用于激活和扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法与流程

本公开涉及用于激活和/或扩增淋巴细胞群(例如肿瘤浸润淋巴细胞(til))的方法和组合物。

背景技术：

1、肿瘤浸润淋巴细胞是已经离开血流并且向肿瘤迁移的白细胞，包括t细胞和b细胞。肿瘤中存在淋巴细胞经常与更好的临床结果相关，并且事实上，til已涉及杀伤肿瘤细胞。til常规地用作过继细胞转移疗法来治疗某些类型的癌症。til的过继转移是治疗大块难治性癌症的有效方法，例如尤其在预后不良的患者中。在过继转移疗法中，til由手术切除的已被切成小碎片的肿瘤或由从肿瘤碎片中分离出来的单细胞悬浮液离体扩增。til扩增的常见过程需要建立多种单独的培养物、使其分开生长、并测定其特异性肿瘤识别。使用高剂量il-2在几周的过程中扩增til。然后在“快速扩增方案”(rep)中进一步扩增所选择的呈现出最佳肿瘤反应性的til系，所述方案使用抗cd3激活持续两周的典型时期。将最终的rep后的til群输注回患者体内。尽管被广泛使用，但这些冗长的til扩增方案对于扩增所有til群而言并不可靠。

技术实现思路

1、在一些方面，本文提供了til激活和/或扩增方法，其不仅通过例如进行单步骤而不是多步骤培养过程来缩短扩增til群的时间段，而且还可用于扩增不同的til群。在一些实施方案中，本文所述的方法还通过证明饲养细胞的替代方案来提供临床制造优势。

2、令人惊讶的是，在一些实施方案中，本文提供的流线型方法提供比当前的til扩增方案增加30％-50％倍数的til(例如，编辑的til)扩增，同时还支持效应t细胞的增殖和中央记忆t细胞表型的富集，即使在不存在il-2的情况下也是如此。通过本公开的方法产生的til还表达高水平的cd25(一种il-2受体)，这表明所述til对患者的内源性il-2存活信号高度敏感。本文所述的实验数据还出乎意料地显示，本公开的方法的优势适用于未修饰的和修饰的(例如，crispr/cas基因或多基因编辑的)til群。

3、本文提供的流线型方法产生高度富集的、不同的til群，并且因此可能产生更有效的过继til转移疗法。

4、本公开的一些方面提供了一种产生扩增的til群的方法，所述方法包括在包含(a)饲养细胞或t细胞共刺激分子的激动剂、(b)t细胞受体(tcr)激动剂和(c)白介素(il)-15的培养基中培养解聚的肿瘤样品，从而产生扩增的til群。

5、在一些实施方案中，培养基包含浓度大于100ng/ml的il-15。在一些实施方案中，培养基包含浓度小于1000ng/ml的il-15。在一些实施方案中，培养基包含浓度大于100ng/ml且小于1000ng/ml的il-15。

6、在一些实施方案中，培养基不包含il-2。在一些实施方案中，培养基不包含il-21。在一些实施方案中，培养基不包含il-2或il-21。

7、在一些实施方案中，培养基还包含例如浓度为10u/ml至7,000u/ml的il-7。

8、在一些实施方案中，tcr激动剂选自cd3激动剂、okt3和ucht1。在一些实施方案中，tcr激动剂是cd3激动剂。在一些实施方案中，tcr激动剂是okt3。在一些实施方案中，tcr激动剂是ucht1。

9、在一些实施方案中，cd3激动剂是抗cd3抗体。例如，抗cd3抗体可以是人源化抗cd3抗体。在一些实施方案中，cd3激动剂是包含连接在一起的两个抗cd3抗体的可溶性单特异性复合物。

10、在一些实施方案中，t细胞共刺激分子的激动剂选自：cd28激动剂、cd137激动剂、cd2激动剂以及它们的组合。在一些实施方案中，t细胞共刺激分子的激动剂是cd28激动剂。在一些实施方案中，t细胞共刺激分子的激动剂是cd137激动剂。在一些实施方案中，t细胞共刺激分子的激动剂是cd2激动剂。在一些实施方案中，t细胞共刺激分子的激动剂是cd28激动剂和cd137激动剂。在一些实施方案中，t细胞共刺激分子的激动剂是cd28激动剂和cd2激动剂。在一些实施方案中，t细胞共刺激分子的激动剂是cd137激动剂和cd2激动剂。

11、在一些实施方案中，cd28激动剂包含有包含连接在一起的两个抗cd28抗体的可溶性单特异性复合物。

12、在一些实施方案中，cd2激动剂包含有包含连接在一起的两个抗cd2抗体的可溶性单特异性复合物。

13、在一些实施方案中，tcr激动剂与包含聚合物链的基质的胶体悬浮液的纳米基质连接，其中每种基质的最大尺寸长度为1nm至500nm。在一些实施方案中，t细胞共刺激分子与包含聚合物链的基质的胶体悬浮液的纳米基质连接，其中每种基质的最大尺寸长度为1nm至500nm。

14、在一些实施方案中，解聚的肿瘤样品包括例如通过解剖方法生成的大小为0.5mm3至4mm3的肿瘤碎片。在一些实施方案中，解聚的肿瘤样品包括例如通过机械方法生成的大小为25mm3至30mm3的肿瘤碎片。在一些实施方案中，肿瘤碎片包括消化的肿瘤碎片。

