖，任选单糖或二糖。糖可以包含葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、核糖和脱氧核糖中的至少一种(例如两种或更多种)。糖可以包括葡萄糖和/或脱氧核糖。
[0147]
至少一种氮源(例如两种或更多种氮源)可以包含至少一种氨基酸和/或氨/铵。至少一种氮源可以包含至少一种氨基酸。至少一种氨基酸可以选自l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-胱氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和l-缬氨酸或它们的衍生物。在实施例中，至少一种氨基酸包括但不限于l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-胱氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和l-缬氨酸或它们的衍生物。
[0148]
至少一种维生素(例如两种或更多种维生素)可以选自抗坏血酸(例如抗坏血酸镁盐)、生物素、胆碱(例如氯化胆碱)、d-ca2+-泛酸盐、叶酸、肌醇、甲萘醌、烟酰胺、烟酸、对氨基苯甲酸(paba)、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素a乙酸酯、维生素b12和维生素d2。
[0149]
至少一种缓冲剂可以包括能在约6至约8范围内的ph内进行缓冲的至少一种缓冲剂(例如两种或更多种缓冲剂)，例如good's缓冲剂(例如公开于n.e.good,等人,“hydrogen ion buffers for biological research”,biochemistry(1966),5(2),467-477；n.e.good和s.izawa,“hydrogen ion buffers,methods in enzymology,(1972),vol.24,53-68；以及w.j.ferguson,等人,“hydrogen ion buffers for biological research”,analytical biochemistry,(1980),104(2),300-310)中。至少一种缓冲剂可以包含至少一种缓冲剂(例如两种或更多种缓冲剂)，其选自至少一种缓冲剂，该至少一种缓冲剂包含碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、乳酸盐、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(tes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)和2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(bis-tris)。
[0150]
至少一种无机盐(例如两种或更多种无机盐)可以包含钙、钾、镁、钠或铁的至少一
种可溶性盐。可溶性盐可以是在25℃的水中具有至少1g/l的溶解度的盐。至少一种无机盐(例如两种或更多种无机盐)可以包含以下项中的至少一者：cacl2、kcl、mgcl2、mgso4、nacl、nahco3、na2hpo4、nah2po4和柠檬酸铁螯合物或硫酸亚铁螯合物。至少一种痕量的除铜以外的金属(例如两种或更多种痕量金属)可以包含以下项中的至少一者的离子：钡、溴、钴、碘、锰、铬、镍、硒、钒、钛、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锡、锆、镉、锌和铝。
[0151]
至少一种多胺(例如两种或更多种多胺)可以包含以下中的至少一者：腐胺、尸胺、精胺和亚精胺。
[0152]
至少一种(必需)脂肪酸(例如至少两种脂肪酸)可以包括但不限于n-3、n-6、n-9脂肪酸和胆固醇。至少一种(必需)脂肪酸(例如至少两种脂肪酸)可以包括但不限于亚油酸(ala)、亚麻酸(la)、二十二碳六烯酸(dha)、二十碳五烯酸(epa)和花生四烯酸(aa)等。至少一种必需脂肪酸(例如至少两种脂肪酸)可以选自亚油酸和亚麻酸。
[0153]
一个方面提供了根据本发明的方法获得或可获得的包含铜(ii)和半胱氨酸的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。
[0154]
防止铜损失和/或制备培养基的方法
[0155]
细胞培养基、饲料或添加剂在制备过程中可能会损失铜。特别地，当细胞培养基、饲料或添加剂被过滤(例如通过无菌过滤)时，不溶性铜种类(例如铜(i)物质)可能被保留在过滤器上。这是有问题的，因为这些组合物通常包含通过最终灭菌降解的组分，而过滤，特别是无菌过滤，代表了广泛使用的提供无菌培养基、饲料和添加剂的方法。
[0156]
我们已经确定，通常存在于细胞培养基中的半胱氨酸在导致铜过滤去除方面具有重要作用。例如，当我们测试不含半胱氨酸的改良培养基时，没有观察到铜损失。在使用胱氨酸(氧化二聚体形式)而不是半胱氨酸的培养基中，也未观察到过滤过程中的铜去除。我们还观察到铜损失的时间过程瞬态受到铁和丙酮酸盐的影响。铜损失与ph有关，在中性ph值附近发生最严重，但不限于特定的缓冲剂种类。应该注意的是，由于与铜相比，半胱氨酸通常明显过量存在，因此培养基/饲料/添加剂中相对适度的半胱氨酸损失通常对溶液中半胱氨酸的总体水平几乎没有影响，而铜损失通常具有更明显的影响。
[0157]
半胱氨酸在金属离子催化剂和氧气存在下氧化成其二聚体形式的胱氨酸(cavallini d，等人，the copper catalyzed oxidation of cysteine to cystine.archives of biochemistry and biophysics.1969；130(1)：354-361，其通过引用整体并入本文)。半胱氨酸氧化根据以下进行：
[0158]
2rsh+o2→
rssr+h2o2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0159]
2rsh+h2o2→
rssr+2h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0160]
提供总反应式：
[0161]
4rsh+o2→
2rssr+2h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(3)
[0162]“rsh”是半胱氨酸并且“rssr”是胱氨酸。
[0163]
