一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法与流程

发明领域本发明涉及一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法，通过多次聚合核苷酸混合物以达到高效的充分聚合，从而满足测序的需求。进一步的，本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒可以用于对多核苷酸进行分析或测序。

背景技术：

0、发明背景

1、高通量测序，其中以边合成边测序(sequencing by synthesis，sbs)为商业主流，主要利用dna聚合酶及带有可逆终止和荧光标记的核苷酸来进行dna序列的识别。它能一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，具有通量高、检测速度快、灵活多用、成本低等优点。

2、目前，边合成边测序的具体流程为利用扩增或滚环复制等方式生成大量的dna模板，然后锚定特定的测序引物，并向反应体系中同时添加dna聚合酶和荧光标记的核苷酸；或者向反应体系中同时添加dna聚合酶和荧光标记的核苷酸及没有荧光修饰的核苷酸混合液。这些dntps的3’-oh被保护，因而每次只能添加一个dntp。每次添加一个dntp，dna链的复制反应就会停止，接着激发荧光信号并进行信号的收集，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dntp 3’-oh保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。

3、然而，这种测序技术对合成效率要求特别高。在多个拷贝中，一旦出现合成不完全，就会造成信号错乱，从而影响测序的准确性和测序读长。这也是目前二代测序面临的关键技术问题之一。随着人们对测序时间要求更快，通量更大，而聚合酶的反应效率有限，尤其是聚合带荧光基团的核苷酸的能力有限，就会导致聚合的效率影响测序的质量。尽管现有技术也提到采用在反应体系中同时聚合荧光标记和没有荧光修饰的核苷酸混合液来提高聚合效率，但效果仍有限。而这些聚合效率一旦跟不上测序速度，在多拷贝中出现了聚合不完全的现象，就会导致测序中信号错乱，从而限制了测序的读长和准确性。

4、因此，需要提供一种对多核苷酸进行测序的方法，以便提高测序的读长和准确性。

技术实现思路

1、本技术通过增加聚合反应的次数，以及调整参与聚合反应的核苷酸组分，使得聚合速率能够满足测序的需求，提升测序的读长和质量，从而完成了本技术。

2、因此，在第一方面，本技术提供了一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法，其包括

3、(a)提供靶多核苷酸，

4、(b)在允许杂交或退火的条件下，使所述靶多核苷酸与引物接触，从而形成包含靶多核苷酸与用作生长链的引物的部分双链体，

5、(c)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使所述部分双链体与聚合酶和第一核苷酸混合物接触，以使得所述生长链被延伸，其中，所述第一核苷酸混合物包含至少一种经标记物标记的核苷酸；

6、任选地，所述第一核苷酸混合物还包含至少一种未经标记核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，或其任何组合；

7、其中所述第一核苷酸混合物中的各个核苷酸各自在其核糖或脱氧核糖部分包含能够可逆阻断核酸链延伸的保护基团(例如通过2’或3’氧原子附接的保护基团)；

8、(d)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使前一步骤的产物与聚合酶和第二核苷酸混合物接触，以使得所述生长链被延伸，其中，所述第二核苷酸混合物包含至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)(1)未经标记的核苷酸、或(2)不可逆阻断核苷酸，或(3)所述未经标记的核苷酸和不可逆阻断核苷酸的组合；

9、在某些实施方案中，所述第二核苷酸混合物包含至少一种未经标记的核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，或其任何组合。

10、其中所述第二核苷酸混合物中的各个未经标记的核苷酸各自在其核糖或脱氧核糖部分包含能够可逆阻断核酸链延伸的保护基团(例如通过2’或3’氧原子附接的保护基团)；

11、(e)若所述第二核苷酸混合物中的至少一种核苷酸包含不可逆阻断核苷酸，则不进行此步骤；

12、若所述第二核苷酸混合物不包含不可逆阻断核苷酸，则在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使前一步骤的产物与聚合酶和第三核苷酸混合物接触，以使得所述生长链被延伸；所述第三核苷酸混合物包含至少一种不可逆阻断核苷酸；

