用于产生病毒样颗粒的载体及其用途的制作方法

本公开提供了用于产生病毒样颗粒(vlp)的载体和用其治疗受试者的方法。

背景技术：

1、尽管疫苗技术取得了许多进步，但病毒感染仍然是一种普遍存在的健康问题，通常受到有限的控制。例如，无论是在全球传播还是在经济影响方面，covid-19冠状病毒大流行都不同于一个多世纪以来全世界所看到的任何疫情。它导致许多发达国家反复停业，死亡人数和新感染不断增加。

2、covid-19引起呼吸道感染，严重时还会引起急性呼吸窘迫综合征。与其他冠状病毒如sars-cov相比，covid-19在疾病进程早期的症状发生前的/无症状的(pre/asymptomatic)空气传播和高病毒滴度显著增加了其传染性，这使得疫苗的开发对于大流行的管理至关重要。

3、vlp代表模拟病毒物理化学性质和结构而不引起病毒生长的有效疫苗候选物(cimica,v.,&galarza,j.m.,clin.immunol.183:99–108(2017))。因此，它们赋予强烈的体液应答，但通常对“全病毒”产生有限的细胞介导的应答，因为它们仍然是外源性抗原。此外，它们的生产、纯化和储存都很昂贵。

4、现有的疫苗在不同病毒株之间往往表现出有限的交叉保护，但由于病毒在进化压力下继续变异其基因组，这一事实使得更加复杂。

5、需要改进的vlp和治疗病毒感染的方法。

技术实现思路

0、发明概述

1、本公开涉及一种表达载体，其包含表达盒，所述表达盒包含编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包含与免疫原性氨基酸序列融合的来自病毒的保守氨基酸序列；包含位于所述表达盒每一侧翼的用于第一重组酶的靶序列；和整合在用于所述第一重组酶的靶序列的非结合区内的用于一个或多个额外重组酶的一个或多个额外靶序列，其中从所述表达盒细胞内表达的蛋白质能够形成病毒样颗粒(vlp)。

2、在一些方面，免疫原性氨基酸序列与保守氨基酸序列来自同一病毒。在一些方面，保守氨基酸序列来自病毒糖蛋白。在一些方面，免疫原性氨基酸序列来自相同的病毒糖蛋白。

3、在一些方面，表达盒还包含编码病毒包膜蛋白的核酸序列和/或编码病毒基质蛋白的核酸序列。在一些方面，病毒包膜蛋白和/或病毒基质蛋白来自与保守氨基酸序列相同的病毒。

4、在一些方面，保守氨基酸序列、免疫原性氨基酸序列、病毒包膜蛋白和/或病毒基质蛋白是共有序列。

5、在一些方面，重组蛋白能够刺激针对病毒的免疫应答，包括产生中和抗体。

6、在一些方面，重组蛋白能够刺激th1细胞介导的针对病毒的免疫应答。

7、在一些方面，免疫应答对相关病毒或毒株具有交叉反应。

8、在一些方面，重组蛋白排除了病毒中刺激包括产生非中和抗体的免疫应答和/或刺激th2细胞介导的免疫应答的氨基酸序列。

9、在一些方面，表达盒包含单个可读框，其包含每个编码蛋白质的核酸序列之间的编码自切割肽的核酸序列。

10、在一些方面，病毒是冠状病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、人类乳头瘤病毒、肝炎病毒或溶瘤病毒。

11、在一些方面，病毒是冠状病毒。在一些方面，冠状病毒是covid-19。

12、在一些方面，表达盒包含编码冠状病毒膜(m)蛋白、冠状病毒包膜(e)蛋白和重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包含来自冠状病毒刺突(s)蛋白的保守氨基酸序列和免疫原性氨基酸序列。在一些方面，保守氨基酸序列来自s蛋白s2'切割位点和内部融合肽(ifp)。

