质谱用咪唑鎓试剂的制作方法

1.本发明涉及适合在质谱中使用的化合物、包含所述化合物的组合物、包含所述组合物和/或化合物的试剂盒，以及复合物。此外，本发明涉及使用所述化合物对分析物进行质谱测定的方法。


背景技术：

2.质谱(ms)是一种在小分子至大分子化学物质的定性和定量分析中广泛使用的技术。通常，它是非常灵敏且特异性的方法，甚至允许对复杂的生物样品(例如环境样品或临床样品)进行分析。然而，对于若干种分析物，特别是如果从复杂的生物基质(例如血清)来进行分析，则测量的灵敏度仍是问题。
3.ms通常与色谱技术(特别是气相色谱和液相色谱，例如hplc)组合使用。此处，将经过分析的目标分子(分析物)进行色谱分离，并且各自进行质谱分析(higashi等人，(2016)j.of pharmaceutical and biomedical analysis，第130卷，第181-190页)。
4.然而，仍需要增加ms分析方法的灵敏度，特别是用于对低丰度分析物进行分析或当仅能获取少量材料(例如活检组织)时。
5.本领域中，已知若干种旨在改善这些分析物的测量灵敏度的衍生化试剂(化合物)。其中，试剂包含组合在单个功能性单元中的带电荷的单元和中性丢失单元(例如，wo 2011/091436 a1)。其他包含独立单元的试剂在结构上相对较大，这影响样品制备和ms测量的一般工作流程(rahimoff等人，(2017)j.am.chem.soc.139(30)，第10359至10364页)。已知的衍生化试剂为例如丹磺酰氯、rapifluor-ms(rfms)、cookson型试剂、amplifex二烯、amplifex酮、girard t、girard p、吡啶胺(hong和wang，anal chem.，2007，79(1)：322-326；frey等人，steroids，2016年12月，116：60-66；francis等人，journal of pharmaceutical and biomedical analysis，2005，39(3-4)，411-417；alley william，28th international carbohydrate symposium，new orleans，la，united states，2016年7月17日至21日，ics-209)。所有这些均存在以下问题：由于标记效率往往不足而导致的缺点、由于偶合化学反应而导致结构异构体的生成、非优化的离子化效率、在偶合后进行色谱分离的缺点、由于裂解途径众多而导致的非优化的裂解行为以及需要高碰撞能量。
6.本领域中迫切需要能够灵敏地检测复杂生物基质中的分析物并且表现对ms测量工作流程无不利影响的化学结构的衍生化试剂。这在随机存取的高通量ms设置中尤为重要，其中不得不在短时间内测量表现出不同化学特性的若干种不同分析物。
7.本发明涉及一种新型试剂(化合物)，其允许对生物学样品中的分析物分子(诸如类固醇、蛋白质和其他类型的分析物)进行灵敏的测定。该试剂以模块化方式设计，以允许针对某些分析物的测量中出现的具体需求或针对具体工作流程调整进行个别调整。
8.本发明的一个目的是提供式i化合物、试剂盒和组合物，它们中的每一者均包含所述化合物，以用于通过质谱来有效地检测分析物。此外，本发明的一个目的是提供用于分析物的质谱测定的复合物和方法。
9.该目的或这些目的通过独立权利要求的主题来解决。其他实施例受从属权利要求制约。


技术实现要素：

10.在下文中，本发明涉及以下方面：
11.在第一方面，本发明涉及用于分析物的质谱测定的式i化合物：
[0012][0013]
其中取代基b1、b2、b4中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团q，
[0014]
其中其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b4各自独立地选自氢、卤素、烷基、n-酰基氨基、n，n-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基(aryloyl)、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基(aryloyloxy)、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、其同位素或衍生物，
[0015]
其中b3选自烷基、乙酰基、乙烯基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的苄基、未取代的苄基、经取代的环烷基、未取代的环烷基、其同位素和衍生物，
[0016]
其中y1和y2各自独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族、胺，或者其中y1和y2形成选自经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族的环结构。
[0017]
在第二方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含本发明的第一方面的化合物。
[0018]
在第三方面，本发明涉及包含本发明的第一方面的化合物或本发明的第二方面的组合物的试剂盒。
[0019]
在第四方面，本发明涉及用于使用质谱测定来检测分析物的复合物，其包含彼此共价连接的结合分析物和结合化合物，特别是其中通过分析物与本发明的第二方面的化合物的化学反应来形成该复合物。
[0020]
在第五方面，本发明涉及本发明的第一方面的化合物用于分析物的质谱测定的用途。
[0021]
在第六方面，本发明涉及用于分析物的质谱测定的方法，该方法包括以下步骤：
[0022]
(a)使分析物与本发明的第一方面的式i化合物反应，由此形成本发明的第四方面的复合物，
[0023]
(b)对来自步骤(a)的复合物进行质谱分析。
[0024]
在第七方面，本发明涉及式v化合物：
[0025][0026]
其中取代基b1、b2、b4中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团q，
[0027]
其中其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b4各自独立地选自氢、卤素、烷基、n-酰基氨基、n，n-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基(aryloyl)、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基(aryloyloxy)、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、其同位素或衍生物，
[0028]
其中b3选自烷基、乙酰基、乙烯基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的苄基、未取代的苄基、经取代的环烷基、未取代的环烷基、其同位素和衍生物，
[0029]
其中y1和y2各自独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族、胺，或者其中y1和y2形成选自经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族的环结构。
附图说明
[0030]
图1示出了峰“分裂”的示意图：它描述了色谱系统将由分析物分子的衍生化反应而产生的不同异构体彼此分离的能力。
[0031]
图2示出了确定lod增强因子的工作流程的示意图。
具体实施方式
[0032]
在下文详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所述的特定实施例和示例，因为这些实施例和示例可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外指明，否则本文所用的所有科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
[0033]
在本说明书全文中引用了若干文档。本文所引用的文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明等)中的每一篇，无论上文或下文中引用，均以引用方式整体并入本文。在此类并入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或
教导之间矛盾时，以本说明书文本为准。
[0034]
下面将描述本发明的元件。这些元件与具体实施例一起列出，然而，应理解，它们可以任何方式和任何数目组合以创建另外的实施例。各种描述的实例和优选实施例不应解释为仅将本发明限制为明确描述的实施例。此描述应理解为支持并且涵盖将明确描述的实施例与任何数目的所公开和/或优选元件组合的实施例。此外，除非上下文另有指示，否则本技术中所有所描述元件的任何排列和组合均应视为由本技术的说明书公开。
[0035]
定义
[0036]
词语“包含(comprise)”以及诸如“包括(comprises和comprising)”的变体应被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或整数组或步骤组，但不排除任何其他的整数或步骤或整数组或步骤组。
[0037]
如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物。
[0038]
百分比、浓度、量和其他数值数据在本文中均可以以“范围”格式表达或呈现。应当理解，此类范围格式仅出于方便和简洁而使用，因此应灵活地解释为不仅包括明确列举为范围限值的数值，而且包括该范围所涵盖的所有单独的数值或子范围，就如同明确列举出每个数值和子范围一样。作为例示，数值范围“4％至20％”应解释为不仅包括明确列举出的4％至20％的值，而且包括所示范围内的各个值和子范围。因此，该数值范围中包括各个值诸如4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％...18％、19％、20％以及子范围，诸如从4％-10％、5％-15％、10％-20％等。该同一原则适用于列举最小值或最大值的范围。此外，无论所述范围或特征的广度如何，均适用此类解释。
[0039]
当与数值结合使用时，术语“约”意指涵盖具有比所示数值小5％的下限以及具有比所示数值大5％的上限的范围内的数值。
[0040]
在本发明的上下文中，术语“化合物”是指具有特异性化学结构的化学物质。所述化合物可以包含一个或多个反应性基团。每个反应性基团履行不同的功能性，或者两个或更多个反应性基团可以履行相同功能。反应性基团包括但不限于反应性单元、带电荷的单元和中性丢失单元。在本发明的上下文中，术语“结合化合物”是指与分析物键合的所述化合物。原则上，化合物和结合化合物可以相同。化合物和结合化合物可以基本上相同。基本上相同可以意味着两种化合物均具有相同的化学结构，不同之处在于它们在反应性单元k的结构和/或偶联基团q的结构方面彼此不同。优选地，化合物能够形成与分析物的结合，但尚未与分析物结合。结合化合物与分析物结合。
[0041]
术语“质谱(mass spectrometry)”(“mass spec”或“ms”)或“质谱测定”或“质谱分析(mass spectrometric analysis)”涉及通过化合物的质量用于鉴别该化合物的分析技术。ms是基于离子的质荷比或“m/z”来过滤、检测和测量离子的方法。ms技术通常包括(1)将化合物离子化以形成带电化合物；以及(2)检测该带电化合物的分子量并计算质荷比。化合物可通过任何合适的手段来离子化并检测。“质谱仪”通常包括电离器和离子检测器。通常，将一个或多个目标分子离子化，后续将离子引入质谱仪器中，在该仪器中，由于磁场和电场的组合，离子遵循取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的空间路径。术语“离子化”或“电离”是指生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是那些具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正电荷是那些具有一个或多个电子单位的净正电荷
的离子。ms方法既可以在生成并且检测负离子的“负离子模式”下执行，也可以在生成并且检测正离子的“正离子模式”下执行。
[0042]“串联质谱”或“ms/ms”涉及多个质谱选择步骤，其中分析物的裂解在各级之间发生。在串联质谱仪中，离子在离子源中形成，并且在第一级质谱(ms1)中按质荷比将其分离。选择特定质荷比的离子(前体离子或母离子)，并通过碰撞诱导解离、离子-分子反应或光解离产生碎片离子(或子离子)。然后，在二级质谱分析(ms2)中分离并检测所得离子。
[0043]
由于质谱仪分离并检测质量略有差异的离子，它容易区分给定元素的不同同位素。因此，质谱分析是对包括但不限于低分子量分析物、肽、多肽或蛋白质的分析物进行精确质量测定和表征的重要方法。其应用包括蛋白质及其翻译后修饰的鉴别；蛋白质复合物、其亚基和功能性相互作用的阐明；以及蛋白质组学中蛋白质的全局测量。通常无需事先了解氨基酸序列，即可通过质谱法对肽或蛋白质进行从头测序。
[0044]
ms中的大多数样品工作流程进一步包括样品制备和/或富集步骤，其中例如使用例如气相色谱法或液相色谱法将一种或多种目标分析物从基质中分离出来。通常，在质谱测量中执行以下三个步骤：
[0045]
1.将包含目标分析物的样品离子化，通常通过与阳离子形成复合物来进行，经常通过质子化为阳离子。电离源包括但不限于电喷雾离子化(esi)和大气压化学离子化(apci)。
[0046]
2.根据离子的质量和电荷对离子进行分选和分离。可使用高场不对称波形离子迁移谱(faims)作为离子过滤器。
[0047]
3.然后，例如以多反应模式(mrm)检测所分离的离子，并将结果展示在图表上。
[0048]
术语“电喷雾离子化”或“esi”是指如下方法：在该方法中，溶液沿着短毛细管行进至被施加高正电位或高负电位的末端。到达该管末端的溶液被蒸发(雾化)成在溶剂蒸汽中存在非常小的溶液液滴的喷射或喷雾。此液滴雾流经蒸发室，将该蒸发室略微加热以防止冷凝并且蒸发溶剂。随着液滴变得更小，表面电荷密度增加，直到同类电荷之间的天然斥力造成离子以及中性分子得以释放。
[0049]
术语“大气压化学离子化”或“apci”是指与esi类似的质谱方法，然而apci通过在大气压下于等离子体内发生的离子-分子反应来产生离子。通过喷雾毛细管与对电极之间的放电来维持等离子体。然后，通常使用一组差分泵分级分离器将离子提取至质量分析仪中。可使用干燥且预热的氮气逆流以改善溶剂的移除。对于分析极性较低的实体，apci中的气相离子化可能比esi更有效。
[0050]“高场不对称波形离子迁移谱(faims)”是一种大气压离子迁移技术，该技术通过它们在强电场和弱电场中的行为来分离气相离子。
[0051]“多反应模式”或“mrm”是ms仪器的一种检测模式，在该模式下，选择性地检测前体离子和一种或多种碎片离子。
[0052]
质谱测定可与额外的分析方法组合使用，这些方法包括色谱方法诸如气相色谱法(gc)、液相色谱法(lc)(特别是hplc)和/或基于离子迁移率的分离技术。