在第一个反应中，半胱氨酸与氧气反应生成胱氨酸和过氧化氢，而在第二个反应中，过氧化氢与第二当量的半胱氨酸反应生成额外的半胱氨酸和两个当量的水。铜和铁二者都催化半胱氨酸氧化，但据报道铜是更活跃的催化剂(munday r，等人，inhibition of copper-catalyzed cysteine oxidation by nanomolar concentrations of iron salts.free radical biology and medicine.2004；36(6)：757-764；ehrenberg l，等人，
kinetics of the copper-and iron-catalysed oxidation of cysteine by dioxygen.acta chemica scandinavica.1989；43，其通过引用整体并入本文)。催化反应的第一步被认为是金属离子被半胱氨酸还原螯合，产生半胱氨酸-cu(i)或半胱氨酸-fe(ii)络合物(pecci l，等人，novel findings on the copper catalysed oxidation of cysteine.amino acids.1997；13(3-4)：355-367，其通过引用整体并入本文)。因此，当有半胱氨酸单体可供氧化时，金属离子将被还原，在铜的情况下还原为铜(i)状态。
[0164]
因此，半胱氨酸氧化导致不溶性铜(i)种类的形成。采用针对铜(i)的测定证实了这发生在细胞培养基中。此外，我们还确定，在存在足量do2的情况下，相对难溶性铜(i)很容易被氧化回代表可溶性铜的铜(ii)。
[0165]
已知的化学反应由以下反应说明：
[0166]
2cu
+
+o2+2h
+
→
2cu
2+
+h2o2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(4)
[0167]
2cu
+
+h2o2+2h
+
→
2cu
2+
+2h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(5)
[0168]
提供总反应式：
[0169]
4cu
+
+o2+4h
+
→
4cu
2+
+2h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(6)
[0170]
不希望受任何理论的束缚，据信cu(i)-半胱氨酸络合物将发生与游离cu(i)发生的反应相似的反应以分解催化剂并释放cu(ii)。这种机制解释了为什么do2必须低才能在过滤过程中去除铜，以及为什么铜需要氧气才能再次可过滤。
[0171]
因此，避免不溶性铜(i)的一种方法是确保溶液中有足够的do2以防止铜(i)种类的沉淀。这可以通过多种方式实现。例如，在过滤之前和/或期间，可以将氧气水平保持在足够高的指定水平以确保任何铜(i)向铜(ii)的定量氧化。指定水平可以是至少约6％do2、至少约8％do2、至少约10％do2或至少约12％do2。指定可以是约0.3mg/l do2、约0.4mg/l do2、约0.6mg/l do2或约0.8mg/l do2。附加地(或替代地)，过滤可以被优化，使得过滤完成的同时溶液中仍有足够的do2以防止铜(i)种类的沉淀。例如，过滤可以通过增加过滤速率、和/或过滤器大小、和/或过滤器容量来优化，使得在过滤期间do2水平不会下降至低于指定水平。
[0172]
过滤可以通过操纵过滤单元操作变量以针对待处理的给定体积满足固定过滤时间需求(例如，基于过滤方法(例如死端膜)来操纵过滤面积、流速等))来优化，以及通过使用本领域技术人员已知的技术凭经验或通过经验和理论方法表征系统来优化。参见，例如，ozturk s和hu w,cell culture technology for pharmaceutical and cell-based therapies,2005；rajniak p等人,sterilizing filtration
–
principles and practice for successful scale-up to manufacturing,2008，其全部公开内容通过引用明确并入本文。
[0173]
例如，可以使用经验过滤器大小研究来确定最佳过滤器大小，该研究可以基于各种端点以相关的大规模过滤单元操作(针对恒流的pmax(压力)或tmax(浊度)，针对恒压的vmax(体积))的函数的形式来执行。这将允许定义维持将在给定时间内处理批次体积的通量所需的过滤面积。当然，基于空间、成本等的给定生产现场/生产线存在实际限制。在我们的行业中用于放大/缩小的典型标准化(无单位)通量可以在10到8000的范围内和涵盖从50l到25000l的经处理的培养基体积。如果需要，这些方法也可以外推到更大或更小的体积。
[0174]
过滤可以使用孔径不超过约0.5μm，诸如不超过约0.2μm(例如不超过约0.1μm)的过滤器进行。过滤可以包括无菌过滤，例如用孔径不超过约0.1μm，诸如孔径不超过0.05μm的纳米过滤器进行过滤。无菌过滤可以提供大于约4 lrv的相关微生物(例如病毒)的对数减少值(lrv)。在上游操作(诸如制备细胞培养基、饲料和添加剂)中对细胞培养溶液进行纳滤是减少微生物污染的重要方法。参见，例如，shirota,m.等人kiss,r.,“risk mitigation in preventing adventitious agent contamination of mammalian cell cultures”,adv.biochem.eng.biotechnol.,2017,https://doi.org/10.1007/10_2017_38；和miesegaes,g.,等人,virus retentive filters.in:flickinger m(ed)encyclopedia of industrial biotechnology:bioprocess,bioseparation,and cell technology,wiley,2010,pp 1-11，其通过引用整体并入本文。过滤器包括但不限于膜过滤器(参见例如https://www.mrwa.com/waterworksmnl/chapter％2019％20membrane％20filtration.pdf，其通过引用整体并入本文)、中空纤维过滤器、柱式过滤器、螺旋膜过滤器、管式过滤器、毛细管过滤器、胶囊过滤器、盒式过滤器、盘式过滤器、熔块过滤器和塞式过滤器。
[0175]