13、在一些方面，保守氨基酸序列包含seq id no:12。

14、在一些方面，免疫原性氨基酸序列来自s蛋白受体结合结构域(rbd)。

15、在一些方面，所述免疫原性氨基酸序列与seq id no:11至少约90％同一。

16、在一些方面，重组蛋白进一步包含来自s蛋白的跨膜(tm)结构域序列。

17、在一些方面，重组蛋白排除了s蛋白中刺激包含非中和抗体的免疫应答和/或刺激th2细胞介导的免疫应答的氨基酸序列。

18、在一些方面，重组蛋白的氨基酸序列与seq id no:55至少约90％同一。

19、在一些方面，表达盒包含翻译为与seq id no:57至少约90％同一的氨基酸序列的单个可读框。

20、在一些方面，重组蛋白能够刺激针对covid-19的免疫应答。

21、在一些方面，免疫应答对其他冠状病毒具有交叉反应。在一些方面，免疫应答对其他严重急性呼吸综合征冠状病毒和/或人类β冠状病毒具有交叉反应。

22、在一些方面，第一重组酶的靶序列和一个或多个额外重组酶的一个或多个额外靶序列选自py54 pal位点、n15 telrl位点、loxp位点、telrl位点、frt位点、phic31attp位点和λattp位点。在一些方面，表达载体包含每个所述靶序列。在一些方面，表达载体包含tel重组酶pal位点和整合在pal位点内的telrl、loxp和frt重组酶靶结合序列。

23、在一些方面，表达载体用于生产无细菌序列的载体。在一些方面，无细菌序列载体具有环状共价闭合末端。在一些方面，无细菌序列载体具有线性共价闭合末端。

24、在一些方面，表达载体还包含至少一个位于第一重组酶靶序列每一侧的增强子序列。在一些方面，所述至少一个增强子序列是至少两个增强子序列。在一些方面，所述至少一个增强子序列是sv40增强子序列。

25、本公开涉及一种载体生产系统，其包含重组细胞，所述重组细胞被设计为在可诱导启动子的控制下编码至少第一重组酶，其中所述细胞包含任一上述表达载体。在一些方面，诱导型启动子是热调节的、化学调节的、iptg调节的、葡萄糖调节的、阿拉伯糖诱导的、t7聚合酶调节的、冷休克诱导的、ph诱导的或其组合。在一些方面，所述第一重组酶选自teln和tel，并且所述表达载体并入有所述至少第一重组酶的靶序列。在一些方面，重组细胞已被进一步设计为编码核酸酶基因组编辑系统，并且其中表达载体还包含含有核酸酶基因组编码系统的切割位点的主链序列。在一些方面，核酸酶基因组编辑系统是包含cas核酸酶和grna的crispr核酸酶系统，并且表达载体包含主链序列内grna的靶序列。

26、本公开涉及一种产生无细菌序列载体的方法，包括在合适的条件下孵育任一上述载体生产系统，以表达第一重组酶。

27、本公开涉及一种产生无细菌序列载体的方法，包括在合适的条件下孵育任一上述载体生产系统，所述载体生产系统包含设计为编码核酸酶基因组编辑系统的重组细胞，以表达第一重组酶和核酸酶基因组编辑系统。

28、在一些方面，任一上述产生无细菌序列载体的方法还包括收获无细菌序列载体。

29、本公开涉及通过任一上述产生无细菌序列载体的方法产生的无细菌序列载体。

30、本公开涉及一种无细菌序列载体，其包含表达盒，所述表达盒包含编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包含与免疫原性氨基酸序列融合的来自病毒的保守氨基酸序列，其中从所述表达盒胞内表达的蛋白质能够形成vlp。

31、在一些方面，免疫原性氨基酸序列与保守氨基酸序列来自同一病毒。在一些方面，保守氨基酸序列来自病毒糖蛋白。在一些方面，免疫原性氨基酸序列来自相同的病毒糖蛋白。

32、在一些方面，表达盒还包含编码病毒包膜蛋白的核酸序列和/或编码病毒基质蛋白的核酸序列。在一些方面，病毒包膜蛋白和/或病毒基质蛋白来自与保守氨基酸序列相同的病毒。

33、在一些方面，保守氨基酸序列、免疫原性氨基酸序列、病毒包膜蛋白和/或病毒基质蛋白是共有序列。

34、在一些方面，重组蛋白能够刺激针对病毒的包含中和抗体的免疫应答。

35、在一些方面，重组蛋白能够刺激th1细胞介导的针对病毒的免疫应答。

36、在一些方面，免疫应答对相关病毒或毒株具有交叉反应。

37、在一些方面，重组蛋白排除了病毒中刺激包含非中和抗体的免疫应答和/或刺激th2细胞介导的免疫应答的氨基酸序列。

38、在一些方面，表达盒包含单个可读框，其包含编码蛋白质的每个核酸序列之间的自切割肽的编码核酸序列。

39、在一些方面，病毒是冠状病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、人类乳头瘤病毒、肝炎病毒或溶瘤病毒。