[0053]
在本公开的上下文中，术语“分析物”、“分析物分子”或“目标分析物”可互换使用，其是指待经由质谱的化学物质。适合经由质谱的化学物质，即分析物，可以是活体生物体中存在的任何种类的分子，包括但不限于核酸(例如，dna、mrna、mirna、rrna等)、氨基酸、肽、
蛋白质(例如，细胞表面受体、胞质蛋白等)、代谢物或激素(例如，睾酮、雌激素、雌二醇等)、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物(例如，维生素d)、以另一分子的某一修饰(例如，蛋白质上的糖部分或磷酰残基、基因组dna上的甲基残基)为特征的分子或已经由生物体内化的物质(例如，治疗性药物、滥用的药物、毒素等)或此类物质的代谢物。此类分析物可用作生物标志物。在本发明的上下文中，术语“生物标志物”是指生物学系统内的物质，其用作所述系统的生物学状态的指示物。在本发明的上下文中，术语“结合分析物”是指与化合物键合以用于形成复合物的所述分析物。原则上，分析物和结合分析物可以相同。分析物和结合分析物可以基本上相同。基本上相同可以意味着两种分析物具有相同的化学结构，不同之处在于它们在官能团的结构方面彼此不同。优选地，分析物能够形成与化合物的结合，但尚未与化合物结合。结合分析物与化合物结合。
[0054]
术语“带永久正电荷”在本公开的上下文中使用，即咪唑鎓单元的正电荷不容易例如经由冲洗、稀释、过滤等而发生可逆过程。永久正电荷可能为例如共价键合的结果。永久正电荷与可能为例如静电相互作用的结果的可逆正电荷(非永久正电荷)形成对比。
[0055]
术语“检测限”或“lod”是生物分析过程可将分析物与背景噪声轻易区分时的分析物最低浓度。
[0056]
分析物可存在于目标样品(例如生物学样品或临床样品)中。术语“样品”或“目标样品”在本文中可互换使用，其是指组织、器官或个体的一部分或切片，通常小于此类组织、器官或个体，旨在代表整个组织、器官或个体。在分析时，样品提供关于组织状态或者器官或个体的健康或患病状态的信息。样品的实例包括但不限于：流体样品，诸如血液、血清、血浆、滑液、脊髓液、尿液、唾液和淋巴液；或固体样品，诸如干血斑和组织提取物。样品的其他实例为细胞培养物或组织培养物。
[0057]
在本公开的上下文中，样品可以衍生自“个体”或“受试者”。通常地，受试者是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。
[0058]
在经由质谱进行分析之前，可按照针对特定样品和/或分析物的方式对样品进行预处理。在本公开的上下文中，术语“预处理”是指允许经由质谱对所期望的分析物进行后续分析所需的任何措施。预处理措施通常包括但不限于，洗脱固体样品(例如，洗脱干血斑)、将溶血试剂(hr)添加到全血液样品中、以及将酶试剂添加到尿液样品中。另外，添加内标(istd)也被视为样品的预处理。
[0059]
术语“溶血试剂(hr)”是指裂解样品中存在的细胞的试剂，在本发明的上下文中，溶血试剂特别是指裂解血液样品中存在的细胞(包括但不限于，全血液样品中存在的红细胞)的试剂。众所周知的溶血试剂是水(h2o)。溶血试剂的其他实例包括但不限于去离子水、高渗透性液体(例如，8m尿素)、离子液体和不同的清洗剂。
[0060]
通常地，“内标”(istd)是已知量的物质，当经历质谱检测工作流程(即，包括任何预处理、富集和实际检测步骤)时，其表现出与目标分析物类似的特性。尽管istd表现出与目标分析物类似的特性，但是它仍然与目标分析物明显地区分开来。举例而言，在色谱分离诸如气相色谱和液相色谱过程中，istd具有大致与来自样品中的目标分析物相同的保留时间。因此，分析物和istd两者均同时进入质谱仪中。然而，istd表现出与来自样品的目标分析物不同的分子质量。这使得在来自istd的离子与来自分析物的离子之间能够通过其不同
的质荷(m/z)比进行质谱区分。两者均经历裂解并提供子离子。这些子离子可通过其m/z比而彼此区分并与各自的母离子区分。因此，可对istd和分析物的信号进行单独的测定和定量。由于istd的添加的量是已知的，因此来自样品的分析物的信号强度可归因于该分析物的具体定量性的量。因此，添加istd允许对所检测的分析物的量进行相对比较，并且当一种或多种分析物到达质谱仪时，能够对样品中存在的一种或多种目标分析物进行明确鉴定和定量。通常但不一定，istd是目标分析物的同位素标记的变体(包含例如2h、
13
c或
15
n等标记)。
[0061]
除预处理以外，样品还可经过一个或多个富集步骤处理。在本公开的上下文中，术语“第一富集过程”或“第一富集工作流程”是指在样品的预处理之后发生的富集过程，并且提供包含相对于初始样品富集的分析物的样品。第一富集工作流程可包括化学沉淀(例如，使用乙腈)或使用固相。合适的固相包括但不限于固相萃取(spe)盒和珠。珠可以是非磁性的、磁性的或顺磁性的。珠可以经差异性涂覆以具有对于目标分析物的特异性。依据预期的用途，即依据预期的捕获分子，涂层可以不同。哪种涂层适用于哪种分析物是技术人员众所周知的。珠可以由各种不同材料制成。珠可具有各种尺寸并且包含具有或不具有孔的表面。
[0062]
在本公开的上下文中，术语“第二富集过程”或“第二富集工作流程”是指在样品的预处理和第一富集过程之后发生的富集过程，并且提供包含相对于初始样品和第一富集过程之后的样品富集的分析物的样品。
[0063]
术语“色谱法”是指一种过程，其中由液体或气体携带的化学混合物在固定相液体或固相周围或上方流动时，由于化学实体的差异性分布，该化学混合物分离为多种组分。
[0064]
术语“液相色谱法”或“lc”是指当流体均匀地渗透通过细碎物质的柱或通过毛细管通道时，选择性阻滞流体溶液中的一种或多种组分的过程。随着此流体相对于固定相移动，混合物组分在一种或多种固定相与体相流体(即，流动相)之间的分布导致该滞后。固定相的极性高于流动相(例如，甲苯作为流动相，二氧化硅作为固定相)的方法称为正相液相色谱(nplc)，而固定相的极性小于流动相(例如，水-甲醇混合物作为流动相，而c18(十八烷基硅烷基)作为固定相)的方法称为反相液相色谱(rplc)。
[0065]“高效液相色谱法”或“hplc”是指一种液相色谱方法，在该方法中，通过迫使流动相在压力下经过固定相，通常为密集填充柱，来提高分离程度。通常地，使用由不规则形状或球形的颗粒、多孔整体层或多孔膜构成的固定相来填充柱。过去，hplc根据流动相和固定相的极性分为两个不同的亚类。固定相的极性高于流动相(例如，甲苯作为流动相，二氧化硅作为固定相)的方法称为正相液相色谱(nplc)，反之(例如，水-甲醇混合物作为流动相，而c18(十八烷基硅烷基)作为固定相)则称为反相液相色谱(rplc)。微流lc是指使用具有窄的内柱直径(通常低于1mm，例如约0.5mm)的柱的hplc方法。“超高效液相色谱”或“uhplc”是指使用120mpa(17,405lbf/in2)或约1200大气压的hplc方法。快速lc是指使用具有如上所述的内径且长度短(＜2cm，例如1cm)的柱的lc方法，其采用如上所述的流速并使用如上所述的压力(微流lc、uhplc)。短快速lc方案包括使用单个分析柱的捕捉/洗涤/洗脱步骤，并在＜1min的极短时间内实现lc。
[0066]
其他众所周知的lc模式包括“亲水作用色谱”(hilic)、体积排阻lc、离子交换lc和亲和lc。
[0067]
lc分离可为单通道lc或包括多个平行布置的lc通道的多通道lc。在lc中，可根据
分析物的极性或log p值、尺寸或亲和力来分离该分析物，如技术人员通常所知。
[0068]
术语“裂解”是指单个分子解离为两个或更多个单独的分子。如本文所用，术语裂解是指特异性裂解事件，其中母分子中发生裂解事件的断裂点得到良好限定，并且其中由裂解事件导致的两个或更多个子分子得到良好表征。如何确定母分子的断裂点以及两个或多个所得子分子是技术人员众所周知的。所得子分子可以是稳定的，或者可以在后续裂解事件中解离。举例而言，正在裂解的母分子包括n-苄基咪唑鎓单元时，技术人员能够根据分子的整个结构确定咪唑鎓单元是裂解释放苄基实体，还是从母分子中完全释放出来，即，确定由此产生的子分子是苄基分子和缺少苄基的母分子。裂解可通过碰撞诱导解离(cid)、电子捕获解离(ecd)、电子转移解离(etd)、负电子转移解离(netd)、电子分离解离(edd)、光解离(特别是红外多光子解离(irmpd)和黑体红外辐射解离(bird))、表面诱导解离(sid)、高能c形阱解离(hcd)、电荷远程裂解发生。
[0069]
术语“反应性单元”是指能够与另一分子反应的单元，即该单元能够与另一分子(诸如目标分析物)形成共价键。通常，此类共价键由另一个分子中存在的化学基团形成。据此，在进行化学反应时，化合物的反应性单元与分析物分子中存在的合适化学基团形成共价键。由于分析物分子中存在的此化学基团履行与化合物的反应性单元反应的功能，分析物分子中存在的化学基团也称为分析物的“官能团”。在每种情况下，共价键的形成均发生在化学反应中，其中新共价键在反应性基团的原子与分析物的官能团的原子之间形成。本领域的技术人员众所周知，在反应性基团与分析物的官能团之间形成共价键时，原子在此化学反应过程中丢失。
[0070]
在本公开的上下文中，术语“复合物”是指通过化合物与分析物分子的反应产生的产物。该反应导致化合物与分析物之间形成共价键。据此，术语复合物是指通过化合物与分析物分子的反应形成的共价结合反应产物。
[0071]“试剂盒”是包含至少一种本发明试剂的任何制品(例如，包装或容器)，该试剂例如是用于治疗病症的药品，或用于特异性地检测生物标志物基因或蛋白质的探针。试剂盒优选作为用于执行本发明方法的单元来推销、分发或贩售。通常，试剂盒可进一步包括被分隔开的载体装置以在紧密的限定空间中接纳一个或多个容器装置，诸如小瓶、管等。特别地，每个容器装置包含将在第一方面的方法中使用的单独元件之一。试剂盒可以进一步包含一种或多种其他试剂，包括但不限于反应催化剂。试剂盒可进一步包括一个或多个包含其他材料的其他容器，该其他材料包括但不限于缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。标签可存在于容器上以指示将组合物用于具体应用，并且也可指示体内或体外使用的指南。计算机程序代码可提供于数据存储介质或装置诸如光学存储介质(例如，光盘)上或直接提供于计算机或数据处理装置上。此外，试剂盒可包含如本文别处所述的用于校准目的生物标志物的标准量。
[0072]
实施例
[0073]
在第一方面，本发明涉及多种或至少一种式i化合物：
[0074][0075]
其中取代基b1、b2、b4中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团q，
[0076]
其中其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b4各自独立地选自氢、卤素、烷基、n-酰基氨基、n，n-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基(aryloyl)、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基(aryloyloxy)、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、其同位素或衍生物，
[0077]
其中b3选自烷基、乙酰基、乙烯基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的苄基、未取代的苄基、经取代的环烷基、未取代的环烷基、其同位素和衍生物，
[0078]
其中y1和y2各自独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族、胺，或者其中y1和y2形成选自经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族的环结构。特别地，一种或多种式i化合物用于分析物的质谱测定。
[0079]
根据本发明的化合物包含在低碰撞能量(例如在10ev至50ev的范围内，包括边界)下示出质谱裂解事件的部分。这些化合物的特征在于整体紧凑的结构。这可以通过修饰含有电荷的部分(例如，吡啶鎓、季铵、咪唑鎓、三苯基鏻、稳定的金属络合物、磺酸、硼酸盐、芳基三氟硼酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)来允许标记试剂的简单模块化设计，以解决各种问题，而永久电荷为优选的。这可以允许微调试剂的疏水性，以改善纯化过程中样品基质的分离。此外，质谱裂解可以在低能级处发生，以有利于主要裂解途径。这可以导致ms/ms模式下的灵敏度增加。不管上述情况如何，均可以在较高的能量下进行额外的ms实验，以获得额外的裂解途径。
[0080]
在本发明的第一方面的实施例中，卤素选自由以下项组成的组：f、cl、br和i。
[0081]
在本发明的第一方面的实施例中，烷基选自由以下项组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基和环己基。
[0082]
在本发明的第一方面的实施例中，n-酰基氨基选自由以下项组成的组：甲酰基氨基、乙酰基氨基、丙酰基氨基和苯甲酰基氨基。
[0083]
在本发明的第一方面的实施例中，n，n-二烷基氨基选自由以下项组成的组：n，n-二甲基氨基、n，n-乙基甲基氨基、n，n-二乙基氨基、n，n-甲基丙基氨基、n，n-乙基丙基氨基、n，n-二丙基氨基、n，n-丁基甲基氨基、n，n-丁基乙基氨基、n，n-丁基丙基氨基、n，n-二丁基氨基、n-氮杂环丁烷基、n-吡咯烷基、n-哌啶基和n-哌嗪基。
[0084]
在本发明的第一方面的实施例中，烷氧基选自由以下项组成的组：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苯氧基和苄基氧基。
[0085]
在本发明的第一方面的实施例中，硫代烷氧基选自由以下项组成的组：硫代甲基、硫代乙基、硫代丙基、硫代丁基、硫代戊基和硫代己基。
[0086]
在本发明的第一方面的实施例中，烷氧基羰基选自由以下项组成的组：甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、苯氧基羰基和苄基氧基羰基。
[0087]
在本发明的第一方面的实施例中，烷氧基硫代羰基选自由以下项组成的组：甲氧基硫代羰基、乙氧基硫代羰基、丙氧基硫代羰基、丁氧基硫代羰基、苯氧基硫代羰基和苄基氧基硫代羰基。
[0088]
在本发明的第一方面的实施例中，酰基选自由以下项组成的组：甲酰基、乙酰基和丙酰基。
[0089]
在本发明的第一方面的实施例中，硫代酰基选自由以下项组成的组：硫代甲酰基、硫代乙酰基、硫代丙酰基和硫代苯甲酰基。
[0090]
在本发明的第一方面的实施例中，芳酰基选自由以下项组成的组：苯甲酰基、萘甲酰基和蒽甲酰基。
[0091]
在本发明的第一方面的实施例中，酰氧基选自由以下项组成的组：甲酰氧基、乙酰氧基和丙酰氧基。
[0092]
在本发明的第一方面的实施例中，芳酰基氧基选自由以下项组成的组：苯甲酰基氧基、萘甲酰基氧基和蒽甲酰基氧基。
[0093]
在本发明的第一方面的实施例中，环烷基选自由以下项组成的组：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