确保溶液中有足够的do2以防止铜(i)种类沉淀的方法可以包括在开始过滤之前监测氧气水平，例如在开始过滤之前监测氧气水平至少约10分钟(例如至少约15分钟)。方法可以包括在过滤期间监测do2的水平。方法可以包括在开始过滤之前监测氧气水平以及在过滤期间监测do2水平。当方法包括监测氧气水平时，将氧气水平保持在至少指定水平可以包括响应于监测的氧气水平接近指定水平而向溶液添加氧气。当方法包括监测氧气水平时，将氧气水平保持在至少指定水平可以包括响应于监测的氧气水平接近指定水平而增加向溶液供氧和/或优化过滤。可以使用任何合适的技术监测do2水平。可以用电化学氧传感器或光学氧传感器监测do2水平。do2的水平可以用电化学氧传感器监测。do2的水平可以用光学氧传感器监测。合适的氧气传感器和用于检测溶解氧的方法是技术人员已知的。参见，例如，a guide to oxygen measurement:theory and practice of oxygen applications,mettler-toledo gmbh,2016；wei,y.,等人,“review of dissolved oxygen detection technology:from laboratory analysis to online intelligent detection”,sensors,2019,19,3995，其各自通过引用整体并入本文。
[0176]
除了半胱氨酸氧化成胱氨酸外，培养基中的半胱氨酸也可能被半胱氨酸和丙酮酸盐缩合消耗，从而通过席夫碱中间体生成2,4-噻唑烷(sullivan mx和hess wc,the effect of pyruvic acid on the estimation of cystine and cysteine,the journal of biological chemistry,1937,122；nishiuch y,等人,cytotoxicity of cysteine in culture media,in vitro,1976,12(9)；rohac r,等人,carbon
–
sulfur bond-forming reaction catalysed by the radical sam enzyme hyde,nature chemistry,2016,8(5),491-500；其各自通过引用整体并入本文)。先前已证明该反应发生在含有半胱氨酸和丙酮酸盐的细胞培养基中，质谱证实了2,4噻唑烷产物(kuschelewski j,等人,antioxidant effect of thiazolidine molecules in cell culture media improves stability and performance,biotechnology progress,2017；其通过引用整体并入本文)这提供了另一种可用于防止铜损失的方法。如果半胱氨酸在竞争反应中发生反应，例如通过与丙酮酸盐缩合，则不能将铜(ii)还原为不溶性铜(i)形式。话虽如此，但如果半胱氨酸与铜(ii)和丙酮
酸盐二者都存在，则两种反应都可能发生，因此一些可溶性铜(ii)可能仍会从溶液中损失。
[0177]
如果细胞培养基、饲料或添加剂旨在与能够有效代谢半胱氨酸衍生物的细胞一起使用，在将铜(ii)添加至溶液之前则可以通过提供实质上作为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物的半胱氨酸来避免可溶性铜的损失。例如，半胱氨酸可以包含少于约1mm的游离半胱氨酸，例如半胱氨酸可以包含少于0.5mm的游离半胱氨酸(或少于0.1mm的游离半胱氨酸)。不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物不与铜(ii)反应形成不溶性铜(i)。然而，该方法不如本文公开的防止可溶性铜损失的其他方法适用，在本文公开的方法中培养基、饲料或添加剂旨在与不能有效代谢此类半胱氨酸衍生物的细胞一起使用。
[0178]
半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物、噻唑烷部分或受保护的硫基团。半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物和/或噻唑烷部分。半胱氨酸衍生物可以包含二硫化物。例如，半胱氨酸衍生物可以包括胱氨酸、s-磺基半胱氨酸、s-磺基半胱氨酰甘氨酸、l-半胱氨酸混合二硫化物和/或s-磺基谷胱甘肽。半胱氨酸衍生物可以包括胱氨酸。半胱氨酸衍生物可以包含噻唑烷部分。例如，半胱氨酸衍生物可以包括4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-羧酸盐、2-甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、2-(2-羧基乙基)21,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、l-2-氧代噻唑烷-4-甲酸、2-烷基-噻唑烷-4(r)-甲酸、2-芳基-噻唑烷-4(r)-甲酸和基于碳水化合物的噻唑烷(例如d-核糖-l-半胱氨酸)。半胱氨酸衍生物可以包括4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-羧酸盐。半胱氨酸衍生物可以包含以下项中的至少一项：胱氨酸、4-羧基-2-甲基噻唑烷-2-甲酸盐、s-磺基半胱氨酸、s-磺基半胱氨酰甘氨酸、半胱氨酸s-连接的n-乙酰葡萄糖胺(glcnac-cys)、同型半胱氨酸、l-半胱氨酸混合的二硫化物、l-半胱氨酸混合的肽、s-烷基化半胱氨酸、具有硫醇保护基团的半胱氨酸(例如fmoc保护的半胱氨酸)、2-甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、2-(2-羧基乙基)21,3-噻唑烷-2,4-二甲酸、还原型和氧化型谷胱甘肽(gsh)、s-磺基谷胱甘肽、s-酰基-gsh、s-羧基-l-半胱氨酸、l-2-氧代噻唑烷-4-甲酸、2-烷基-噻唑烷-4(r)-甲酸、2-芳基-噻唑烷-4(r)-甲酸或基于碳水化合物的噻唑烷(例如d-核糖-l-半胱氨酸)。
[0179]
铜能以铜(ii)螯合物的形式提供。螯合物可以包含选自以下项的至少一种螯合剂：乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、新亚铜试剂、浴铜灵、d-青霉胺、三亚乙基四胺(teta)、二巯基丙醇(bal)、8-羟基喹啉、氯碘羟喹和5,7-二氯-2-[(二甲基氨基)甲基]-8-喹啉醇(pbt2)。不希望受任何理论束缚，认为具有铜(ii)螯合物形式的铜防止铜明显还原成铜(i)，从而避免可溶性铜从溶液中损失。
[0180]
防止细胞培养基、饲料或添加剂中铜损失的另一种方法是分别过滤铜(ii)和半胱氨酸溶液，然后将两种经过滤的溶液混合形成最终溶液。这可以通过提供半胱氨酸溶液中的大部分试剂和体积，过滤该溶液，然后添加一团经过滤的铜溶液来完成。这可能是有利的，因为铜是在最终溶液中通常以相对低浓度提供的痕量元素。另一种方法是在一个过滤溶液中提供铜和大部分组分，然后添加经过滤的半胱氨酸溶液以形成最终溶液。如本领域技术人员将理解单独过滤然后合并经过滤溶液的各种排列和组合，最终经过滤的培养基、饲料或添加剂可用于此类方法中，条件是铜(ii)和半胱氨酸溶液单独过滤。此外，如果需要最终无菌溶液，则应以无菌方式处理经过滤的溶液。
[0181]