13、(f)检测前一步骤的产物中标记物的存在，

14、(g)去除前一步骤的产物中含有的保护基团和标记物，

15、(h)任选地重复步骤(c)-(g)一次或多次，

16、从而，获得所述靶多核苷酸的序列信息。

17、用于测定靶多核苷酸序列的方法可以这样进行：使靶多核苷酸序列变性，使靶多核苷酸分别与不同的核苷酸接触，以便形成所述靶核苷酸的互补体，并且检测所述核苷酸的掺入。所述方法利用了聚合，使得聚合酶通过掺入互补于所述靶的正确的核苷酸，以延伸所述生长链。

18、对每一轮聚合反应来说，所述核苷酸的掺入是通过聚合酶进行的。存在很多不同的聚合酶，并且对本领域普通技术人员来说容易确定最适合的聚合酶。优选的酶包括dna聚合酶i、klenow片段、dna聚合酶iii、t4或t7 dna聚合酶、taq聚合酶或vent聚合酶。还可以使用通过工程方法改造成具有特定性质的聚合酶。

19、进行聚合的条件对本领域技术人员来说是熟知的。为了进行所述聚合酶反应，通常首先使引物与所述靶多核苷酸退火，所述引物是由所述聚合酶识别的，并且起着所述生长链随后延伸的起始位点的作用。所述引物可以相对所述靶多核苷酸作为独立的成分添加。进行所述聚合酶反应所必需的其他条件，对本领域技术人员来说是熟知的，这些条件包括温度、ph、缓冲液组成。

20、在某些实施方案中，使本发明的第一核苷酸混合物与所述引物和聚合酶接触，以便能够进行第一轮的聚合。所述核苷酸可以依次添加，即分别添加每一种类型的核苷酸(a，c，g或t/u)，或同时添加。根据测序速率的需要，使本发明的第二核苷酸混合物与所述聚合酶再次进行接触，进行第二轮的聚合。所述核苷酸可以依次添加，即分别添加每一种类型的核苷酸(a，c，g或t/u)，或同时添加。最后，根据第二核苷酸混合物包含或不包含双脱氧核苷酸，选择不进行或进行第三轮聚合。在某些实施方案中，所述第二核苷酸混合物不包含双脱氧核苷酸，则使本发明的第三核苷酸混合物与所述聚合酶接触，以便能够进行第三轮的聚合。所述核苷酸可以依次添加，即分别添加每一种类型的核苷酸(a，c，g或t/u)，或同时添加。

21、在某些实施方案中，除去未掺入的核苷酸。例如，通过进行洗涤步骤除去未掺入的核苷酸。

22、在某些实施方案中，对标记物进行检测。检测可以通过常规方法进行，检测荧光标记或信号的方式是本领域熟知的。例如，可以通过检测荧光的波长的装置来实现。这样的装置是本领域熟知的。例如，这样的装置可以是共焦扫描显微镜，其用激光扫描固体支持物的表面，以便使直接结合被测序的核酸分子上的荧光团成像。另外，可以例如用灵敏的2-d探测器，如电荷偶连的探测器(ccd)观察所产生的每一种信号。还可以例如使用诸如扫描近场光学显微方法(snom)的其他技术。

23、在某些实施方案中，在检测之后，可以用合适的条件除去所述标记物。

24、本发明的经标记的核苷酸的使用并不局限于dna测序技术，还可用本发明的核苷酸实施包括多核苷酸合成，dna杂交分析，和单核苷酸多态性研究的其他形式。涉及到核苷酸和酶之间的相互作用的任何技术，都可以利用本发明的分子。例如，可以将所述分子用作逆转录酶或末端转移酶的底物。

25、在某些实施方案中，在步骤(c)中，所述延伸是以靶多核苷酸为模板延伸。在某些实施方案中，所述延伸为延伸一个核苷酸。

26、在某些实施方案中，所述第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸和经第四标记物标记的第四核苷酸或未经标记的第四核苷酸，或者，经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸。任选地，所述第一核苷酸混合物还包含至少一种未经标记的核苷酸。