[0094]
在本发明的第一方面的实施例中，芳基选自由以下项组成的组：苯基、苄基、萘基、蒽基和菲基。
[0095]
在本发明的第一方面的实施例中，杂芳基选自由以下项组成的组：咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并三唑基、苯并呋喃基和苯并咪唑基。
[0096]
在本发明的第一方面的实施例中，杂环烷基选自由以下项组成的组：n-氮杂环丁烷基、n-吡咯烷基、n-哌啶基和n-哌嗪基。
[0097]
在本发明的第一方面的实施例中，经取代的芳族选自由以下项组成的组：甲氧基苯基、氰基苯基和乙基萘基。
[0098]
在本发明的第一方面的实施例中，包含y1和y2的环结构选自由以下项组成的组：苯基、苄基、甲基、乙基、丙基和乙酰氧基。
[0099]
在本发明的第一方面的实施例中，化合物包含具有以下式的结构：
[0100][0101]
式i的咪唑鎓环示出中介效应，因为咪唑鎓结构包含两个具有正电荷的氮原子，特别是在各个n原子中的任一者上的经定义的电荷。中介效应为咪唑环的特性。它被定义为通过π键和相邻原子上存在的孤对电子的相互作用而在咪唑分子中产生的极性。结构i-i和i-ii是对式i化合物单独绘制的π键的可能布置。
[0102]
在本发明的第一方面的实施例中，式i化合物包含偶联基团q。式i的取代基b1、b2或b4中的至少一者为偶联基团q。优选地，b1或b2为q。
[0103]
在本发明的第一方面的实施例中，偶联q根据以下ii与x键合：
[0104][0105]
其中k为能够与分析物形成共价键的反应性单元，
[0106]
其中n为0、1、2、3、4或5，并且
[0107]
其中x为式i的咪唑的碳原子。
[0108]
在本发明的第一方面的实施例中，q在低于触发质谱裂解的能级处没有示出任何裂解。
[0109]
在本发明的第一方面的实施例中，q经由共价键与x键合。
[0110]
在本发明的第一方面的实施例中，q选自由以下项组成的组：亚甲基酰肼(与乙酰基酰肼相同)、亚甲基肼、亚甲基羟胺。
[0111]
在本发明的第一方面的实施例中，k与x直接键合(n＝0)。
[0112]
在本发明的第一方面的实施例中，k经由亚甲基基团与x键合(n＝1)。
[0113]
在本发明的第一方面的实施例中，k经由亚乙基基团与x键合(n＝2)。
[0114]
在本发明的第一方面的实施例中，k经由亚丙基基团与x键合(n＝3)。
[0115]
在本发明的第一方面的实施例中，k经由亚丁基基团与x键合(n＝4)。
[0116]
在本发明的第一方面的实施例中，k经由亚戊基基团与x键合(n＝5)。
[0117]
在本发明的第一方面的实施例中，式i的咪唑鎓的碳原子x为b1、b2或b4的结合配
偶体。
[0118]
在本发明的第一方面的实施例中，所述化合物选自以下组i-1、i-2和i-3：
[0119][0120]
其中a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b3、b4、k、x和n具有如上所述的含义。在本发明的第一方面的实施例中，根据本发明的式i化合物包含能够与分析物或分析物分子反应的反应性单元k。反应性单元k能够与分析物分子反应，使得在式i化合物与分析物分子之间形成共价键。优选地，共价键为单键或双键。
[0121]
在本发明的第一方面的实施例中，反应性单元k与式i化合物形成共价键。特别地，在式i化合物的反应性单元k与分析物分子中存在的官能团之间形成共价键。
[0122]
在本发明的第一方面的实施例中，k能够与分析物的羰基基团、酚基团、胺、羟基基团或二烯基团反应。
[0123]
在本发明的第一方面的实施例中，k选自由以下项组成的组：酰肼、肼、羟胺和反应性羰基。
[0124]
依据待测定的分析物分子中存在的官能团，技术人员将选择适宜的用于式i化合物的反应性单元k。决定哪种反应性单元k将符合与目标分析物的官能团结合是公知常识。
[0125]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子包含选自由以下项组成的组的官能团：羰基基团、二烯基团、羟基基团、胺基团、亚胺基团、酮基团、醛基团、硫醇基团、二醇基团、酚基团、环氧化物基团、二硫化物基团、核碱基基团、甲酸基团、末端半胱氨酸基团、末端丝氨酸基团和叠氮化物基团，这些基团中的每个基团均能够与式i化合物的反应性单元k形成共价键。此外，在本发明的范畴内也预期，分析物分子上存在的官能团将会首先转化为更容易与式i化合物的反应性单元k反应的另一基团。
[0126]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子选自由以下项组成的组：类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、脂质、核苷、核苷酸、核酸和其他生物分子(包括小分子代谢物和辅因子)以及治疗性药物、滥用的药物、毒素或它们的代谢物。
[0127]
在本发明第一方面的实施例中，分析物分子包含羰基基团作为官能团，该羰基基团选自由以下项组成的组：羧酸基团、醛基团、酮基团、掩蔽的醛、掩蔽的酮基团、酯基团、酰胺基团和酐基团。醛糖(醛和酮)作为缩醛和半缩醛存在，其为母体醛/酮的一种掩蔽形式。
[0128]
在本发明的第一方面的实施例中，羰基基团是酰胺基团，技术人员清楚地知道，这样的酰胺基团是稳定的基团，但可将其水解以将酰胺基团转化为甲酸基团和氨基基团。酰胺基团的水解可经由酸/碱催化的反应或酶促过程实现，以上两者中的任何一种均是技术
人员众所周知的。在本发明的第一方面的实施例中，其中羰基基团是掩蔽的醛基团或掩蔽的酮基团，相应的基团是半缩醛基团或缩醛基团，特别是环状半缩醛基团或缩醛基团。在本发明的第一方面的实施例中，在与式i化合物反应之前，缩醛基团转化为醛或酮基团。
[0129]
在本发明的第一方面的实施例中，羰基基团是酮基团。在本发明的第一方面的实施例中，可在与式i化合物的反应性单元反应之前，将酮基团转移至中间体亚胺基团中。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个酮基团的分析物分子是酮类固醇。在本发明的第一方面的特定实施例中，酮类固醇选自由以下项组成的组：睾酮、表睾酮、二氢睾酮(dht)、脱氧甲基睾酮(dmt)、四氢孕三烯酮(thg)、醛固酮、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮雌二醇、16-α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲基醚、强的松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、脱氢表雄酮(dhea)、17-羟基孕烯醇酮、17-羟基孕酮、雄酮、表雄酮、δ4雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、别孕烯醇酮和醛固酮。
[0130]
在本发明的第一方面的实施例中，羰基基团是羧基基团。在本发明的第一方面的实施例中，羧基基团直接与式i化合物反应，或在与式i化合物反应前转化为活化的酯基团。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个羧基基团的分析物分子选自由以下项组成的组：δ8-四氢大麻酚酸、苯甲酰芽子碱、水杨酸、2-羟基苯甲酸、加巴喷丁、普瑞巴林、丙戊酸、万古霉素、甲氨蝶呤、霉酚酸、孟鲁司特、瑞格列奈、呋喃苯胺酸、替米沙坦、吉非罗齐、双氯芬酸、布洛芬、吲哚美辛、佐美酸、伊索克酸和青霉素。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个羧基基团的分析物分子为选自由以下项组成的组的氨基酸：精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
[0131]
在本发明的第一方面的实施例中，羰基基团是醛基团。在本发明的第一方面的实施例中，可在与式i化合物的反应性单元反应之前，将醛基团转移至中间体亚胺基团中。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个醛基团的分析物分子选自由以下项组成的组：吡哆醛、n-乙酰基-d-葡萄糖胺、阿卡他定、链霉素、交沙霉素。
[0132]
在本发明的第一方面的实施例中，羰基基团是羰基酯基团。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个酯基团的分析物分子选自由以下项组成的组：可卡因、海洛因、利他林、醋氯芬酸、乙酰胆碱、安西奈德、阿米洛酯、阿米洛卡因、氨苄哌替啶、阿雷地平、青蒿琥酯和哌替啶。
[0133]
在本发明的第一方面的实施例中，羰基基团是酐基团。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个酐基团的分析物分子选自由以下项组成的组：斑蝥素、琥珀酸酐、偏苯三酸酐和马来酸酐。
[0134]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子包含一个或多个二烯基团，特别是共轭的二烯基团，作为官能团。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个二烯基团的分析物分子为开环甾类化合物。在实施例中，开环甾类化合物选自由以下项组成的组：胆钙化醇(维生素d3)、麦角钙化醇(维生素d2)、骨化二醇、骨化三醇、速固醇、光甾醇和他卡西醇。特别地，开环甾类化合物是维生素d，特别是维生素d2或d3或它们的衍生物。在特定实施例中，开环甾类化合物选自由以下项组成的组：维生素d2、维生素d3、25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3(骨化二醇)、3-表-25-羟基维生素d2、3-表-25-羟基维生素d3、1，25-二羟基维生素d2、1，25-二羟基维生素d3(骨化三醇)、24，25-二羟基维生素d2、24，25-二羟基维生
素d3。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个二烯基团的分析物分子选自由以下项组成的组：维生素a、维甲酸、异维甲酸、阿利维甲酸、纳他霉素、西罗莫司、两性霉素b、制霉菌素、依维莫司、替西罗莫司和非达霉素。
[0135]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子包含一个或多个羟基基团作为官能团。在本发明第一方面的实施例中，分析物分子包含单个羟基基团或两个羟基基团。在其中存在多于一个羟基基团的实施例中，两个羟基基团可定位为彼此相邻(1，2-二醇)，或者可相隔1、2或3个c原子(分别为1，3-二醇、1，4-二醇、1，5-二醇)。在第一方面的特定实施例中，分析物分子包含1，2二醇基团。在其中仅存在一个羟基基团的实施例中，所述分析物选自由以下项组成的组：伯醇、仲醇和叔醇。在本发明的第一方面的实施例中，其中分析物分子包含一个或多个羟基基团，分析物选自由以下项组成的组：苄醇、薄荷醇、l-肉毒碱、吡哆醇、甲硝哒唑、单硝酸异山梨酯、愈创甘油醚、克拉维酸盐、米吉妥(migitol)、扎西他滨、异丙肾上腺素、阿昔洛韦、美索巴莫、曲马多、文拉法辛、阿托品、氯苯达诺、α-羟基阿普唑仑、α-羟基三唑仑、劳拉西泮、去甲羟基安定、替马西泮、乙基葡糖苷酸、乙基吗啡、吗啡、吗啡-3-葡糖苷酸、丁丙诺啡、可待因、二氢可待因、对-羟基丙氧芬、o-去甲基曲马多、去甲基曲马多、双氢奎尼丁和奎尼丁。在本发明的第一方面的实施例中，其中分析物分子包含多于一个羟基基团，分析物选自由以下项组成的组：维生素c、葡萄糖胺、甘露醇、四氢生物蝶呤、阿糖胞苷、阿扎胞苷、利巴韦林、氟尿苷、吉西他滨、链脲佐菌素、腺苷、阿糖腺苷、克拉屈滨、雌三醇、三氟尿苷、氯法拉滨、纳多洛尔、扎那米韦、乳果糖、单磷酸腺苷、碘苷、瑞加德松(regadenoson)、林可霉素、克林霉素、卡格列净(canaglifozin)、妥布霉素、奈替米星、卡那霉素、替格瑞洛、表柔比星、多柔比星、阿贝卡星、链霉素、哇巴因(ouabain)、阿米卡星、新霉素、弗氏菌丝素(framycetin)、巴龙霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、长春地辛、洋地黄毒苷、地高辛、甲泛葡胺、乙酰洋地黄毒苷、去乙酰毛花苷、氟达拉滨、氯法拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、卡培他滨、阿糖腺苷和普卡霉素。
[0136]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子包含一个或多个硫醇基团(包括但不限于烷基硫醇和芳基硫醇基团)作为官能团。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个硫醇基团的分析物分子选自由以下项组成的组：硫代扁桃酸、dl-甲巯丙脯酸、dl-塞奥芬、n-乙酰基半胱氨酸、d-青霉胺、谷胱甘肽、l-半胱氨酸、泽芬诺普利(zofenoprilat)、硫普罗宁、二巯基丙醇、琥巯酸。
[0137]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子包含一个或多个二硫化物基团作为官能团。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个二硫化物基团的分析物分子选自由以下项组成的组：谷胱甘肽二硫化物、双硫氧吡啶、二硫化硒、双硫仑、硫辛酸、l-胱氨酸、呋喃硫胺、奥曲肽、去氨加压素、伐普肽、特利加压素、利那洛肽和培奈萨肽(peginesatide)。硫化硒可以为二硫化硒，ses2，或六硫化硒，se2s6。
[0138]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子包含一个或多个环氧化物基团作为官能团。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个环氧化物基团的分析物分子选自由以下项组成的组：卡马西平-10，11环氧化物、卡非佐米、呋喃苯胺酸环氧化物、磷霉素、盐酸司维拉姆、浅蓝菌素、东莨菪碱、噻托溴铵(tiotropium)、噻托溴铵(tiotropium bromide)、甲溴东莨菪碱、依普利酮、莫匹罗星、纳他霉素和醋竹桃霉素。
[0139]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子包含一个或多个酚基团作为官能