这可以防止铜(ii)和半胱氨酸在过滤之前或期间发生任何反应，从而形成不溶性铜(i)种类。虽然过滤后可能会形成铜(i)种类，但它会保留在培养基、饲料或添加剂中。此外，由于细胞培养涉及在培养期间向溶液添加氧气，因此任何不溶性铜(i)在培养过程中都
会被氧化成可溶性铜(ii)。因此培养基、饲料或添加剂中的所有铜都可供培养的细胞使用。
[0182]
本公开的一个方面提供了一种防止溶液中的铜损失的方法。溶液是包含铜(ii)和半胱氨酸的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。所述方法包括在过滤所述溶液之前和之后具有基本上相同量的可溶性铜。
[0183]
本公开的另一方面提供了在不损失可溶性铜的情况下制备包含铜(ii)、半胱氨酸和其他组分的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的方法。方法包括提供包含半胱氨酸和其他组分的水溶液；提供包含含铜(ii)的水溶液；分别过滤包含半胱氨酸和其他组分的水溶液和包含铜(ii)的水溶液；和将经过滤的溶液合并以提供细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。
[0184]
本公开的进一步方面提供了在不损失可溶性铜的情况下制备包含铜(ii)、半胱氨酸和其他组分的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的方法。方法包括过滤包含铜(ii)、半胱氨酸和其他组分的溶液以提供细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。
[0185]
培养和/或制造生物产物的方法
[0186]
还提供了培养细胞和/从培养细胞制造生物产物的方法。
[0187]
在哺乳动物(诸如cho)细胞中产生、回收和纯化重组抗体的方案可以包括以下步骤：
[0188]
细胞可以在搅拌罐生物反应器系统中培养，并采用分批供料培养工序。在优选的供料分批培养中，最初将哺乳动物宿主细胞和培养基供应至培养皿，并且在培养期间将另外的培养营养物连续或以不连续的增量供料至培养物，在终止培养之前进行或不进行定期的细胞和/或产物收获。供料分批培养可以包括例如半连续供料分批培养，其中周期性地去除全培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基代替。供料分批培养与简单分配培养的区别之处在于，在供料分批培养中，在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应至培养皿。供料分批培养可以进一步与灌注培养区别开来，因为在供料分批培养过程中上清液没有从培养容器中去除(在灌注培养中，细胞通过例如过滤、封装、锚定到微载体等而被限制在培养物中，并且培养基连续或间歇地引入并从培养容器中去除)。
[0189]
此外，培养物中的细胞可以根据适用于特定宿主细胞和预期的特定生产计划的任何方案或程序进行增殖。因此，可以采用单一步骤或多个步骤的培养工序。在单一步骤的培养中，将宿主细胞接种到培养环境中，并且在细胞培养的单个生产期内采用这些过程。替代地，可以使用多阶段培养。在多阶段培养中，细胞可以在多个步骤或时期内培养。例如，细胞可以在第一步或生长期培养中生长，其中将可能从储存中取出的细胞接种到适合促进生长和高活力的培养基中。通过向宿主细胞培养物中添加新鲜培养基，可以将细胞维持在生长期一段合适的时间。
[0190]
可以设计供料分批或连续细胞培养条件以增强哺乳动物细胞在细胞培养的生长期内的生长。在生长期，细胞在使生长最大化的条件下生长一段时间。培养条件，诸如温度、ph、溶解氧(do2)等，是那些与特定宿主一起使用的条件，且对普通技术人员而言将会是显而易见的。通常，使用酸(例如co2)或碱(例如na2co3或naoh)将ph调节到约6.5与7.5之间的水平。用于培养哺乳动物细胞诸如cho细胞的合适温度范围为约30℃至38℃，而合适的do2在空气饱和度的5％-90％之间。
[0191]
在特定阶段，细胞可用于接种细胞培养的生产期或步骤。替代地，如上所述，生产阶段或步骤可以与接种或生长期或步骤连续。
[0192]
细胞培养的生产阶段的细胞培养环境通常是受控的。因此，如果产生糖蛋白，则可以控制影响哺乳动物宿主细胞的细胞单位生产力的因素，从而在所得糖蛋白中达到所需的唾液酸含量。在优选的方面，细胞培养过程的生产阶段之前是细胞培养的过渡阶段，在其中涉及细胞培养的生产阶段的参数。此过程的进一步细节可见于美国专利号5,721,121和chaderjian等人,biotechnol.prog.21(2):550-3(2005)中，其全部公开内容通过引用明确并入本文。
[0193]
在培养足够长的时间后，可以纯化生物产物，诸如表达的蛋白质。从细胞碎片纯化蛋白质或其他产物的工序最初取决于蛋白质的表达位点。一些蛋白质或其他产物可以直接从细胞分泌到周围的生长培养基中；其他则是在细胞内制造的。对于后者，纯化过程的第一步涉及细胞裂解，这可以通过多种方法完成，包括机械剪切、渗透冲击或酶处理。此类破坏将细胞的全部内容物释放到匀浆中，此外还会产生由于大小较小而难以去除的亚细胞碎片。这些通常通过差速离心或过滤除去。由于在生物产物(例如蛋白质)生产运行中细胞的自然死亡和细胞内宿主细胞蛋白质和组分的释放，伴随直接分泌的蛋白质也会出现同样的问题，尽管其规模较小。
[0194]
一旦获得了含有目标生物产物(例如蛋白质)的澄清溶液，通常尝试使用不同色谱技术的组合将其与由细胞产生的其他组分分离。这些技术根据产物的电荷、疏水程度或大小来分离产物混合物。几种不同的色谱树脂可用于这些技术中的每一种，从而可以根据所涉及的特定产物精确定制纯化方案。这些分离方法的本质是蛋白质或类似种类能以不同的速率沿着长柱移动，从而实现随着它们进一步向下通过柱而增加的物理分离，或者选择性地粘附到分离介质，然后被不同的溶剂进行不同的洗脱。在一些情况下，当杂质特异性粘附至柱而目标蛋白质没有粘附至柱时，期望的蛋白质与杂质分离，即目标蛋白质存在于“流通”中。因此，从宿主细胞的细胞培养物中纯化重组蛋白可以包括一个或多个亲和(例如蛋白a)和/或离子交换色谱步骤。
[0195]