40、在一些方面，病毒是冠状病毒。在一些方面，冠状病毒是covid-19。

41、在一些方面，表达盒包含编码冠状病毒m蛋白、冠状病毒e蛋白和重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包含来自冠状病毒s蛋白的保守氨基酸序列和免疫原性氨基酸序列。

42、在一些方面，保守氨基酸序列来自s蛋白s2'切割位点和ifp。

43、在一些方面，所述保守氨基酸序列包含seq id no:12。

44、在一些方面，免疫原性氨基酸序列来自s蛋白rbd。

45、在一些方面，所述免疫原性氨基酸序列与seq id no:11至少约90％同一。

46、在一些方面，重组蛋白进一步包含来自s蛋白的tm结构域序列。

47、在一些方面，重组蛋白排除了s蛋白中刺激包含非中和抗体的免疫应答和/或刺激th2细胞介导的免疫应答的氨基酸序列。

48、在一些方面，重组蛋白的氨基酸序列是seq id no:55。

49、在一些方面，表达盒包含翻译为与seq id no:57至少约90％同一的氨基酸序列的单个可读框。

50、在一些方面，重组蛋白能够刺激针对covid-19的免疫应答。

51、在一些方面，重组蛋白能够刺激th1细胞介导的针对covid-19的免疫应答。

52、在一些方面，免疫应答对其他冠状病毒具有交叉反应。在一些方面，免疫应答对其他严重急性呼吸综合征冠状病毒和/或人类β冠状病毒具有交叉反应。

53、在一些方面，无细菌序列载体还包含位于表达盒每侧的至少一个增强子序列。在一些方面，所述至少一个增强子序列是至少两个增强子序列。在一些方面，所述至少一个增强子序列是sv40增强子。

54、在一些方面，无细菌序列载体包含环状共价闭合末端。

55、在一些方面，无细菌序列载体包含线性共价闭合末端。

56、本公开涉及编码与seq id no:57至少约90％同一的氨基酸序列的多核苷酸。

57、本公开涉及包含任一上述表达载体或任一上述无细菌序列载体的重组细胞。

58、在一些方面，本公开涉及一种生产vlp的方法，包括在合适的条件下培养所述重组细胞，以从表达载体或无细菌序列载体生产vlp。

59、在一些方面，生产vlp的方法还包括分离该vlp。在一些方面，分离是通过亲和纯化。在一些方面，vlp由任何上述表达载体或任何上述无细菌序列载体产生，其中病毒是冠状病毒。在一些方面，亲和纯化包含血管紧张素转换酶2(ace2)受体肽或抗s蛋白单克隆抗体。在一些方面，ace2受体肽包含与seq id no:70至少约90％同一的氨基酸序列。在一些方面，ace2受体肽在肽的c端或n端包含生物素受体肽(bap)标签。在一些方面，所述bap标签包含与seq id no:71至少约90％同一的氨基酸序列。在一些方面，ace2受体肽或抗s蛋白单克隆抗体是生物素化的并固定在链霉亲和素包被的珠上。在一些方面，亲和纯化包括微流体法和/或层析法。在一些方面，本公开涉及通过任何产生vlp的方法产生的vlp。

60、本公开涉及一种vlp，其包含融合至免疫原性氨基酸序列的来自病毒的保守氨基酸序列的重组蛋白。在一些方面，免疫原性氨基酸序列和保守氨基酸序列来自同一病毒。在一些方面，保守氨基酸序列来自病毒糖蛋白。在一些方面，免疫原性氨基酸序列来自相同的病毒糖蛋白。

61、在一些方面，vlp还包含病毒包膜蛋白和/或病毒基质蛋白。在一些方面，病毒包膜蛋白和/或病毒基质蛋白来自与保守氨基酸序列相同的病毒。

62、在一些方面，保守氨基酸序列、免疫原性氨基酸序列、病毒包膜蛋白和/或病毒基质蛋白是共有序列。

63、在一些方面，重组蛋白能够刺激针对病毒的包含中和抗体的免疫应答。

64、在一些方面，重组蛋白能够刺激针对病毒的th1细胞介导的免疫应答。

65、在一些方面，免疫应答对相关病毒或毒株具有交叉反应。

66、在一些方面，重组蛋白排除了病毒中刺激包含非中和抗体的免疫应答和/或刺激th2细胞介导的免疫应答的氨基酸序列。

67、在一些方面，病毒是冠状病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、人类乳头瘤病毒、肝炎病毒或溶瘤病毒。在一些方面，病毒是冠状病毒。