团。在本发明第一方面的实施例中，包含一个或多个酚基团的分析物分子是类固醇或类固醇样化合物。在本发明第一方面的实施例中，包含一个或多个酚基团的分析物分子是具有sp2杂化的a环以及位于a环3位置的oh基团的类固醇或类固醇样化合物。在本发明的第一方面的特定实施例中，类固醇或类固醇样分析物分子选自由以下项组成的组：雌激素、雌激素样化合物、雌酮(e1)、雌二醇(e2)、17a-雌二醇、17b-雌二醇、雌三醇(e3)、16-表雌三醇、17-表雌三醇和16，17-表雌三醇和/或它们的代谢物。在实施例中，代谢物选自由以下项组成的组：雌三醇、16-表雌三醇(16-epie3)、17-表雌三醇(17-epie3)、16，17-表雌三醇(16，17-epie3)、16-酮雌二醇(16-ketoe2)、16a-羟基雌酮(16a-ohe1)、2-甲氧基雌酮(2-meoe1)、4-甲氧基雌酮(4-meoe1)、2-羟基雌酮-3-甲基醚(3-meoe1)、2-甲氧基雌二醇(2-meoe2)、4-甲氧基雌二醇(4-meoe2)、2-羟基雌酮(2-ohe1)、4-羟基雌酮(4-ohe1)、2-羟基雌二醇(2-ohe2)、雌酮(e1)、硫酸雌酮(e1s)、17a-雌二醇(e2a)、17b-雌二醇(e2b)、硫酸雌二醇(e2s)、马烯雌酮(eq)、17a-二氢马烯雌酮(eqa)、17b-二氢马烯雌酮(eqb)、马萘雌酮(en)、17-二氢马萘雌酮(ena)、17α-二氢马萘雌酮、17β-二氢马萘雌酮(enb)、δ8，9-脱氢雌酮(del)、δ8，9-脱氢雌酮硫酸酯(dels)、δ9-四氢大麻酚、霉酚酸。β或b可互换使用。α和a可互换使用。
[0140]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子包含胺基团作为官能团。在本发明的第一方面的实施例中，胺基团是烷基胺或芳基胺基团。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个胺基团的分析物选自由以下项组成的组：蛋白质和肽。在本发明的第一方面的实施例中，包含胺基团的分析物分子选自由以下项组成的组：3，4-亚甲二氧安非他明、3，4-亚甲二氧-n-乙基安非他明、3，4-亚甲二氧甲基安非他明、安非他明、甲基安非他明、n-甲基-1，3-苯并二氧杂环戊烯基仲丁胺、7-氨基氯硝西泮、7-氨基氟硝西泮、3，4-二甲基甲卡西酮、3-氟甲卡西酮、4-甲氧基甲卡西酮、4-甲基乙卡西酮、4-甲基甲卡西酮、安非拉酮、2-甲基氨基-1-(3
′
，4
′‑
亚甲二氧基苯基)丁-1-酮(butylone)、乙卡西酮(ethcathinone)、麻黄素(elephedrone)、甲卡西酮、亚甲基二氧基甲卡西酮(methylone)、亚甲二氧吡咯戊酮、苯甲酰爱康宁、去氢去甲氯胺酮、氯胺酮、去甲氯胺酮、美沙酮、去甲美沙酮、6-乙酰基吗啡、二乙酰基吗啡、吗啡、去甲氢可酮(norhydrocodone)、氧可酮、羟吗啡酮、苯环己哌啶、去甲丙氧芬、阿米替林、氯米帕明、度琉平、多虑平、丙咪嗪、去甲替林、三甲丙咪嗪、芬太尼、甘氨酰二甲基苯胺(glycylxylidide)、利多卡因、单乙基甘氨酰二甲基苯胺、n-乙酰基普鲁卡因酰胺、普鲁卡因酰胺、普瑞巴林、2-甲基氨基-1-(3，4-亚甲二氧苯基)丁烷、n-甲基-1，3-苯并二氧杂环戊烯基仲丁胺、2-氨基-1-(3，4-亚甲二氧苯基)丁烷、1，3-苯并二氧杂环戊烯基仲丁胺、去甲哌替啶、o-去甲基曲马多、去甲基曲马多、曲马多、拉莫三嗪、茶碱、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、万古霉素、甲氨蝶呤、加巴喷丁、西索米星和5-甲基胞嘧啶。
[0141]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子为碳水化合物或具有碳水化合物部分的物质(例如糖蛋白或核苷)。在本发明第一方面的实施例中，分析物分子是单糖，特别是选自由以下项组成的组：核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、核酮糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、果糖、n-乙酰基葡萄糖胺、n-乙酰基半乳糖胺、神经氨酸、n-乙酰基神经氨酸等。在实施例中，分析物分子为寡糖，特别是选自由以下项组成的组：二糖、三糖、四糖、多糖。在本发明第一方面的实施例中，二糖选自由以下项组成的组：蔗糖、麦芽糖和乳糖。在本发明第一方面的实施例中，分析物分子是包含上述单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖部分的物质。
[0142]
在本发明第一方面的实施例中，分析物分子包含叠氮化物基团作为官能团，其选
自由以下项组成的组：烷基叠氮化物或芳基叠氮化物。在本发明的第一方面的实施例中，包含一个或多个叠氮化物基团的分析物分子选自由以下项组成的组：齐多夫定和叠氮西林。
[0143]
此类分析物分子可存在于生物样品或临床样品诸如体液(例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、脊髓液等)、组织或细胞提取物等中。在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子存在于选自由以下项组成的组的生物样品或临床样品中：血液、血清、血浆、尿液、唾液、脊髓液和干血斑。在本发明第一方面的一些实施例中，分析物分子可存在于样品中，该样品是纯化或部分纯化的样品，例如，纯化或部分纯化的蛋白质混合物或提取物。
[0144]
在本发明的第一方面的实施例中，反应性单元k选自由以下项组成的组：羰基反应性单元、二烯反应性单元、羟基反应性单元、氨基反应性单元、亚胺反应性单元、硫醇反应性单元、二醇反应性单元、酚反应性单元、环氧化物反应性单元、二硫化物反应性单元和叠氮基反应性单元。
[0145]
在本发明的第一方面的实施例中，反应性单元k为羰基反应性单元，其能够与具有羰基基团的任何类型的分子反应。在本发明的第一方面的实施例中，羰基反应性单元选自由以下项组成的组：羧基反应性单元、酮反应性单元、醛反应性单元、酐反应性单元、羰基酯反应性单元和酰亚胺反应性单元。在本发明的第一方面的实施例中，羰基反应性单元可以具有通过相邻o或n原子的α-效应强化的超亲核性n原子nh2-n/o或具有二硫醇分子。
[0146]
在本发明的第一方面的实施例中，羰基反应性单元选自由以下项组成的组：
[0147]
(i)肼单元，例如h2n-nh-或h2n-nr
1-单元，其中r1为芳基、含有一个或多个杂原子的芳基或者c
1-4
烷基(特别是c1或c2烷基)，任选地被例如卤素、羟基和/或c
1-3
烷氧基取代，
[0148]
(ii)酰肼单元，特别是碳酰肼或磺酰肼单元，特别是h2n-nh-c(o)-或h2n-nr
2-c(o)-单元，
[0149]
其中r2为芳基、含有一个或多个杂原子的芳基或c
1-4
烷基，特别是c1或c2烷基，任选地被例如卤素、羟基和/或c
1-3
烷氧基取代，
[0150]
(iii)羟氨基单元，例如h2n-o-单元，以及
[0151]
(iv)二硫醇单元，特别是1，2-二硫醇或1，3-二硫醇单元。
[0152]
在本发明的第一方面的实施例中，羰基反应性单元是羧基反应性单元，羧基反应性单元与分析物分子上的羧基基团反应。在本发明的第一方面的实施例中，羧基反应性单元选自由以下项组成的组：重氮单元、烷基卤、胺和肼单元。
[0153]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物分子包含酮或醛基团，并且k为羰基反应性单元，该羰基反应性单元选自由以下项组成的组：
[0154]
(i)肼单元、
[0155]
(ii)酰肼单元、
[0156]
(iii)羟氨基单元，以及
[0157]
(iv)二硫醇单元。
[0158]
在本发明的第一方面的实施例中，反应性单元k为二烯反应性单元，其能够与包含二烯基团的分析物反应。在本发明的第一方面的实施例中，二烯反应性单元选自由以下项组成的组：cookson型试剂，例如，1，2，4-三唑啉-3，5-二酮，其能够作为亲二烯体发挥作用。
[0159]
在本发明的第一方面的实施例中，反应性单元k为羟基反应性单元，其能够与包含羟基基团的分析物反应。在本发明的第一方面的实施例中，羟基反应性单元选自由以下项
组成的组：磺酰氯、活化的甲酸酯(nhs或咪唑阴离子)和能够进行氟的亲核取代的含氟芳族/杂芳族(t.higashi j steroid biochem mol biol.2016sep；162：57-69)。在本发明的第一方面的实施例中，反应性单元k为二醇反应性单元，其与分析物分子上的二醇基团反应。
[0160]
在本发明的第一方面的实施例中，其中反应性单元为1，2-二醇反应性单元，1，2-二醇反应性单元包含有机硼酸。在其他实施例中，二醇可氧化为相应的酮或醛，然后与酮/醛反应性单元k反应。
[0161]
在本发明的第一方面的实施例中，氨基反应性单元与分析物分子上的氨基基团反应。在本发明的第一方面的实施例中，氨基反应性单元选自由以下项组成的组：活性酯基团诸如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯或磺基-nhs酯、五氟苯基酯、羰基咪唑酯、方酸(quadratic acid)酯、羟基苯并三唑(hobt)酯、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat)酯和磺酰氯单元。
[0162]
在本发明的第一方面的实施例中，硫醇反应性单元与分析物分子上的硫醇基团反应。在本发明的第一方面的实施例中，硫醇反应性单元选自由卤代乙酰基基团组成的组，特别是选自由以下项组成的组：br/i-ch2-c(＝o)-单元、丙烯酰胺/丙烯酸酯单元、不饱和酰亚胺单元诸如马来酰亚胺、甲磺酰基苯基噁二唑和磺酰氯单元。
[0163]
在本发明第一方面的实施例中，酚反应性单元与分析物分子上的酚基团反应。在本发明的第一方面的实施例中，酚反应性单元选自由以下项组成的组：活性酯单元诸如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯或磺基-nhs酯、五氟苯基酯、羰基咪唑酯、方酸酯、羟基苯并三唑(hobt)酯、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat)酯和磺酰氯单元。分析物分子上存在的酚基团可经由反应(h.ban等人j.am.chem.soc.，2010，132(5)，第1523-1525页)或通过重氮化或者替代地通过邻位硝化并且随后还原为胺(其然后可与胺反应性试剂反应)与高反应性亲电试剂如三唑二酮(如tad)反应。在本发明的第一方面的实施例中，酚反应性单元为氟-1-吡啶鎓。
[0164]
在本发明的第一方面的实施例中，反应性单元k为环氧化物反应性单元，其能够与包含环氧化物基团的分析物反应。在本发明的第一方面的实施例中，环氧化物反应性单元选自由以下项组成的组：氨基、硫醇、通过相邻o或n原子的α-效应强化的超亲核性n原子nh2-n/o分子。在本发明的第一方面的实施例中，环氧化物反应性单元选自由以下项组成的组：
[0165]
(i)肼单元，例如，h2n-nh-或h2n-nr
1-单元，其中r1为芳基、含有一个或多个杂原子的芳基或者c
1-4
烷基(特别是c1或c2烷基)，任选地被例如卤素、羟基和/或c
1-3
烷氧基取代，
[0166]
(ii)酰肼单元，特别是碳酰肼或磺酰肼单元，特别是h2n-nh-c(o)-或h2n-nr
2-c(o)-单元，
[0167]
其中r2为芳基、含有一个或多个杂原子的芳基或c
1-4
烷基，特别是c1或c2烷基，任选地被例如卤素、羟基和/或c
1-3
烷氧基取代，以及
[0168]
(iii)羟氨基单元，例如，h2n-o-单元。
[0169]
在本发明的第一方面的实施例中，反应性单元k为二硫化物反应性单元，其能够与包含二硫化物基团的分析物反应。在本发明的第一方面的实施例中，二硫化物反应性单元选自由硫醇组成的组。在其他实施例中，二硫化物基团可还原为相应的硫醇基团，然后与硫醇反应性单元k反应。
[0170]
在本发明的第一方面的实施例中，反应性单元k为叠氮基反应性单元，其与分析物分子上的叠氮基基团反应。在本发明的第一方面的实施例中，叠氮基反应性单元通过叠氮化物-炔烃环加成而与叠氮基基团反应。在本发明第一方面的实施例中，叠氮基反应性单元选自由以下项组成的组：炔(烷基或芳基)、线性炔或环状炔。叠氮基与炔之间的反应可在使用或不使用催化剂的情况下进行。在本发明的第一方面的其他实施例中，叠氮基基团可还原为相应的氨基基团，然后与氨基反应性单元k反应。
[0171]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物的官能团选自表1的左栏中提及的选项。分析物对应官能团的k的反应性基团选自表1的右栏中提及的基团。
[0172]
表1：分析物的官能团和用于特异性标记的反应性基团
[0173][0174][0175]
在本发明的第一方面的实施例中，不形成偶联基团q的其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b3、b4各自独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、丁基、叔丁基或甲氧基。
[0176]
在本发明的第一方面的实施例中，q为乙酰肼。
[0177]
在本发明的第一方面的实施例中，q为羰基酰肼。
[0178]
在本发明的第一方面的实施例中，b3为烷基。
[0179]
在本发明的第一方面的实施例中，b3甲基或乙基。
[0180]
在本发明的第一方面的实施例中，a1为h或甲氧基。
[0181]
在本发明的第一方面的实施例中，a2为h或甲氧基。
[0182]
在本发明的第一方面的实施例中，a3为h或甲氧基。
[0183]
在本发明的第一方面的实施例中，a4为h或甲氧基。
[0184]
在本发明的第一方面的实施例中，a5为h或甲氧基。
[0185]
在本发明的第一方面的实施例中，y1为h或与y2形成稠合芳族或杂芳族环结构。
[0186]
在本发明的第一方面的实施例中，y2为h或与y1形成稠合芳族或杂芳族环结构。
[0187]
在本发明的第一方面的实施例中，b1为h。特别是在b2为q的情况下，则b1为h。
[0188]
在本发明的第一方面的实施例中，b4为h。
[0189]
在本发明的第一方面的实施例中，b2为h。特别是在b1为q的情况下，则b2为h。
[0190]
在本发明的第一方面的实施例中，b1或b2中的一者为q。q选自以下组：肼单元、酰肼单元、羟氨基单元。不是q的其他取代基为：a1＝h、a2＝h、a3＝h、a4＝h、a5＝h、y1＝h、y2＝h、b3＝甲基、b4＝h、b5＝h和b1＝h或b2＝h。
[0191]
在本发明的第一方面的实施例中，b1为q。q选自以下组：肼单元、酰肼单元、羟氨基单元。不是q的其他取代基为：a1＝h、a2＝h、a3＝h、a4＝h、a5＝h、y1＝h、y2＝h、b3＝甲基、b4＝h、b5＝h和b2＝h。
[0192]
在本发明的第一方面的实施例中，b2为q。q选自以下组：肼单元、酰肼单元、羟氨基单元。不是q的其他取代基为：a1＝h、a2＝h、a3＝h、a4＝h、a5＝h、y1＝h、y2＝h、b3＝甲基、b4＝h、b5＝h和b1＝h。
[0193]
在本发明的第一方面的实施例中，化合物为带电荷的。
[0194]
在本发明的第一方面的实施例中，化合物为带正电荷的。
[0195]
在本发明的第一方面的实施例中，化合物为带永久正电荷的。特别地，化合物为一次性带永久正电荷的。这可能意味着净电荷的总和为一次性带永久正电荷的。
[0196]
在本发明的第一方面的实施例中，正电荷为咪唑鎓环的一部分。
[0197]
在本发明的第一方面的实施例中，y1和y2各自独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族、胺。氢、烷基和/或经取代的芳族为优选的实施例。