除哺乳动物宿主细胞外，其他真核生物也可用作表达生物产物(诸如重组蛋白)的宿主细胞。为了在酵母宿主细胞诸如普通面包酵母或酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中表达，合适的载体包括基于2微米质粒的附加型复制载体、整合载体和酵母人工染色体(yac)载体。适合重组生产异源蛋白质的其他酵母包括粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)(beach和nurse,nature,290:140(1981)；ep 139,383，1985年5月2日公开)；克鲁维酵母属(kluyveromyces)宿主(美国专利号4,943,529；fleer等人,bio/technology,2:968 975(1991))诸如例如，乳酸克鲁维酵母(k.lactis)(mw98-8c,cbs683,cbs4574；louvencourt等人,j.bacteriol.,737(1983))、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)(atcc 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(k.bulgaricus)(atcc 16,045)、威克克鲁维酵母(k.wickeramii)(atcc 24,178)、k.waltii(atcc 56,500)、果蝇克鲁维酵母(k.drosophilarum)(atcc 36,906；van den berg等人,bio/technology,8:135(1990))、k.thermotolerans以及马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(ep 402,226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(ep 183,070；sreekrishna等人,j.basic microbiol.,28:265 278(1988))；假丝酵母(candida)；里氏木霉(trichoderma reesia)
(ep 244,234)；粗糙脉孢菌(neurospora crassa)(case等人,proc.natl.acad.sci.usa,76:5259 5263(1979))；许旺酵母属(schwanniomyces)如许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)(ep 394,538，公开于1990年10月31日)；以及丝状真菌诸如例如，脉孢菌属(neurospora)、青霉属(penicillium)、弯颈霉属(tolypocladium)(wo 91/00357，公开于1991年1月10日)和曲霉属(aspergillus)宿主如构巢曲霉(a.nidulans)(ballance等人,biochem.biophys.res.commun.,112:284289(1983)；tilburn等人,gene,26:205 221(1983)；yelton等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:1470 1474(1984))和黑曲霉(a.niger)(kelly和hynes,embo j.,4:475 479(1985))；其各自通过引用整体并入本文。甲基营养型酵母在本文中是合适的并且包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母，选自汉逊酵母属(hansenula)、假丝酵母属(candida)、克氏酵母属(kloeckera)、毕赤酵母属(pichia)、酵母属(saccharomyces)、圆酵母属(torulopsis)和红酵母属(rhodotorula)。可在c.anthony,the biochemistry of methylotrophs,269(1982)中发现作为此类酵母的示例的特定物种的列表，其通过引用整体并入本文。所列酵母和其他酵母的表达系统在本领域是众所周知的和/或可商购的。
[0196]
对于在昆虫宿主细胞(诸如sf9细胞)中的表达，合适的载体包括杆状病毒载体。为了在植物宿主细胞，特别是双子叶植物宿主(诸如烟草)中表达，合适的表达载体包括源自根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)的ti质粒的载体。
[0197]
合适的方法还扩展到原核或古生菌宿主细胞的培养。通过本公开内容保护的适合表达抗体和其他蛋白质的原核宿主细胞和古细菌宿主细胞包括古细菌属(archaea)和真细菌属(eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。有用的细菌的示例包括大肠杆菌属(escherichia)(例如大肠杆菌(e.coli))、杆菌属(bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(b.subtilis))、肠杆菌属(enterobacteria)、假单胞菌属(pseudomonas)物种(例如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、志贺氏菌属(shigella)、根瘤菌属(rhizobia)、透明颤菌属(vitreoscilla)，或副球菌属(paracoccus)。在一个实施例中，使用革兰氏阴性细胞。大肠杆菌菌株的示例包括菌株w3110(bachmann,cellular and molecular biology,vol.2(washington,d.c.:american society for microbiology,1987),pp.1190-1219；atcc保藏号27,325)和它们的衍生物，包括菌株33d3，其具有基因型w3110δfhua(δtona)ptr3 lac iq lacl8δomptδ(nmpc-fepe)degp41 kanr(美国专利号5,639,635)。其他菌株和它们的衍生物诸如大肠杆菌294(atcc 31,446)、大肠杆菌b、大肠杆菌1 1776(atcc 31,537)和大肠杆菌rv308(atcc 31,608)也是合适的。这些实例是说明性的而不是限制性的。用于构建具有确定基因型的任何上述细菌的衍生物的方法是本领域已知的并且于例如bass等人,proteins,8:309-314(1990)中有述，其通过引用整体并入本文。考虑到复制子在细菌细胞中的可复制性，通常需要选择合适的细菌。例如，当使用众所周知的质粒诸如pbr322、pbr325、pacyc177或pkn410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门氏菌属物种可以适当地用作宿主。通常，宿主细胞应该分泌最少量的蛋白水解酶，并且可以在细胞培养物中预期加入额外的蛋白酶抑制剂。
[0198]
用于从非哺乳动物宿主细胞培养物产生、回收和纯化生物产物(诸如重组蛋白)的
方法也是本领域众所周知的。如果多肽在非哺乳动物细胞例如微生物(诸如真菌或大肠杆菌)中产生，多肽将在细胞内或周质空间中回收(kipriyanov和little,molecular biotechnology,12:173 201(1999)；skerra和pluckthun,science,240:1038 1040(1988)；其各自通过引用整体并入本文)。因此，需要通过提取(诸如细胞裂解)来将蛋白质从细胞中释放到细胞外的培养基中。此类破坏将细胞的全部内容物释放到匀浆中，此外还会产生由于大小较小而难以去除的亚细胞碎片。这些通常通过差速离心或过滤除去。