15、在一些实施方案中，扩增的til群的细胞是遗传修饰的。在一些实施方案中，扩增的til群的细胞是表观遗传修饰的。

16、在一些实施方案中，产生扩增的til群的方法包括使用基因调控系统对扩增的til群的细胞进行遗传修饰，所述基因调控系统例如选自包含rna干扰(rnai)分子、类转录激活因子效应物核酸酶(talen)、锌指核酸酶(zfn)和rna指导的核酸酶的基因调控系统。在一些实施方案中，基因调控系统包含rnai分子。在一些实施方案中，基因调控系统包含talen。在一些实施方案中，基因调控系统包含zfn。在一些实施方案中，基因调控系统包含rna指导的核酸酶。在一些实施方案中，基因调控系统包含cas酶(例如cas9酶)和指导rna。

17、在一些实施方案中，til群的细胞在选自以下的一种或多种基因处包含修饰，例如插入、缺失、插入缺失或取代：ankrd11、bcl2l11、bcl3、bcor、calm2、cblb、chic2、ctla4、dhodh、e2f8、egr2、fli1、foxp3、gata3、gnas、havcr2、ikzf1、ikzf2、ikzf3、lag3、map4k、nfkbia、nr4a3、nrp1、pbrm1、pcbp1、pdcd1、peli1、pik3cd、ppp2r2d、ptpn1、ptpn2、ptpn22、ptpn6、rbm39、rc3h1、sema7a、serpina3、setd5、sh2b3、sh2d1a、smad2、socs1、tank、tgfbr1、tgfbr2、tigit、tnfaip3、tnip1、traf6、umps、wdr6和zc3h12a。在一些实施方案中，修饰导致所述一种或多种基因的表达的降低或抑制和/或由所述一种或多种基因编码的一种或多种蛋白质的功能的降低或抑制。在一些实施方案中，til群的细胞包含socs1基因和zc3h12a基因处的修饰，任选的插入、缺失、插入缺失或取代。

18、在一些实施方案中，在培养期间更换培养基的至少一部分。在一些实施方案中，在培养期间用il-15补充培养基的至少一部分。

19、在一些实施方案中，培养发生在9天至25天的时间段内。在一些实施方案中，培养发生在9天至21天的时间段内。在一些实施方案中，培养发生在9天至14天的时间段内。

20、在一些实施方案中，扩增的til群的至少10％具有中央记忆t细胞表型。在一些实施方案中，扩增的til群的至少15％具有中央记忆t细胞表型。

21、本公开的其他方面提供了一种产生扩增的til群的方法，所述方法包括：在包含t细胞刺激细胞因子的第一培养基中培养解聚的肿瘤样品以产生til群；以及在包含饲养细胞或t细胞共刺激分子的激动剂、tcr激动剂和il-15的第二培养基中培养til群的细胞，从而产生扩增的til群。在一些实施方案中，所述方法还包括使用基因调控系统对来自第一培养基的til群的细胞进行修饰以产生修饰的til亚群，其中在第二培养基中培养的til群包括修饰的til亚群。在一些实施方案中，第一培养基不包含il-2。在一些实施方案中，第二培养基不包含il-2。在一些实施方案中，第一培养基和第二培养基都不包含il-2。

22、本公开的又其他方面提供了一种用于扩增til群的方法，其包括：在包含(a)il-15和(b)包含聚合物链的基质的胶体悬浮液的纳米基质的培养基中培养til群，其中基质附接至tcr激动剂和t细胞共刺激分子的激动剂，每种基质的最大尺寸长度为1nm至500nm，并且任选地所述方法不包括在扩增til群期间使用饲养细胞。

23、本公开的仍其他方面提供了一种用于扩增til群的方法，其包括：在包含(a)il-15、(b)包含抗cd3抗体或其片段的第一可溶性单特异性复合物、(c)包含抗cd28抗体或其片段的第二可溶性单特异性复合物和(d)包含抗cd2抗体或其片段的第三可溶性单特异性复合物的培养基中培养til群，其中可溶性单特异性复合物中的每一种包含连接在一起的两种抗体或其片段，并且可溶性单特异性复合物中的每一种的每种抗体或其片段与til群上的相同抗原特异性结合。

24、在一些方面，本文还提供了组合物，其包含通过前述段落中任一个所述的方法产生的扩增的til群。

25、一些方面提供了包含培养基中的解聚的肿瘤样品的组合物，所述培养基包含(a)饲养细胞、(b)t细胞受体(tcr)激动剂和(c)例如浓度大于100ng/ml且小于1000ng/ml的白介素(il)-15。其他方面提供了包含培养基中的解聚的肿瘤样品的组合物，所述培养基包含(a)t细胞共刺激分子的激动剂、(b)t细胞受体(tcr)激动剂和(c)例如浓度大于100ng/ml且小于1000ng/ml的白介素(il)-15。又其他方面提供了包含培养基中的til的组合物，所述培养基包含(a)饲养细胞、(b)t细胞受体(tcr)激动剂和(c)例如浓度大于100ng/ml且小于1000ng/ml的白介素(il)-15。仍其他方面提供了包含培养基中的til的组合物，所述培养基包含(a)t细胞共刺激分子的激动剂、(b)t细胞受体(tcr)激动剂和(c)例如浓度大于100ng/ml且小于1000ng/ml的白介素(il)-15。在一些实施方案中，组合物不包含il-2。