[0198]
在本发明的第一方面的实施例中，y1和y2形成选自经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族的环结构。
[0199]
在本发明的第一方面的实施例中，化合物包含用于形成盐的抗衡离子。特别地，抗衡离子为带永久负电荷的。
[0200]
在本发明的第一方面的实施例中，化合物包含用于形成盐的抗衡离子，其中抗衡离子优选地选自下组：cl-、br-、f-、甲酸根、三氟乙酸根、pf
6-、磺酸根、磷酸根、乙酸根。
[0201]
在本发明的第一方面的实施例中，式i化合物选自以下组：
[0202]
标记物1
[0203]
标记物2
[0204]
上述标记物1或2中的每一者均可以单独或与抗衡离子组合形成化合物。
[0205]
在苄基位置处的中性丢失裂解后，碳阳离子的稳定使得在低能量下发生碎片丢失，从而提供高度主导的裂解途径，从而能够实现高信号增强。在一些实施例中，尤其是在间位取代模式下，可以观察到有利的lc(液相色谱)洗脱特征。可以主要生成可在酰肼或肟中形成的两种e/z立体异构体中的任一者(例如用于睾酮标记)，或两种异构体共洗脱。由于更好的s/n(信噪比)，因此这增加了灵敏度。
[0206]
烷基化咪唑鎓可以在n位置处在中间能量下裂解。烷基化咪唑鎓与作为丢失碎片的稳定的苄基阳离子结合，这导致较低的能量裂解和高度主导的裂解途径，从而能够实现高信号增强。可以主要生成可由酰肼或羟胺形成的两种e/z立体异构体中的任一者(例如用于睾酮标记)，或两种异构体共洗脱。这增加了灵敏度供电子取代基a1、a2、a3、a3、a4和/或a5(例如ome)。根据本发明的第一方面的实施例，可以通过y1＝h、y2＝h、a1＝ome、a2＝h、a3＝h、a4＝h、a5＝h、n＝0和k＝酰肼来实现高信号增强。
[0207]
根据本发明的第一方面的实施例，可以通过y1＝h、y2＝h、a1＝ome、a2＝h、a3＝h、a4＝h、a5＝h、n＝1和k＝酰肼来实现高信号增强。
[0208]
在第二方面，本发明涉及包含如上文或下文关于本发明的第一方面详细公开的式i化合物的组合物。针对本发明的第一方面所提及的所有实施例均适用于本发明的第二方面，反之亦然。
[0209]
在第三方面，本发明涉及包含如上文或下文关于本发明的第一方面详细公开的式i化合物或如上文或下文详细公开的本发明的第二方面的组合物的试剂盒。针对本发明的第一方面和/或本发明的第二方面所提及的所有实施例均适用于本发明的第三方面，反之亦然。
[0210]
在第四方面，本发明涉及用于使用质谱测定来检测分析物的复合物，其包含彼此共价连接的结合分析物和结合化合物，特别是其中通过分析物与本发明的第一方面的化合物的化学反应来形成该复合物，和/或特别地，其中分析物选自由以下项组成的组：核酸、氨基酸、肽、蛋白质、代谢物、激素、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、以其他分子的某种修饰为特征的分子、已经由生物体内化的物质、此类物质的代谢物、以及它们的组合。针对本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面所提及的所有实施例均适用于本发明的第四方面，反之亦然。
[0211]
在本发明的第四方面的实施例中，式iii结合复合物由以下方式得到：在式i化合物的化合物与分析物分子中存在的官能团之间形成共价键。根据式i化合物的反应性单元k和分析物分子的官能团，技术人员完全能够确定两者之间形成的共价键。
[0212]
在本发明的第四方面的实施例中，结合化合物包含式iii和式iv：
[0213][0214][0215]
其中取代基b1、b2、b4中的一者为与分析物形成共价键的偶联基团q*，其中其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b4各自独立地选自氢、卤素、烷基、n-酰基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、其同位素或衍生物，
[0216]
其中b3选自烷基、乙酰基、乙烯基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的苄基、未取代的苄基、经取代的环烷基、未取代的环烷基、其同位素和衍生物，
[0217]
其中y1和y2各自独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、胺，或者其中y1和y2形成选自经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的芳族、苄基型、未取代的芳族、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族的环结构，其中n*为0、1、2、3、4或5，
[0218]
其中结合分析物经由k*共价键合，其中x*为式iii的咪唑的碳原子。
[0219]
在本发明的第四方面的实施例中，式iii的a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b3、b4、b5、y1和y2中的每一者均具有与上文针对本发明的第一方面所提及的相同的含义(式i的a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b3、b4、y1和y2)。
[0220]
在本发明的第四方面的实施例中，x*具有与上文针对本发明的第一方面所提及的x相同的含义。优选地，x*不是如式iv所示的q*的一部分。
[0221]
在本发明的第四方面的实施例中，k*由以下方式得到：式i化合物的反应性单元k与分析物分子中存在的官能团之间形成共价键。根据式i化合物的反应性单元k和分析物分子的官能团，技术人员完全能够确定两者之间形成的共价键。
[0222]
此外，在本发明的范畴内也预期，分析物分子上存在的官能团可以首先转化为更容易与式i化合物的反应性单元k反应的另一基团。
[0223]
在本发明的第四方面的实施例中，分析物选自由以下项组成的组：核酸、氨基酸、
肽、蛋白质、代谢物、激素、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、以其他分子的某种修饰为特征的分子、已经由生物体内化的物质、此类物质的代谢物、以及它们的组合。
[0224]
在本发明的第四方面的实施例中，分析物分子包含选自由以下项组成的组的官能团：羰基基团、二烯基团、羟基基团、胺基团、亚胺基团、硫醇基团、二醇基团、酚基团、环氧化物基团、二硫化物基团和叠氮化物基团，这些基团中的每个基团均能够与式i化合物的反应性单元k形成共价键。
[0225]
在本发明的第四方面的实施例中，分析物分子选自由以下项组成的组：类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、脂质、核苷、核苷酸、核酸和其他生物分子(包括小分子代谢物和辅因子)以及治疗性药物、滥用的药物、毒素或它们的代谢物。
[0226]
针对本发明的第一方面所提及的分析物的所有实施例均适用于本发明的第四方面，反之亦然。在本发明的第四方面的实施例中，x*为式iii的咪唑鎓环的碳原子。在本发明的第四方面的实施例中，n*为0、1、2、3、4或5。优选地，n*为0或1。
[0227]
在本发明的第四方面的实施例中，结合化合物经由分析物的羰基基团、羟基基团或二烯基团共价连接，以形成所述复合物。
[0228]
在第五方面，本发明涉及式i化合物用于分析物的质谱测定的用途。优选地，质谱测定包括串联质谱测定，特别是三重四极杆质谱测定。针对本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面和/或本发明的第四方面所提及的所有实施例均适用于本发明的第五方面，反之亦然。
[0229]
在本发明的第五方面的实施例中，质谱测定包括串联质谱测定，特别是三重四极杆质谱测定。
[0230]
在本发明的第五方面的实施例中，式i化合物的用途包括用作衍生化试剂。在本发明的第五方面的实施例中，使用式i化合物来增加ms测量的灵敏度。在实施例中，使用式i化合物以较低的检测水平特别是在较低的定量水平检测目标分析物。
[0231]
在本发明的第五方面的实施例中，根据本发明的式i化合物包含能够与分析物分子反应的反应性单元k。反应性单元k能够与分析物分子反应，使得在式i化合物与分析物分子之间形成共价键。在本发明的第五方面的实施例中，反应性单元k与式i化合物形成共价键。特别地，在式i化合物的反应性单元k与分析物分子中存在的官能团之间形成共价键。
[0232]
依据待测定的分析物分子中存在的官能团，技术人员将选择适宜的用于式i化合物的反应性单元k。决定哪种反应性单元k将符合与目标分析物的官能团结合是公知常识。
[0233]
以上针对分析物所述的内容比照适用于本发明的第五方面的上下文中的分析物。
[0234]
分析物分子可存在于生物样品或临床样品诸如体液(例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、脊髓液等)、组织或细胞提取物等中。在本发明的第五方面的实施例中，分析物分子存在于选自由以下项组成的组的生物样品或临床样品中：血液、血清、血浆、尿液、唾液、脊髓液和干血斑。在本发明的第五方面的一些实施例中，分析物分子可存在于样品中，该样品是纯化或部分纯化的样品，例如，纯化或部分纯化的蛋白质混合物或提取物。
[0235]
在第六方面，本发明涉及用于分析物的质谱测定的方法，该方法包括以下步骤：
[0236]
(a)使分析物与上文关于本发明的第一方面所公开的式i化合物反应，由此形成上
文关于本发明的第四方面所公开的复合物，
[0237]
(b)对来自步骤(a)的复合物进行质谱分析。
[0238]
优选地，步骤(b)包括：
[0239]
(i)使复合物的离子进入质谱分析的第一级，从而根据复合物的离子的质荷(m/z)比对复合物的离子进行表征，
[0240]
(ii)使复合物离子裂解，从而第一实体，特别是低分子量实体，并且生成复合物的子离子，其中复合物的子离子在其m/z比上不同于复合物离子，以及
[0241]
(iii)使复合物的子离子进入质谱分析的第二级，从而根据复合物的子离子的m/z比对复合物的子离子进行表征，并且/或者
[0242]
其中(ii)可进一步包括复合物离子的另一种裂解，从而释放出不同于第一实体的第二实体，并且生成复合物的第二子离子，并且
[0243]
其中(iii)可进一步包括使复合物的第一子离子和第二子离子进入质谱分析的第二级，从而根据复合物的第一子离子和第二子离子的m/z比对复合物的第一子离子和第二子离子进行表征。
[0244]
步骤(a)可在质谱测定之前的样品制备工作流程内的不同阶段发生。包含分析物分子的样品可通过各种方法进行预处理和/或富集。预处理方法取决于样品的类型，诸如血液(新鲜血液或干血)、血浆、血清、尿液或唾液，而富集方法则取决于目标分析物。哪种预处理样品适用于哪种样品类型是技术人员众所周知的。哪种富集方法适用于哪种目标分析物也是技术人员众所周知的。
[0245]
在本发明的第六方面的实施例中，本方法的对分析物分子进行质谱测定的方法的步骤(a)发生在i)样品的预处理步骤之后，ii)样品的第一次富集之后，或iii)样品的第二次富集之后。
[0246]
在本发明的第六方面的实施例中，样品为全血液样品，将其分配到两个预定义的样品预处理(pt)工作流程中的一个，两个工作流程均包括添加内标(istd)和溶血试剂(hr)以及之后的预定义孵育期(inc)，其中两个工作流程之间的差异之处是添加内标(istd)和溶血试剂(hr)的次序。在实施例中，加入水作为溶血试剂，特别是以0.5∶1至20∶1ml水/ml样品的量加入，特别是以1∶1至10∶1ml水/ml样品的量加入，特别是以2∶1至5∶1ml水/ml样品的量加入。
[0247]
在本发明的第六方面的实施例中，样品是尿液样品，将其分配到其他两个预定义的样品pt工作流程中的一个，两个工作流程均包括添加内标和酶试剂以及之后的预定义孵育期，其中两个工作流程之间的差异之处是添加内标和酶试剂的次序。酶试剂通常是用于葡糖苷酸裂解或蛋白质裂解或对分析物或基质进行任何预处理的试剂。在另外的步骤中，添加衍生化试剂诸如上文或下文中所公开的本发明化合物，之后为孵育期。
[0248]
在本发明的第六方面的实施例中，酶试剂选自由以下项组成的组：葡萄糖醛酸酶、(部分的)外切型或内切型去糖基化酶、或外切型或内切型蛋白酶。在实施例中，以0.5至10mg/ml的量，特别是以1至8mg/ml的量，特别是以2至5mg/ml的量，来添加葡萄糖醛酸酶。
[0249]
在本发明的第六方面的实施例中，其中样品是血浆或血清，将其分配到另一预定义pt工作流程，该工作流程仅包括添加内标(istd)以及之后的预定义孵育时间。
[0250]
本领域的技术人员熟知选择用于上文或下文所考虑和指定的样品处理、化学反应
或方法步骤的孵育时间和温度。特别地，本领域的技术人员知道孵育时间和温度相互依赖，因为例如高温通常导致孵育时间较短，反之亦然。在本发明的第六方面的实施例中，孵育温度在4℃至45℃的范围内，特别是在10℃至40℃的范围内，特别是在20℃至37℃(例如20℃、25℃、30℃、35℃或37℃)的范围内。在实施例中，孵育时间在30秒至120分钟，特别是30秒至1分钟、30秒至5分钟、30秒至10分钟、1分钟至10分钟或1分钟至20分钟、10分钟至30分钟、30分钟至60分钟或60分钟至120分钟范围内。在特定实施例中，孵育时间为36秒的倍数(例如m x 36秒，其中m＝0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
[0251]
据此，在本方法的实施例中，步骤a)发生在上文公开的样品预处理过程之后。
[0252]
在本发明的第六方面的实施例中，步骤a)中式i化合物与分析物分子的反应发生在任何富集过程之前，将式i化合物添加到经过预处理的目标样品中。因此，在预处理之后以及第一富集过程之前，形成分析物分子与式i化合物的复合物。因此，复合物在经历步骤b)的质谱分析之前经历第一富集过程和第二富集过程。
[0253]
经过预处理的样品可以进一步经历分析物富集工作流程。分析物富集工作流程可包括一种或多种富集方法。富集方法在本领域中众所周知，包括但不限于化学富集方法(包括但不限于化学沉淀)和使用固相的富集方法(包括但不限于固相萃取方法、珠粒工作流程和色谱方法(例如气相色谱法或液相色谱法))。
[0254]
在本发明的第六方面的实施例中，第一富集工作流程包括向预处理后的样品中加入固相，特别是携带分析物选择性基团的固相珠粒。在本发明的第六方面的实施例中，第一富集工作流程包括向预处理后的样品中加入携带分析物选择性基团的磁性或顺磁性珠粒。在本发明第六方面的实施例中，磁珠的添加包括搅拌或混合。然后经过预定义的孵育期，将一种或多种目标分析物捕获到珠粒上。在本发明第六方面的实施例中，工作流程包括在与磁珠一起孵育之后的洗涤步骤(w1)。依据分析物，执行一个或多个另外的洗涤步骤(w2)。一个洗涤步骤(w1、w2)包括一系列包括以下项的步骤：通过包含磁体或电磁体的磁珠处置单元来分离磁珠、抽吸液体、添加洗涤缓冲液、将磁珠重新悬浮、另一个磁珠分离步骤和另一次抽吸液体。此外，除洗涤循环的体积和次数或组合之外，洗涤步骤可因溶剂类型(水/有机物/盐/ph)的不同而有所不同。如何选择相应的参数是技术人员众所周知的。在最后一个洗涤步骤(w1、w2)之后，添加洗脱试剂，之后将磁珠重新悬浮，并经历预定义孵育期，以用于从磁珠释放目标分析物。然后分离无结合物的磁珠，并捕获含有经过衍生化的目标分析物的上清液。