[0199]
细胞裂解通常使用机械破碎技术完成，诸如均质化或头部研磨。虽然目标蛋白质通常被有效地释放，但此类技术有几个缺点(engler,protein purification process engineering,harrison eds.,37 55(1994)，其通过引用整体并入本文)。处理期间经常发生的温度升高可能导致蛋白质失活。此外，所得悬浮液含有各种的污染蛋白质、核酸和多糖。核酸和多糖会增加溶液黏度，从而可能使通过离心、错流过滤或色谱法进行的后续处理复杂化。这些污染物与目标蛋白质的复杂关联会使纯化过程复杂化并导致不可接受的低产量。例如，美国专利号7,169,908中描述了用于从微生物发酵肉汤或匀浆中纯化异源多肽的改进方法，该专利的全部公开内容通过引用明确并入本文。
[0200]
在一方面，本公开提供了一种在培养基中培养细胞的方法。方法包括根据本发明的方法防止培养基中的铜损失，或根据本发明的方法制备培养基；使细胞与培养基接触；以及在培养基中培养细胞。
[0201]
在另一方面，本公开提供了一种制造生物产物的方法。方法包括根据本发明防止培养基中的铜损失，或根据本发明制备培养基；使被配置为表达所述生物产物的细胞与培养基接触；以及在使得细胞表达生物产物的条件下，在培养基中培养细胞。
[0202]
进一步方面提供了本发明的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂用于培养细胞的用途。
[0203]
需要强调的是，本文所述的培养、发酵、制备生物产物的方法、回收和纯化方法仅用于说明目的。所公开的方法可以与为重组蛋白质或其他生物产物的产生、回收和纯化而开发的任何制造工艺相结合。
[0204]
测定
[0205]
半胱氨酸(单体)定量分析
[0206]
半胱氨酸的浓度可以使用针对游离硫醇的ellman试剂测定来确定，该方法通常用于在半胱氨酸氧化的情况下测量半胱氨酸(smith rc,等人,oxidation of thiols by copper(ii).phosphorus,sulfur,and silicon and the related elements.1994；90(1-4):147-154；和munday r,等人,inhibition of copper-catalyzed cysteine oxidation by nanomolar concentrations of iron salts.free radical biology and medicine.2004；36(6):757-764；其各自通过引用整体并入本文)。通过将ellman试剂(dtnb,sigma aldrich)添加到培养基并测量412nm处的吸光度来进行测定。使用比尔定律和13,600m-1
cm-1
的消光系数(根据ellman gl,tissue sulfhydryl groups,archives of biochemistry and biophysics,1959；82(1):70-77，其通过引用整体并入本文)，读数被转换为游离硫醇的浓度。如果培养基不包含任何其他有意义浓度的游离硫醇，这这提供了半胱氨酸单体的浓度。如果存在其他游离硫醇，则需要从非半胱氨酸单体硫醇中校正获得的值，以提供半胱氨酸单体的浓度。
[0207]
针对铜(i)的浴铜灵测定
[0208]
该测定可用于确认铜(i)的存在。使用螯合剂的水溶性形式浴铜灵二磺酸(sigma aldrich)，如blair d和diehl h,bathophenanthrolinedisulfonic acid and bathocuproinedisulfonic acid,water soluble reagents for iron and copper,talanta.1961；7(3-4)中所述。浴铜灵是选择性结合cu(i)的螯合剂(参见smith g和wilkins dh,new colorimetric reagent specific for copper.analytical chemistry,1953；25(3))并防止cu(i)被氧气氧化成cu(ii)。浴铜灵-cu(i)复合物可以通过其在483nm处的吸光度进行量化，消光系数为13,300m-1
cm-1
，从而确定cu(i)的水平。
[0209]
丙酮酸盐、乙酸盐和痕量金属确定
[0210]
可以使用丙酮酸盐测定试剂盒测量丙酮酸，诸如可用于cedex bio ht仪器的丙酮酸盐测定试剂盒。该测定是酶促的，使用乳酸脱氢酶并测量nadh在340nm处的吸光度。
[0211]
可以使用离子交换色谱法测量乙酸盐。例如，乙酸盐可以用带有rfic ionpac as11-hc柱(dionex)和电导检测器的dionex 3000系列hplc确定。可以用koh梯度洗脱乙酸盐，并将样品的结果与标准曲线进行比较。
[0212]
技术人员可以使用常规的原子检测方法对痕量金属进行量化，诸如电感耦合等离子体-光学发射光谱法(icp-oes)或电感耦合等离子体-质谱法(icp-ms)。在示例性icp-oes方法中，样品可以在硝酸中稀释，然后被吸入氩等离子体中，其中痕量金属被电离。样品中的痕量金属可以通过特定波长的光谱读数来确定，并将强度读数与标准曲线进行比较以进行量化。
[0213]
针对通过过滤去除铜的测定
[0214]
对溶液(诸如细胞培养细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂)进行过滤可能会导致在过滤器上不溶性铜的损失。在从过滤器回收铜之后，可以量化去除的铜的量，例如使用上述“痕量金属确定”测定。能以任何合适的方式从过滤器回收铜。
[0215]
在过滤器由易于溶解在特定溶剂体系中的材料制成的情况下，过滤器和过滤器上存在的任何铜可以溶解在合适的溶剂中。例如，聚醚砜(pes)steriflip过滤器可以用dmso完全溶解。然后将dmso溶液稀释在5％硝酸中。通过icp-oes来量化经过滤的培养基、未过滤培养基和溶解的过滤溶液的铜含量，从而确定通过过滤从溶液中去除的铜的量。
[0216]
回收从溶液中去除的铜的另一种方法是反向流动以冲洗从过滤器去除的铜。例如，对于过滤面积为3.9cm2的millipore millex pes 0.22μm过滤器，在过滤1l培养基后，可以用50ml 5％硝酸的反向流来冲洗过滤器。经过滤的培养基、未过滤培养基和5％硝酸洗涤液的铜含量通过icp-oes进行量化。这种方法可以很容易地适用于与反向流动兼容的任何过滤器。
[0217]