68、在一些方面，冠状病毒是covid-19。

69、在一些方面，vlp包含冠状病毒膜(m)蛋白、冠状病毒包膜(e)蛋白和重组蛋白，所述重组蛋白包含来自冠状病毒刺突(s)蛋白的保守氨基酸序列和免疫原性氨基酸序列。

70、在一些方面，保守氨基酸序列来自s蛋白s2'切割位点和内部融合肽(ifp)。

71、在一些方面，所述保守氨基酸序列包含seq id no:12。

72、在一些方面，免疫原性氨基酸序列来自s蛋白受体结合结构域(rbd)。

73、在一些方面，所述免疫原性氨基酸序列与seq id no:11至少约90％同一。

74、在一些方面，重组蛋白进一步包含来自s蛋白的跨膜(tm)结构域序列。

75、在一些方面，重组蛋白排除了s蛋白中刺激包含非中和抗体的免疫应答和/或刺激th2细胞介导的免疫应答的氨基酸序列。

76、在一些方面，重组蛋白的氨基酸序列与seq id no:55至少约90％同一。

77、本公开涉及一种vlp，其包含与seq id no:55至少约90％同一的重组蛋白、与seqid no:1至少约90％同一的m蛋白和与seq id no:3至少约90％同一的e蛋白。

78、在一些方面，重组蛋白能够刺激针对covid-19的免疫应答。

79、在一些方面，重组蛋白能够刺激th1细胞介导的针对covid-19的免疫应答。

80、在一些方面，免疫应答对其他冠状病毒具有交叉反应。

81、在一些方面，免疫应答对其他严重急性呼吸综合征冠状病毒和/或人类β冠状病毒具有交叉反应。

82、本公开涉及包含任何上述表达载体、任何上述无细菌序列载体或任何上述病毒样颗粒的组合物。在一些方面，该组合物还包含递送剂。在一些方面，递送剂是纳米粒子。在一些方面，递送剂包含靶向性配体。在一些方面，靶向性配体包含s蛋白肽。在一些方面，s蛋白肽包含与任一seq id no:76-99至少约90％同一的氨基酸序列。

83、本公开涉及治疗受试者病毒感染的方法，包括向受试者施用任何上述表达载体、任何上述无细菌序列载体、任何上述vlp或任何上述组合物，其中表达载体或无细菌序列载体的胞内表达产生vlp。

84、在一些方面，施用是通过肠胃外或非肠胃外施用。在一些方面，施用是通过口服、肺、鼻内、静脉内、表皮、经皮、皮下、肌内或腹膜内施用或吸入施用。

85、在一些方面，vlp刺激受试者的免疫应答，包括针对病毒感染的中和抗体。

86、在一些方面，vlp刺激受试者对病毒感染的th1细胞介导的免疫应答。

87、在一些方面，免疫应答对相关病毒或毒株具有交叉反应。

88、在一些方面，vlp不刺激受试者中包含非中和抗体的免疫应答和/或不刺激受试者的th2细胞介导的免疫应答。

89、在一些方面，vlp与感染病毒交叉竞争对病毒受体的结合。

90、在一些方面，vlp与相关病毒或毒株交叉竞争对病毒受体的结合。

91、在一些方面，病毒感染是冠状病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、人类乳头瘤病毒、肝炎病毒或溶瘤病毒感染。

92、在一些方面，病毒感染是冠状病毒。在一些方面，病毒感染是covid-19。

93、在一些方面，vlp刺激受试者的免疫应答，包括针对covid-19的中和抗体。

94、在一些方面，vlp刺激受试者针对covid-19的th1细胞介导的免疫应答。

95、在一些方面，免疫应答对其他冠状病毒具有交叉反应。

96、在一些方面，免疫应答对其他严重急性呼吸综合征冠状病毒和/或人类β冠状病毒具有交叉反应。

97、在一些方面，vlp不刺激受试者中包括非中和抗体的免疫应答和/或不刺激受试者的th2细胞介导的免疫应答。

98、在一些方面，施用是通过吸入施用。

99、在一些方面，vlp与covid-19交叉竞争结合ace2受体、神经毡蛋白-1(neuropilin-1)和/或其他受体。

100、在一些方面，vlp与其他冠状病毒交叉竞争结合ace2受体、神经毡蛋白-1和/或其他受体。

101、在一些方面，vlp与其他严重急性呼吸综合征冠状病毒和/或人类β冠状病毒交叉竞争结合ace2受体、神经毡蛋白-1和/或其他受体。