[0255]
在本发明的第六方面的实施例中，第一富集工作流程包括向预处理后的样品中加入携带基质选择性基团的磁珠。在本发明第六方面的实施例中，磁珠的添加包括搅拌或混合。之后是用于将基质捕获在珠上的预定义孵育期。此时，目标分析物并未与磁珠结合，而是保留在上清液中。之后，分离磁珠，并收集含有经过富集的目标分析物的上清液。
[0256]
在本发明第六方面的实施例中，使上清液经历第二富集工作流程。此时将上清液转移至lc站，或者在添加稀释液的稀释步骤之后将其转移至lc站。通过改变例如溶解类型(水/有机物/盐/ph)和体积，也可以使用不同的洗脱规程/试剂。各种参数是技术人员众所周知并且容易选择的。
[0257]
在本发明第六方面的实施例中，其中本方法的步骤a)不直接发生在预处理方法之后，步骤a)可发生在如上文中所述使用磁珠进行的第一富集工作流程之后。
[0258]
在本发明的第六方面的实施例中，其中使用分析物特异性磁珠，在洗涤步骤(w1，w2)完成之后，在洗脱试剂之前、同时或之后，将上文或下文所公开的式i化合物加入目标样品中，然后经过孵育期(确定的时间和温度)处理。
[0259]
在本发明的第六方面的实施例中，然后分离未结合的磁珠，并且收集含有步骤a)的复合物的上清液。在本发明的第六方面的实施例中，将包含步骤a)的复合物的上清液转移至第二富集工作流程，特别是直接转移至lc站，或在加入稀释液的稀释步骤之后转移。
[0260]
在本发明的第六方面的实施例中，使用基质特异性磁珠，在分离磁珠之前或之后，将上文或下文所公开的式i化合物加入目标样品中。在本发明的第六方面的实施例中，将包含步骤a)的复合物的上清液转移至第二富集工作流程，特别是直接至lc站，或在加入稀释液的稀释步骤之后转移。
[0261]
因此，在本发明的第六方面的实施例中，其中步骤a)中式i化合物与分析物分子的反应发生在第一富集过程之后，在第一富集过程(特别是使用磁珠的第一富集过程)完成之后，将式i化合物加入目标样品中。因此，首先如上所述对样品进行预处理，然后对其进行第一富集过程，特别是使用携带如上所述的分析物选择性基团的磁珠进行富集，并且在从磁珠中洗脱之前、同时或之后加入式i化合物。因此，在第一富集过程之后和第二富集过程之前，形成分析物分子与式i化合物的复合物。因此，复合物在经历步骤b)的质谱分析之前经历第二富集过程。
[0262]
在本发明的第六方面的另一个实施例中，本方法的步骤(a)发生在第二分析物富集工作流程之后。在第二富集工作流程中，使用色谱分离进一步富集样品中的目标分析物。在本发明的第六方面的实施例中，色谱分离是气相色谱或液相色谱。两种方法均是技术人员众所周知的。在本发明的第六方面的实施例中，液相色谱法选自由以下项组成的组：hplc、快速lc、微流-lc、流动注射以及捕集和洗脱。
[0263]
在本发明的第六方面的实施例中，本方法的步骤a)在色谱分离的同时或之后发生。在本发明的第六方面的实施例中，将式i化合物与洗脱缓冲液一起加入柱中。在替代实施例中，式i化合物在柱后添加。
[0264]
在本发明的第六方面的实施例中，第一富集过程包括使用分析物选择性磁珠。在本发明第六方面的实施例中，第二富集过程包括使用色谱分离，特别是使用液相色谱。
[0265]
因此，在本发明的第六方面的实施例中，其中步骤a)中式i化合物与分析物分子的反应发生在第二富集过程之后，在使用色谱(特别是液相色谱)的第二富集过程完成之后，将式i化合物加入目标样品中。因此，在这种情况下，首先对样品进行如上文所述的预处理，然后对其进行第一富集过程，特别是如上所述使用磁珠进行富集，然后进行色谱分离(特别是使用液相色谱)，并且在色谱分离之后加入式i化合物。因此，在第二富集过程之后，形成结合分析物分子与式i结合化合物的复合物。因此，复合物在经历步骤b)的质谱分析之前不经历富集过程。磁珠对于技术人员来说是已知的并且因此不进行详细解释。
[0266]
在第七方面，本发明涉及式v化合物：
[0267][0268]
其中取代基b1、b2、b4中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团q，
[0269]
其中其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b4各自独立地选自氢、卤素、烷基、n-酰基氨基、n，n-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基(aryloyl)、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基(aryloyloxy)、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、其同位素或衍生物，
[0270]
其中b3选自烷基、乙酰基、乙烯基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的苄基、未取代的苄基、经取代的环烷基、未取代的环烷基、其同位素和衍生物，
[0271]
其中y1和y2各自独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族、胺，或者其中y1和y2形成选自经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族的环结构。
[0272]
针对本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面和/或本发明的第四方面和/或本发明的第五方面和/或本发明的第六方面所提及的所有实施例均适用于本发明的第七方面，反之亦然。特别地，针对本发明的第一方面提及的所有实施例，例如对于a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b3、b4、y1和y2，适用于式v化合物。特别地，式v化合物能够用于质谱测定。替代地或另外地，式v化合物可以用于其他技术领域，例如化学标记和药物递送。
[0273]
在本发明的实施例中，临床诊断系统包括本发明的第一方面的化合物和/或本发明的第二方面的组合物和/或本发明的第三方面的试剂盒和/或本发明的第四方面的复合物。另外地或任选地，本发明的第一方面的化合物用于分析物的质谱测定，其中临床诊断系统包括质谱测定。另外地或任选地，本发明的第六方面的分析物的质谱测定方法由临床诊断系统执行。
[0274]“临床诊断系统”是实验室自动化设备，专门用来分析用于体外诊断的样品。根据需要和/或根据期望的实验室工作流，临床诊断系统可具有不同的配置。通过将多个设备和/或模块耦接在一起，可获得附加配置。“模块”是具有专用功能的工作单元，通常比整个临床诊断系统更小。此功能可以是分析功能，但也可以是分析前功能或分析后功能，或者可以是分析前功能、分析功能或分析后功能中的任一个的辅助功能。特别地，模块可配置为与一个或多个其他模块协作以用于例如通过执行一个或多个分析前步骤和/或分析步骤和/
或分析后步骤来执行样品处理工作流的专用任务。特别地，临床诊断系统可以包括一个或多个分析设备，该一个或多个分析设备设计为执行针对某些类型的分析进行优化的相应工作流程，该分析为例如，临床化学、免疫化学、凝血、血液学、液相色谱分离、质谱等。因此，临床诊断系统可以包括一个分析设备或具有相应工作流程的任何此类分析设备的组合，其中分析前模块和/或分析后模块可耦接至单独的分析设备或可由多个分析设备共享。在替代方案中，可通过集成在分析设备中的单元来执行分析前功能和/或分析后功能。临床诊断系统可包括功能单元，诸如用于吸移和/或泵送和/或混合样品和/或试剂和/或系统流体的液体处理单元，以及用于分类、存储、运输、识别、分离、检测的功能单元。临床诊断系统可以包括用于自动化制备包含目标分析物的样品的样品制备站、包括多个lc通道的液相色谱(lc)分离站，和/或用于将制备的样品输入至lc通道中的任何一个lc通道中的样品制备/lc接口。临床诊断系统可以进一步包括编程为将样品分配至预定义的样品制备工作流程的控制器，每个工作流程均包括预定义的样品制备步骤次序且需要预定义的完成时间(视目标分析物而定)。临床诊断系统可以进一步包括质谱仪(ms)和用于将lc分离站连接到质谱仪的lc/ms接口。如本文所用，术语“自动地”或“自动化”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体地可指但不限于完全借助于至少一台计算机和/或至少一个计算机网络和/或至少一台机器来执行的过程，特别地，不需要手动操作和/或与用户交互。
[0275]“样品制备站”可以为耦接至一个或多个分析设备或分析设备中的单元的预分析模块，其设计为执行一系列样品处理步骤，这些样品处理步骤旨在除去或至少减少样品中的干扰基质组分和/或富集样品中的目标分析物。此类处理步骤可包括对一个样品或多个样品顺序地、并行地或交错地执行的以下处理操作中的任一项或多项：吸移(抽吸和/或分配)流体、泵送流体、与试剂混合、在一定温度下培育、加热或冷却、离心、分离、过滤、筛分、干燥、洗涤、重悬、等分、转移、储存...等)。
[0276]“液相色谱(lc)分离站”为分析设备或分析设备中的模块或单元，其设计为使制备的样品经历色谱分离，以便例如将目标分析物与基质组分分离，该基质组分为例如在样品制备后仍可能干扰后续检测例如质谱检测的剩余基质组分，和/或以便将目标分析物相互分离，以便能够对其进行单独检测。根据一个实施例，lc分离站为中间分析设备或分析设备中的模块或单元，其设计为制备用于质谱的样品和/或将制备的样品转移至质谱仪。特别地，lc分离站为包括多个lc通道的多通道lc站。
[0277]
临床诊断系统(例如样品制备站)还可以包括用于在启动新的样品制备起始顺序之前接收多个样品的缓冲单元，其中可以单独随机取用样品并且可以根据样品制备起始顺序来启动该样品的单独制备。
[0278]
临床诊断系统更方便且更可靠地利用lc-质谱联用，因此适用于临床诊断。特别地，可以获得高通量(例如高达100个样品/小时或更多)，并能随机访问样品制备和lc分离，同时能够在线耦接至质谱。此外，该过程可以完全自动化，从而增加了自动操作(walk-away)时间并降低了所需的技能水平。
[0279]
在其他实施例中，本发明涉及以下方面：
[0280]
1.一种用于分析物的质谱测定的式i化合物：
[0281][0282]
其中取代基b1、b2、b4中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团q，
[0283]
其中其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b4各自独立地选自氢、卤素、烷基、n-酰基氨基、n，n-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基(aryloyl)、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基(aryloyloxy)、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、其同位素或衍生物，
[0284]
其中b3选自烷基、乙酰基、乙烯基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的苄基、未取代的苄基、经取代的环烷基、未取代的环烷基、其同位素和衍生物，
[0285]
其中y1和y2各自独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族、胺，或者其中y1和y2形成选自经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族的环结构。
[0286]
2.根据方面1所述的化合物，其包含具有以下式的结构：
[0287][0288]
3.根据方面1或2所述的化合物，其中偶联基团q根据下式ii与x键合：
[0289]
[0290]
其中k为能够与分析物形成共价键的反应性单元，
[0291]
其中n为0、1、2、3、4或5，并且
[0292]
其中x为式i的咪唑的碳原子。
[0293]
4.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中b1为q。
[0294]
5.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中b2为q。
[0295]
6.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中k能够与分析物的羰基基团、酚基团、胺、羟基基团或二烯基团反应。
[0296]
7.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中k选自由以下项组成的组：酰肼、肼、羟胺和反应性羰基。
[0297]
8.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中q选自由以下项组成的组：亚甲基酰肼、亚甲基肼、亚甲基羟胺。
[0298]
9.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中不形成偶联基团q的其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b3、b4各自独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、丁基、叔丁基或甲氧基。
[0299]
10.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中q为乙酰肼或羰基酰肼。
[0300]
11.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中b3为烷基。
[0301]
12.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中b3为甲基或b3为乙基。
[0302]
13.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中a1为h或a1为甲氧基。
[0303]
14.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中a2为h或a2为甲氧基。
[0304]
15.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中a3为h或a3为甲氧基。
[0305]
16.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中a4为h或a4为甲氧基。
[0306]
17.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中a5为h或a5为甲氧基。
[0307]
18.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中y1为h或者y1与y2形成稠合芳族或杂芳族环结构。
[0308]