可以使用的特定测定的示例如下。在2l玻璃烧杯中制备1.5l培养基，并用封口膜覆盖以尽量减少从环境中转移的氧气。将烧杯放置在具有校准的rpm设置的corning pc-620d搅拌板上。混合设置为60rpm，以保持均匀的溶液，而不会产生会增加气体转移的涡流。并入了mettler toledo inpro 6860i光学溶解氧探头和mettler toledo inpro 3253i ph/orp(氧化还原电位)传感器。通过小直径的汲取管喷射氧气或氮气来控制氧气环境。通过将40ml培养基移液到50ml锥形管中，用steriflip过滤一半体积，并通过icp-oes量化铜去除来测量铜去除。
[0218]
实例
[0219]
材料和方法
[0220]
使用化学成分确定的培养基1(cdm1)，它是专有的cho细胞培养基。该培养基化学成分确定，不含蛋白质，含有一系列氨基酸、维生素、葡萄糖、碳酸氢盐缓冲液、盐和微量元素。培养基中对这项工作很重要的两种微量元素是铁和铜。两者都以低μm浓度存在，其中铁的丰度明显高于铜。与这项工作相关的两个组分——半胱氨酸和丙酮酸盐在低毫摩尔范围内(1-10mm)，且丙酮酸盐总是多于半胱氨酸。将培养基滴定至ph 7并具有约300mosm的渗透压。
[0221]
完整的化学成分确定的培养基(cdm)配方含有许多组分。因此开发了一种简化的培养基配方来研究半胱氨酸和铜化学。该培养基保持ph、缓冲组分、离子强度、渗透压和痕量金属离子铜和铁以及半胱氨酸和已知与半胱氨酸相互作用的组分，诸如丙酮酸盐。
[0222]
本文使用的简化培养基是cdm1的最小可行产物形式，具有cdm1中存在的所有关键组分化学品、ph缓冲和氧化还原活性组分。使用cdm1和简化培养基二者进行实验允许确定具有和不具有cdm1培养基组分的完全复杂性时的效果。
[0223]
为了测试大量的条件和时间点，开发了一种高通量系统。该方法使用50ml锥形管和millipore(waltham,ma)0.22μm pes steriflip过滤器单元(除非另有说明)。制备培养基(cdm1和简化培养基)并将40ml等分到锥形管中。然后将它们储存在环境条件下，无需搅拌。在制备后的不同时间点，使用steriflip过滤一个等分试样的一半体积，留下20ml未过滤。使用icp-oes测定对经过滤和未过滤培养基的铜含量进行量化，以确定过滤过程中去除的铜。
[0224]
实例1：通过过滤去除铜的时间过程
[0225]
在cdm1培养基的培养基制备之后通过过滤去除的铜种类是瞬变的。cdm1中的胱氨酸和铜浓度在本文“表1”中定义的基础培养基的范围内。为了表征时间依赖性，我们制备了培养基，每45分钟过滤一组样品，直到不再观察到铜去除。铜去除的时间过程曲线如图1所示。最初铜是完全可溶的，不会通过过滤去除；然而，大约1小时后，铜开始通过过滤去除。12小时后，铜再次完全可过滤。在1到12小时之间，铜去除呈现u形曲线，在4到6小时之间出现最大损失约80％。这种现象是铜特有的。没有观察到培养基中其他可测量的痕量金属损失。
[0226]
为了确认不可过滤的铜是cu(i)形式，我们使用了上述“针对铜(i)的浴铜灵测定”。添加铜后四小时，含半胱氨酸的培养基对cu(i)检测呈阳性，而用胱氨酸制备的培养基的对照案例(未观察到铜损失)检测为阴性。我们的cu(ii)so4储备溶液对cu(i)也是阴性的。
[0227]
实例2：培养基组分剔除研究
[0228]
进行了培养基组分剔除研究。这些研究证实半胱氨酸是导致铜过滤去除的主要组分。当改良培养基不含半胱氨酸时，没有观察到铜损失。在使用胱氨酸(氧化二聚体形式)而不是半胱氨酸的培养基中，也未观察到过滤过程中的铜去除。我们还观察到铜损失的时间过程瞬态受到铁和丙酮酸盐的影响。铜损失与ph有关，在中性ph值附近发生最严重，但不限于特定的缓冲剂种类。
[0229]
实例3：检查半胱氨酸氧化过程
[0230]
我们通过在添加微量金属后随时间测量半胱氨酸单体浓度、do2和氧化还原电位
来监测半胱氨酸氧化过程。图2显示了半胱氨酸单体、do2、氧化还原电位的时间过程，以及半胱氨酸单体、do2和铜损曲线的叠加。基于这些曲线，铜损失似乎仅在半胱氨酸被氧化时发生。这些曲线在实验之间是一致的。
[0231]
向培养基添加金属离子会引发氧化半胱氨酸并消耗氧气的反应，从而导致do2和半胱氨酸单体立即下降。当do2变得有限时，我们观察到铜变得无法过滤，且半胱氨酸单体的减少速率明显减慢。do2保持低水平且铜保持不可过滤，直到半胱氨酸单体变得有限。一旦半胱氨酸单体耗尽，do2开始上升(作为环境扩散的结果)并且铜返回其可过滤形式。
[0232]
半胱氨酸单体的反应也可以通过测量氧化还原电位来跟踪。半胱氨酸是一种相对强的还原剂，会导致负氧化还原电位(jocelyn pc,the standard redox potential of cysteine-cystine from the thiol-disulphide exchange reaction with glutathione and lipoic acid,european journal of biochemistry,1967；2(3)，其通过引用整体并入本文)。图2c中显示了氧化还原电位曲线。最初随着氧气的消耗，氧化还原电位下降并在do为零时达到最小值。之后，随着半胱氨酸单体的消耗，氧化还原电位的降低程度减缓。随着半胱氨酸单体的浓度接近零，氧化还原电位稳定在略高于零的水平，表明存在温和的氧化环境，可能是由于胱氨酸当时存在于溶液中。
[0233]
据报道，半胱氨酸到胱氨酸的氧化反应在ph 7时具有-220mv的电位(jocelyn pc，同上)，这与我们观察到的-200mv的最小观察电位密切相关。细胞培养基通常含有其他氧化还原活性组分(例如酪氨酸)；然而，半胱氨酸似乎是测量时间段内最有影响力的组分。
[0234]
在示例制剂中，铜以cu(ii)so4的形式(高度可溶的铜(ii)形式)添加到培养基。当催化半胱氨酸氧化时，铜被转化为并保持为cu(i)，这是一种溶解性明显降低的形式。不希望受任何理论束缚，我们假设半胱氨酸氧化的cu(i)中间体(可能是与半胱氨酸/胱氨酸呈复合形式)具有低溶解度并形成通过过滤去除的沉淀物。这与许多硫醇铜具有非常低的溶解度并经常形成沉淀物的报道一致。
[0235]
garrels rm,christ cl,eh-ph diagrams.harper and row,1965的第232页(其通过引用整体并入本文)描述铜、铁和硫的水性体系的pourboix(氧化还原电位/ph)图显示在示例性培养基中观察到的条件(ph 7和氧化还原电位范围从0到-200mv)中，这3种分子至少有6种不同的形式。虽然我们不能简单地用半胱氨酸代替硫并假设出现相同的物质，但该图展示了随着氧化还原电位的变化，相互作用的复杂性和种类的瞬变性。因此，在半胱氨酸氧化过程中，可以合理地预期可能会出现许多类似的铜-铁-硫醇种类。不希望被任何理论束缚，我们建议这些形式中的一种或多种是不溶性，导致产生可以通过过滤去除的含铜沉淀物。虽然我们没有观察到半胱氨酸或铁的可测量损失，但铜通常以明显低于半胱氨酸和铁的浓度存在于细胞培养基和相关组合物中。如果以与铜相同的摩尔水平去除半胱氨酸或铁，则损失通常不会大到足以对培养基、饲料或添加剂组合物中的半胱氨酸和铁的总体水平产生明显影响。