19.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中y2为h或者y2与y1形成稠合芳族或杂芳族环结构。
[0309]
20.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中b1为h，特别是在b2为q的情况下。
[0310]
21.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中b4为h。
[0311]
22.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中b2为h，特别是在b1为q的情况下。
[0312]
23.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中化合物为带永久正电荷的。
[0313]
24.根据前述方面中任一项所述的化合物，其中化合物包含用于形成盐的抗衡离子，其中抗衡离子优选地选自下组：cl-、br-、f-、甲酸根、三氟乙酸根、pf
6-、磺酸根、磷酸根、乙酸根。
[0314]
25.一种组合物，其包含根据方面1至24中任一项所述的化合物。
[0315]
26.一种试剂盒，其包含根据方面1至24中任一项所述的化合物或根据方面25所述的组合物。
[0316]
27.一种用于使用质谱测定来检测分析物的复合物，其包含彼此共价连接的结合分析物和结合化合物，特别是其中通过分析物与根据方面1至24中任一项所述的化合物的化学反应来形成复合物。
[0317]
28.根据方面27所述的复合物，其中所述结合化合物包含式iii和式iv：
[0318][0319]
其中取代基b1、b2、b4中的一者为与分析物形成共价键的偶联基团q*
[0320]
其中其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b4各自独立地选自氢、卤素、烷基、n-酰基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、其同位素或衍生物，
[0321]
其中b3选自烷基、乙酰基、乙烯基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的苄基、未取代的苄基、经取代的环烷基、未取代的环烷基、其同位素和衍生物，
[0322]
其中y1和y2各自独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、胺，或者其中y1和y2形成选自经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的芳族、苄基型、未取代的芳族、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族的环结构，其中n*为0、1、2、3、4或5，
[0323]
其中结合分析物经由k*共价键合，
[0324]
其中x*为式iii的咪唑的碳原子。
[0325]
29.根据前述方面27至28中任一项所述的复合物，其中分析物选自由以下项组成的组：核酸、氨基酸、肽、蛋白质、代谢物、激素、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、以其他分子的某种修饰为特征的分子、已经由生物体内化的物质、此类物质的代谢物、以及它们的组合。
[0326]
30.根据前述方面27至29中任一项所述的复合物，其中结合化合物经由分析物的羰基基团、羟基基团或二烯基团共价连接，以形成所述复合物。
[0327]
31.根据方面1至24中任一项所述的化合物用于分析物的质谱测定的用途。
[0328]
32.根据方面31所述的化合物的用途，其中质谱测定包括串联质谱测定，特别是三重四极杆质谱测定。
[0329]
33.一种用于分析物的质谱测定的方法，其包括以下步骤：
[0330]
(a)使分析物与如方面1至24中任一项中所定义的式i化合物反应，由此形成如方面27至30中任一项中所定义的复合物，
[0331]
(b)对来自步骤(a)的复合物进行质谱分析。
[0332]
34.根据方面33所述的方法，其中质谱分析步骤(b)包括：
[0333]
(i)使复合物的离子进入质谱分析的第一级，从而根据复合物的离子的质荷(m/z)比对复合物的离子进行表征，
[0334]
(ii)使复合物离子裂解，从而释放出第一实体，特别是低分子量实体，并且生成复合物的子离子，其中复合物的子离子在其m/z比上不同于复合物离子，以及
[0335]
(iii)使复合物的子离子进入质谱分析的第二级，从而根据复合物的子离子的m/z比对复合物的子离子进行表征，并且/或者
[0336]
其中(ii)可进一步包括复合物离子的另一种裂解，从而释放出不同于第一实体的第二实体，并且生成复合物的第二子离子，并且
[0337]
其中(iii)可进一步包括使复合物的第一子离子和第二子离子进入质谱分析的第二级，从而根据复合物的第一子离子和第二子离子的m/z比对复合物的第一子离子和第二子离子进行表征。
[0338]
35.一种式v化合物：
[0339][0340]
其中取代基b1、b2、b4中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团q，
[0341]
其中其他取代基a1、a2、a3、a4、a5、b1、b2、b4各自独立地选自氢、卤素、烷基、n-酰基氨基、n，n-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基(aryloyl)、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基(aryloyloxy)、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、其同位素或衍生物，
[0342]
其中b3选自烷基、乙酰基、乙烯基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的苄基、未取代的苄基、经取代的环烷基、未取代的环烷基、其同位素和衍生物，
[0343]
其中y1和y2各自独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族、胺，或者其中y1和y2形成选自经取代的环烷基、未取代的环烷基、经取代的芳族、未取代的芳族、经取代的杂芳族、未取代的杂芳族的环结构。
[0344]
实例
[0345]
提供以下实施例以说明本发明，但不限制受权利要求书保护的本发明。
[0346]
实例1：标记物1的合成
[0347][0348]
步骤1：咪唑烷基化：3-苄基咪唑-4-甲酸甲酯的合成
[0349][0350]
将4-咪唑甲酸甲酯(0.622mmol)、苄基氯(1.130mmol)和碳酸钾(1.198mmol)的混合物溶解在chcl3(1ml)中。将溶液在70℃下搅拌7h。将反应混合物过滤并且用一些氯仿洗涤。真空去除溶剂。粗混合物经历硅胶柱色谱法纯化(己烷/etoac(2：3)至纯etoac)，从而得到20.4mg(15％)所需产物，其为无色油状物。
[0351]1h nmr(600mhz，氯仿-d)δppm 3.82(s，3h)5.53(s，2h)7.18(d，j＝7.12hz，2h)7.29-7.36(m，3h)7.63(s，1h)7.78(s，1h)。
[0352]
13
c nmr(150mhz，氯仿-d)δppm 50.02(1c)51.47(1c)122.44(1c)127.29(2c)128.11(1c)128.88(2c)136.15(1c)138.08(1c)142.22(1c)160.62(1c)。
[0353]
hplc-ms(m/z)[m+h]+计算值217.10，实测值217.33。
[0354]
步骤2：甲基化：3-苄基-1-甲基咪唑-1-鎓-4-甲酸三氟乙酸甲酯的合成
[0355][0356]
将苄基咪唑-4-甲酸甲酯(0.094mmol)的混合物溶解在无水dmf(1ml)中并且添加碘甲烷(0.321mmol)。将溶液在80℃下搅拌24h。将反应混合物用meoh淬灭，并且真空去除溶剂。粗品混合物经历制备型hplc纯化，从而得到24.8mg(77％)作为tfa盐的产物，其为无色油状物。
[0357]
hplc方法c-18柱：
[0358]
0min：98％h2o 0.1％tfa，2％ch3cn 0.1％tfa；
[0359]
0-40min：2％h2o 0.1％tfa，98％ch3cn 0.1％tfa；
[0360]
40-45min：2％h2o 0.1％tfa；98％ch3cn 0.1％tfa；
[0361]
45-46min：60％h2o 0.1％tfa；40％ch3cn 0.1％tfa；
[0362]
46-49min：60％h2o 0.1％tfa；40％ch3cn 0.1％tfa；
[0363]
49-50min：60％h2o 0.1％tfa；40％ch3cn 0.1％tfa。
[0364]
hplc-ms(m/z)[m]+计算值231.11，实测值231.43。
[0365]
步骤3：酰肼形成：[(3-苄基-1-甲基咪唑-1-鎓-4-羰基)氨基]双三氟乙酸铵的合成
[0366][0367]
将咪唑鎓衍生物(0.072mmol)溶解在1ml的meoh中。加入一水合肼(0.720mmol)并且将反应混合物在50℃下搅拌3h。粗反应混合物不经纯化即可用于下一步。
[0368]1h nmr(400mhz，d2o)δppm 3.77(s，3h)5.47(s，2h)7.15-7.17(m，2h)7.29-7.32(m，3h)7.77(s，1h)。由于h/d交换，咪唑单元上的一个质子信号(s，1h)缺失。
[0369]
13
c nmr(101mhz，d2o)δppm 36.09(1c)51.92(1c)125.25(1c)125.73(1c)128.03(2c)129.04(1c)129.12(2c)133.31(1c)138.83(1c)158.00(1c)。
[0370]
实例2：标记物2的合成
[0371][0372]
步骤1：咪唑烷基化：1-苄基咪唑-4-甲酸甲酯的合成
[0373][0374]
将4-咪唑甲酸甲酯(0.622mmol)、苄基氯(1.130mmol)和碳酸钾(1.198mmol)的混合物溶解在chcl3(1ml)中。将溶液在70℃下搅拌7h。将反应混合物过滤并且用一些氯仿洗涤。真空去除溶剂。粗混合物经历硅胶柱色谱法纯化(己烷/etoac(2∶3)至纯etoac)，从而得到54.4mg(40％)所需产物，其为无色油状物。
[0375]1h nmr(600mhz，氯仿-d)δppm 3.83(s，3h)5.10(s，2h)7.15(d，j＝6.41hz，2h)7.30-7.36(m，3h)7.52(s，1h)7.56(s，1h)。
[0376]
13
c nmr(150mhz，氯仿-d)δppm 51.28(1c)51.57(1c)125.31(1c)127.49(2c)
128.67(1c)129.14(2c)134.06(1c)134.86(1c)138.00(1c)163.13(1c)。
[0377]
hplc-ms(m/z)[m+h]+计算值217.10，实测值217.33。
[0378]
步骤2：甲基化：1-苄基-3-甲基咪唑-3-鎓-4-甲酸三氟乙酸甲酯的合成
[0379][0380]
将苄基咪唑-4-甲酸甲酯(0.252mmol)的混合物溶解在无水dmf(1ml)中并且添加碘甲烷(0.723mmol)。将溶液在80℃下搅拌24h。将反应混合物用meoh淬灭，并且真空去除溶剂。粗品混合物经历制备型hplc纯化，从而得到74.9mg(86％)作为tfa盐的产物，其为无色油状物。
[0381]
hplc方法c-18柱：
[0382]
0min：98％h2o 0.1％tfa，2％ch3cn 0.1％tfa；
[0383]
0-40min：2％h2o 0.1％tfa，98％ch3cn 0.1％tfa；
[0384]
40-45min：2％h2o 0.1％tfa；98％ch3cn 0.1％tfa；
[0385]
45-46min：60％h2o 0.1％tfa；40％ch3cn 0.1％tfa；
[0386]
46-49min：60％h2o 0.1％tfa；40％ch3cn 0.1％tfa；
[0387]
49-50min：60％h2o 0.1％tfa；40％ch3cn 0.1％tfa。
[0388]
hplc-ms(m/z)[m]+计算值231.11，实测值231.43。
[0389]
步骤3：酰肼形成：[(1-苄基-3-甲基咪唑-3-鎓-4-羰基)氨基]双三氟乙酸铵的合成
[0390][0391]
将咪唑鎓衍生物(0.218mmol)溶解在1ml的meoh中。加入一水合肼(2.058mmol)并且将反应混合物在50℃下搅拌3h。粗反应混合物不经纯化即可用于下一步。
[0392]1h nmr(400mhz，d2o)δppm 3.83(s，3h)5.26(s，2h)7.25-7.35(m，5h)7.77(s，1h)8.77(s，1h)。
[0393]
13
c nmr(101mhz，d2o)δppm 35.56(1c)53.21(1c)123.54(1c)128.72(2c)129.32(2c)129.44(1c)132.68(1c)138.82(1c)158.10(1c)。
[0394]
实例3：用于睾酮与酰肼衍生物反应的一般方案：
[0395][0396]
将酰肼衍生物(0.072mmol)溶解在无水meoh(1ml)中并且添加睾酮(0.052mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜。真空去除溶剂，并且粗混合物经历制备型hplc纯化，从而得到所需产物，其为白色固体。
[0397]
实例3.1：标记物1-睾酮衍生物的制备
[0398][0399]
将粗[(3-苄基-1-甲基咪唑-1-鎓-4-羰基)氨基]-双三氟乙酸铵(0.072mmol)的混合物溶解在无水meoh(1ml)中并且添加睾酮(0.052mmol)。将溶液在室温下搅拌20h。真空去除溶剂，并且粗混合物经历制备型hplc纯化，从而得到31.8mg(97％)所需产物，其为无色固体。
[0400]
hplc方法c-18柱：
[0401]
0min：98％h2o，2％ch3cn；
[0402]
0-45min：2％h2o，98％ch3cn；
[0403]
45-46min：0％h2o；100％ch3cn；
[0404]
46-55min：0％h2o；100％ch3cn；
[0405]
55-56min：50％h2o；50％ch3cn。
[0406]
hplc-ms(m/z)[m]+计算值501.32，实测值501.67。
[0407]
实例3.2：标记物2-睾酮衍生物的制备
[0408][0409]
将粗[(1-苄基-3-甲基咪唑-3-鎓-4-羰基)氨基]-双三氟乙酸铵(0.218mmol)的混合物溶解在无水meoh(1ml)中并且添加睾酮(0.177mmol)。将溶液在室温下搅拌20h。真空去除溶剂，并且粗混合物经历制备型hplc纯化，从而得到16.3mg(12％)所需产物，其为无色固体。
[0410]
hplc方法c-18柱：
[0411]
0min：98％h2o，2％ch3cn；
[0412]
0-10min：98％h2o，2％ch3cn；
[0413]
10-60min：30％h2o；70％ch3cn；
[0414]
60-70min：0％h2o；100％ch3cn；
[0415]
70-71min：50％h2o；50％ch3cn。
[0416]
hplc-ms(m/z)[m]+计算值501.32，实测值501.67。
[0417]
实例4：使用标记物1或标记物2对睾酮进行分析衍生化
[0418]
在甲醇中制备500ng/ml的睾酮溶液(s1)。加入与溶液(s1)相比，包含稀释在甲醇中的过量衍生化试剂(标记物1或标记物2)中任一种(摩尔比》1000)的溶液(s2)，并且用冰乙酸(20％v/v)使其酸化。将溶液s1和s2混合，从而得到溶液s3，然后在65℃下保持2h并且在室温下保持12h。12h后，用甲醇稀释溶液s3，以根据睾酮的分子质量给出五个浓度的浓缩水平，分别为1当量睾酮；1/20当量睾酮；1/40当量睾酮；1/100当量睾酮和1/200当量睾酮。选择1veq仍在检测器的线性范围内，而1/200当量睾酮在所用仪器的检测限以下。例如，waters quattro micro系统采用了以下浓度(100ng/mll；5ng/ml；2.5ng/ml；1ng/ml；500pg/ml)。用溶液s2制备0ng/ml的空白溶液。
[0419]
在分析物分子衍生化后，可能得到异构体，其往往产生多个峰。需要以对这些异构体的特性进行相对定量的方式，解决这些异构体的色谱行为问题。举例而言，图1描述了在5％的绝对峰高下应用某种色谱方法的信号随时间的分布，其单位为％。参数“分裂”描述了色谱系统分离衍生化反应产生分析物分子异构体的能力。如果使用反相色谱材料进行分离，则在异构体峰重心中测量的保留时间可描述所得衍生物的极性。面积a1和a2以信号计数*min来测量，并分别以相应的比率报告所得衍生异构体。如果峰a1和峰a2的比率为50/50，则所得异构体以相同的量产生。如果标记物影响该比率，使其不等于50/50，则主要产生一种异构体。因此，信号强度分布不均，并由此相对于不受影响的背景噪声提高信号高度。
[0420]
对于每种标记物质，经液相色谱分离后，已用电喷雾离子化质谱来测量相应的睾酮衍生物，并且已使用15v、20v、25v、30v、35v和40v的碰撞能量来执行不同的裂解扫描。
[0421]
已经将分子离子峰和丰度最高的碎片离子峰(中性丢失)的质量信号用于裂解优化。如果涉及到中性丢失单元带电分子的信号增益，则裂解能量是最重要的调谐参数之一。裂解能量至关重要，因为在源和其他离子路径条件下，分子需要不发生裂解。中性丢失碎片的裂解只应发生在碰撞池(和/或相关装置)中，以形成特定的目标碎片。如果用于中性丢失碎片的裂解碰撞能量非常高，则可能发生其他不需要的裂解途径，导致中性丢失裂解途径的信号强度损失。因此，为获得最佳的裂解行为，碰撞能量不应过小，也不应过大。已将根据相应的碰撞能量获得的最大峰面积用于其他检测限定量方法中。
[0422]
对于每种标记物质，将相应的睾酮衍生物通过液相色谱注射至质谱仪中，已将相应的睾酮衍生物在三重四极杆质谱仪上进行了调谐。调谐参数为碰撞能量，其导致在五次独立的碰撞能量实验中获得最高的相应色谱峰信号。
[0423]
色谱和ms参数
[0424]
极性 es+
[0425]
校准 静态2
[0426]
软传输模式禁用
[0427]
毛细管(kv)3.003.14
[0428]
锥体(v)50.00144.92
[0429]
源补偿电压(v)30.0
[0430]
源温度(℃)140140
[0431]
脱溶剂温度(℃)350350
[0432]
锥孔气体流速(l/hr)150149
[0433]
脱溶剂气体流速(l/hr)1000990
[0434]
碰撞气体流速(ml/min)0.150.14
[0435]
雾化器气体流量(巴)7.006.52
[0436]
lm1分辨率3.0
[0437]
hm1分辨率15.0
[0438]
离子能量1-0.2
[0439]
ms模式碰撞能量4.00
[0440]
msms模式碰撞能量2.00
[0441]
ms模式入口电压1.00
[0442]
ms模式出口电压1.00
[0443]
气体打开ms模式入口电压1.00
[0444]
气体打开ms模式出口电压1.00
[0445]
气体打开msms模式入口电压1.00
[0446]
气体打开msms模式出口电压1.00
[0447]
气体关闭ms模式入口电压30.00
[0448]
气体关闭ms模式出口电压30.00
[0449]
气体关闭msms模式入口电压30.00
[0450]
气体关闭msms模式出口电压30.00
[0451]
scanwavems模式入口电压1.00
[0452]
scanwavems模式出口电压1.00
[0453]
scanwavemsms模式入口电压1.00
[0454]
scanwavemsms模式出口电压1.00
[0455]
lm2分辨率3.0
[0456]
hm2分辨率15.0
[0457]
离子能量20.2
[0458]
增益1.00
[0459]
检测器放大倍数513.80
[0460]
活动储存器c
[0461]
锥形能量斜坡：禁用
[0462]
探针温度斜坡：禁用
[0463]
碰撞能量斜坡：禁用
[0464]
仪器参数-功能2：
[0465]
参数文件-e：\regulatedprojects\esi-derivatization_pda.pro\acqudb\
cz20mrz2019-testo-label-general_tuning.ipr
[0466]
极性es+
[0467]
校准静态2
[0468]
软传输模式禁用
[0469]
毛细管(kv)3.003.14
[0470]
锥体(v)50.00144.92
[0471]
源补偿电压(v)30.0
[0472]
源温度(℃)140140
[0473]
脱溶剂温度(℃)350350
[0474]
锥孔气体流速(l/hr)150149
[0475]
脱溶剂气体流速(l/hr)1000990
[0476]
碰撞气体流速(ml/min)0.150.14
[0477]
雾化器气体流量(巴)7.006.52
[0478]
lm1分辨率3.0
[0479]
hm1分辨率15.0
[0480]
离子能量1-0.2
[0481]
ms模式碰撞能量4.00
[0482]
msms模式碰撞能量2.00
[0483]
ms模式入口电压1.00
[0484]
ms模式出口电压1.00
[0485]
气体打开ms模式入口电压1.00
[0486]
气体打开ms模式出口电压1.00
[0487]
气体打开msms模式入口电压1.00
[0488]
气体打开msms模式出口电压1.00
[0489]
气体关闭ms模式入口电压30.00
[0490]
气体关闭ms模式出口电压30.00
[0491]
气体关闭msms模式入口电压30.00
[0492]
气体关闭msms模式出口电压30.00
[0493]
scanwavems模式入口电压1.00
[0494]
scanwavems模式出口电压1.00
[0495]
scanwavemsms模式入口电压1.00
[0496]
scanwavemsms模式出口电压1.00
[0497]
lm2分辨率3.0
[0498]
hm2分辨率15.0
[0499]
离子能量20.2
[0500]
增益1.00
[0501]
检测器放大倍数513.80
[0502]
活动储存器c
[0503]
锥形能量斜坡：禁用
[0504]
探针温度斜坡：禁用
[0505]
碰撞能量斜坡：禁用
[0506]
工程师设置：
[0507]
ms1低质量位置673
[0508]
ms1高质量位置335
[0509]
ms1低质量分辨率215
[0510]
ms1高质量分辨率2152
[0511]
ms1分辨率线性531
[0512]
ms1高质量直流平衡0.07
[0513]
ms1直流极性阴性
[0514]
ms2低质量位置672
[0515]
ms2高质量位置291
[0516]
ms2低质量分辨率219
[0517]
ms2高质量分辨率2162
[0518]
ms2分辨率线性528
[0519]
ms2高质量直流平衡0.50
[0520]
ms2直流极性阴性
[0521]
扫描间延迟：
[0522]
自动模式
[0523]
ms扫描间延迟(秒)0.003
[0524]
极性/模式切换扫描间延迟(秒)0.020
[0525]
增强的扫描间延迟(秒)0.020
[0526]
通道间延迟-见表
[0527]
ms1延迟表：
[0528]
r延迟
[0529]
＜＝1.2500.001
[0530]
＜＝4.0000.002
[0531]
＜＝10.0000.003
[0532]
＜＝20.0000.004
[0533]
＞20.0000.005
[0534]
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
运行方法参数
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
[0535]
watersacquitysds
[0536]
运行时间：6.50min
[0537]
注释：
[0538]
溶剂选择a：a2
[0539]
溶剂选择b：b1
[0540]
低压限：0.000bar
[0541]
高压限：1034.200bar
[0542]
溶剂名称a：水+nh4ac+0.1％甲酸
[0543]
溶剂名称b：meoh+nh4ac+0.1％甲酸
[0544]
开关1：无变化
[0545]
开关2：无变化
[0546]
开关3：无变化
[0547]
密封垫清洗：5.0min
[0548]
出图1：系统压力
[0549]
出图2：％b
[0550]
系统压力数据通道：是
[0551]
流速数据通道：否
[0552]
％a数据通道：否
[0553]
％b数据通道：是
[0554]
初级a压力数据通道：否
[0555]
蓄能器a压力数据通道：否
[0556]
初级b压力数据通道：否
[0557]
蓄能器b压力数据通道：否
[0558]
脱气器压力数据通道：否
[0559]
[梯度表]
[0560]
时间(min)流速％a％b曲线
[0561]
1.初始0.400 60.0 40.0初始
[0562]
2. 0.50 0.400 60.0 40.0 6
[0563]
3. 3.00 0.400 10.0 90.0 6
[0564]
4. 5.00 0.400 10.0 90.0 6
[0565]
5. 5.10 0.400 60.0 40.0 6
[0566]
6. 6.50 0.400 60.0 40.0 6
[0567]
运行事件：是
[0568]
梯度开始(相对于注射)：0ul
[0569]
2d重复：否
[0570]
waters acquity pda
[0571]
运行时间：6.50min
[0572]
pda检测器类型：uplc lg 500nm
[0573]
灯：开
[0574]
采样率：10点/秒
[0575]
滤波器时间常数：0.2000秒
[0576]
曝光时间：自动毫秒
[0577]
插值二阶滤波器区域：否
[0578]
使用uv闭塞滤波器：否
[0579]
3d通道...
[0580]
范围：200至400
[0581]
分辨率：2.4nm
[0582]
初始开关1：无变化
[0583]
初始开关2：无变化
[0584]
waters acquity ftn自动进样器
[0585]
运行时间：6.50min
[0586]
注释：
[0587]
加载之前：已禁用
[0588]
离线循环：自动分钟
[0589]
清洗溶剂名称：acn：水
[0590]
注射前洗涤时间：15.0秒
[0591]
注射后洗涤时间：15.0秒
[0592]
清洗溶剂名称：acn：水
[0593]
稀释度：已禁用
[0594]
稀释体积：0ul
[0595]
延迟时间：0min
[0596]
稀释针放置：自动mm
[0597]
目标柱温：40.0c
[0598]
柱温报警带：已禁用
[0599]
目标样品温度：6.0c
[0600]
样品温度报警带：已禁用
[0601]
注射器抽出率：自动
[0602]
针置管：0.5mm
[0603]
吸气前气隙：自动
[0604]
吸气后气隙：自动
[0605]
柱温数据通道：否
[0606]
室温数据通道：是
[0607]
样品温度数据通道：是
[0608]
样品管理器温度数据通道：否
[0609]
样品压力数据通道：否
[0610]
预热器温度数据通道：否
[0611]
密封力数据通道：否
[0612]
未启用注射模式：否
[0613]
自动添加混合冲程循环：自动
[0614]
自动添加混合冲程体积：自动ul
[0615]
活动预热器：使用控制台配置
[0616]
运行事件：否
[0617]
样品运行进样参数
[0618]
进样体积(ul)-5.00
[0619]
功能1
[0620]
功能中扫描：738
[0621]
循环时间(秒)：自动
[0622]
扫描间延迟(秒)：自动
[0623]
通道间延迟(秒)：自动
[0624]
跨度(da)：0.500
[0625]
开始和结束时间(分钟)：0.000至5.000
[0626]
离子化模式：es+
[0627]
数据类型：增强的sir或mrm
[0628]
功能类型：1通道的mrm
[0629]
chan反应停留(秒)锥形伏特。碰撞能量延迟(秒)
[0630]
化合物
[0631]
1：289.25＞108.780.200调谐25.0自动睾酮
[0632]
功能2
[0633]
功能中扫描：737
[0634]
循环时间(秒)：自动
[0635]
扫描间延迟(秒)：自动
[0636]
通道间延迟(秒)：自动
[0637]
跨度(da)：0.500
[0638]
开始和结束时间(分钟)：0.000至5.000
[0639]
离子化模式：es+
[0640]
数据类型：增强的sir或mrm
[0641]
功能类型：1通道的mrm
[0642]
chan反应停留(秒)锥形伏特。碰撞能量延迟(秒)
[0643]
化合物式|质量
[0644]
1：624.40＞203.000.200调谐40.0自动dma041ce40420.2
[0645]
功能3
[0646]
功能中扫描：3901
[0647]
功能类型：二极管阵列
[0648]
波长范围(nm)：200至400
[0649]
使用dineniso32645中描述的程序，根据线性校准曲线中获得相应的检测限。增强因子的计算基于标记的分析物(例如睾酮)检测限(lod)与未衍生化的分析物(例如睾酮)的lod的比较。例如：lod睾酮6pg/ml，增强因子为10意味着试剂-睾酮的lod为0.6pg/ml。最大的是增强因子，较低的是试剂-分析物的lod。工作流程如图2所示。结果如下表2所示。
[0650]
表2：特异性标记物的结果
[0651][0652]
从表2中可以看出，与非衍生化的分析物相比，标记物1和2以及它们的复合物表现出信号增强。标记物2及其复合物示出比现有技术的衍生化试剂(例如来自sciex的girard t和amplifex)更好的增强因子。
[0653]
除了睾酮外，可以选择其他分析物(例如雌二醇或维生素d)作为目标分析物。与非衍生化的分析物相比，具有这些其他分析物的复合物表现出信号增强。
[0654]
该专利申请请求欧洲专利申请20175799.4的优先权，其中该欧洲专利申请的内容通过引用并入本文。