[0236]
实例4：增加半胱氨酸浓度的影响
[0237]
研究了在具有两种不同初始半胱氨酸浓度(3mm和6mm)的培养基中铜去除的时间过程。图3a显示了使用高通量系统(未混合)在这些不同半胱氨酸浓度下的铜去除曲线，而图3b显示了小规模系统(混合)中的曲线。增加初始半胱氨酸单体延长了经由过滤去除铜的时间段。
[0238]
低do2状态和到达半胱氨酸单体耗尽的时间与铜去除一起延长。这证实了增加初始半胱氨酸延长铜去除持续时间的原因是半胱氨酸氧化发生的时间更长。
[0239]
通过调节半胱氨酸单体浓度来控制不溶性铜种类的时间框架的能力进一步支持半胱氨酸氧化作为铜去除的原因。
[0240]
实例5：低do2的影响
[0241]
对图2d的检查表明，只要将金属离子添加到培养基，半胱氨酸就会开始氧化，但是直到do2变得有限，铜才会变得不可过滤。在半胱氨酸单体变得有限后，do2开始上升，铜再次变得可过滤。似乎低do2是铜去除所必需的，并且铜需要氧气才能恢复到可过滤的形式。其中通过将氮气喷射到系统中而将do2保持在零的两个实验证实了这一点。
[0242]
在第一个实验中，在大约4小时时开始进行氮气喷射，此时半胱氨酸单体即将耗尽，然后从8小时开始将氧气缓慢地重新引入系统。图3c显示，当氮气喷射维持零do2环境时，铜去除时间延长，而一旦do2水平开始上升，由于被氧化成更易溶解的铜(ii)氧化态，铜再次变得可过滤。
[0243]
在第二个实验中，在半胱氨酸单体耗尽之前(确认其在稍后的时间点耗尽)稍早的时间点开始喷射并保持直到11小时，在此时停止氮气喷射并使用剧烈搅拌以快速增加do2。图3d显示，在该实验中，开始喷射后，铜去除的幅度增加到接近100％并保持在该水平，直到重新引入氧气。do2的快速增加导致铜过滤性同样快速恢复。
[0244]
这两个实验表明，通过将do2保持为零可以无限期地延长铜去除，并且铜需要氧气才能转化回可过滤的形式。虽然探头无法区分接近零do2的微小变化，但第二个实验还表明，当使用氮气喷射达到接近零氧的环境时，铜可以在过滤期间被定量去除。这表明我们在无氮气喷射实验中仅看到部分铜去除的原因是半胱氨酸氧化本身不足以达到零do2；痕量的氧气可能会残留，并将一部分不溶性铜(i)转化回可过滤的铜(ii)形式。
[0245]
实例6：半胱氨酸与丙酮酸盐的反应
[0246]
在典型的细胞培养基中，游离半胱氨酸可能参与两种主要的反应途径。首先是氧化成胱氨酸。其次是半胱氨酸和丙酮酸盐缩合形成2,4噻唑烷，如图4所示。这两个反应竞争半胱氨酸单体，但是使用简化的培养基制剂，我们通过去除金属离子以防止氧化反应、去除丙酮酸盐以防止缩合反应或去除金属离子和丙酮酸盐以防止这两种反应来调节正在发生的反应。然后我们观察半胱氨酸单体浓度的降低，以了解相对反应速率。图5显示了简化培养基+/-金属离子和+/-丙酮酸盐中的半胱氨酸单体曲线。
[0247]
如图4所述，半胱氨酸和丙酮酸盐的缩合反应生成一个水分子和一个氢离子以及噻唑烷。当碳酸氢盐用作缓冲物质时，由于co2的放气，很难测量ph的化学计量变化，但是当我们在简化的培养基中用mops缓冲液代替碳酸氢盐时，我们能够针对半胱氨酸转化为噻唑烷的量来测量ph的接近化学计量的下降。这表明噻唑烷形成是导致ph下降的原因，与半胱氨酸浓度成正比，这在含有半胱氨酸和丙酮酸盐的cdm的培养基保持期间观察到。
[0248]
此外，在添加半胱氨酸之前和耗尽半胱氨酸单体之后测量丙酮酸盐浓度。在没有金属离子的情况下，丙酮酸盐浓度化学计量降低了3.0mm，这与半胱氨酸降低3.0mm相关，表明完全转化为噻唑烷。此外，在没有金属离子的情况下，do2不变；提供进一步的证据表明半胱氨酸没有被氧化。
[0249]
当包括金属离子时，丙酮酸盐数据证实了两个反应之间对半胱氨酸单体的竞争。
丙酮酸盐浓度下降较少(1.7mm)，表明部分转化为噻唑烷，且我们计算出剩余的半胱氨酸(1.3mm)被氧化为胱氨酸(0.65mm)。此外，观察到半胱氨酸氧化的do2下降特性。
[0250]
虽然丙酮酸盐与铜形成不溶性种类的机制没有直接关系，但细胞培养基中丙酮酸盐的存在极大地影响了铜去除的时间过程。我们已经说明，不溶性铜种类一直保持到没有可被氧化的半胱氨酸单体，并且在氧气成为半胱氨酸氧化反应的限制因素后，与丙酮酸盐的缩合是消耗大部分剩余单体的原因。如果没有丙酮酸盐，氧化反应将是消耗半胱氨酸的唯一途径。受氧气可用性的限制，氧化反应将花费更长的时间来消耗所有的半胱氨酸，并且铜去除将具有更长的持续时间。
[0251]
当我们的简化培养基中存在丙酮酸盐和金属离子时，我们发现会生成少量乙酸盐(在我们的简化培养基中为0.12mm)。除非存在丙酮酸盐和金属离子，否则未检测到乙酸盐。如方程式1所示，半胱氨酸氧化的第一步生成过氧化氢，它可以继续氧化额外的半胱氨酸，如方程式2所示。然而，过氧化氢具有很强的反应性，可能会与一系列培养基组分相互作用。一个示例是我们观察到的丙酮酸盐氧化成乙酸。方程式7显示了该反应的典型描述方式(nath ka,等人,alpha-ketoacids scavenge h2o
2 in vitro and in vivo and reduce menadione-induced dna injury and cytotoxicity,american journal of physiology-cell physiology,1995,268(1)；giandomenico ar,等人,the importance of sodium pyruvate in assessing damage produced by hydrogen peroxide,free radical biology and medicine,1997,23(3),426-434；其各自通过引用整体并入本文)。
[0252]
丙酮酸盐+h2o2→
乙酸盐+co2+h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(7)
[0253]
方程式1-3中描述的半胱氨酸氧化的化学计量是被氧化的半胱氨酸的摩尔数比消耗的氧气的摩尔数为4:1。这假设过氧化氢与半胱氨酸完全反应。在培养基中，化学计量比小于4:1，这是由于过氧化氢倾向于与其他培养基组分(诸如丙酮酸盐)发生反应。
[0254]
实例7：过滤材料和孔径对铜的影响
[0255]
实例1-6在使用过滤器时，使用了孔径为0.22μm的聚醚砜(pes)膜过滤器。我们还测试了聚偏二氟乙烯或聚偏二氟乙烯(pvdf)和硝酸纤维素膜，孔径范围为0.22μm至8μm。我们发现过滤过程中铜的去除与膜材料或孔径无关。
[0256]
此外，我们还证明了在过滤期间去除的铜可以使用本文描述的通过过滤去除铜的测定从过滤材料回收。通过溶解过滤器，我们能够回收过滤过程中从培养基中去除的铜的99％；通过简单地反冲过滤器，我们仍然能够回收去除的铜的89％。