27、在某些实施方案中，所述第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸、经第四标记物标记的第四核苷酸、未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸，或者，经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸、未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸和未经标记的第三核苷酸。

28、在某些实施方案中，所述经第一标记物标记的第一核苷酸与未经标记的第一核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第一标记物标记的第一核苷酸与未经标记的第一核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第一标记物标记的第一核苷酸与未经标记的第一核苷酸的比率为3∶2。

29、在某些实施方案中，所述经第二标记物标记的第二核苷酸与未经标记的第二核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第二标记物标记的第二核苷酸与未经标记的第二核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第二标记物标记的第二核苷酸与未经标记的第二核苷酸的比率为3∶2。

30、在某些实施方案中，所述经第三标记物标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第三标记物标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第三标记物标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为3∶2。

31、在某些实施方案中，所述经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为3∶2。

32、在某些实施方案中，所述经第四标记物标记的第四核苷酸与未经标记的第四核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第四标记物标记的第四核苷酸与未经标记的第四核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第四标记物标记的第四核苷酸与未经标记的第四核苷酸的比率为3∶2。

33、在某些实施方案中，在步骤(d)中，所述第二核苷酸混合物包含：

34、(1)未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸；或者，

35、(2)第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸、第四不可逆阻断核苷酸；或者，

36、(3)包含未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，以及第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸、第四不可逆阻断核苷酸。

37、在某些实施方案中，所述未经标记的第一核苷酸与第一不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1至1∶100或者仅为不可逆阻断核苷酸。在某些实施方案中，所述未经标记的第一核苷酸与第一不可逆阻断核苷酸的比率为1∶100、50∶1或100∶1。在某些实施方案中，所述未经标记的第一核苷酸与第一不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1。

38、在某些实施方案中，所述未经标记的第二核苷酸与第二不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1至1∶100或者仅为不可逆阻断核苷酸。在某些实施方案中，所述未经标记的第二核苷酸与第二不可逆阻断核苷酸的比率为1∶100、50∶1或100∶1。在某些实施方案中，所述未经标记的第二核苷酸与第二不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1。

39、在某些实施方案中，所述未经标记的第三核苷酸与第三不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1至1∶100或者仅为不可逆阻断核苷酸。在某些实施方案中，所述未经标记的第三核苷酸与第三不可逆阻断核苷酸的比率为1∶100、50∶1或100∶1。在某些实施方案中，所述未经标记的第三核苷酸与第三不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1。

40、在某些实施方案中，所述未经标记的第四核苷酸与第四不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1至1∶100或者仅为不可逆阻断核苷酸。在某些实施方案中，所述未经标记的第四核苷酸与第四不可逆阻断核苷酸的比率为1∶100、50∶1或100∶1。在某些实施方案中，所述未经标记的第四核苷酸与第四不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1。

41、在某些实施方案中，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物各自独立地相同或不同。

42、在某些实施方案中，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物不同。

43、在某些实施方案中，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物为发光标记物(例如，荧光标记物)。

44、在某些实施方案中，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物各自独立地选自香豆素、alexafluor、bodipy、荧光素、四甲基罗丹明、吩噁嗪、吖啶、cy5、cy3、af532、得克萨斯红及其衍生物。

45、在某些实施方案中，所述靶多核苷酸包含或是dna，rna，或其任何组合。在某些实施方案中，所述核酸分子的延伸产物为dna。

46、在某些实施方案中，所述靶多核苷酸获自来源于真核生物(例如，动物，植物，真菌)，原核生物(例如，细菌，放线菌)，病毒，噬菌体，或其任何组合的样品。

47、在某些实施方案中，所述第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸各自独立地选自a，t，c，g，u。

48、在某些实施方案中，所述第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸各不相同。

49、在某些实施方案中，所述第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸分别是a，t，c，g。在某些实施方案中，所述第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸和第四不可逆阻断核苷酸各自独立地选自a，t，c，g，u。

50、在某些实施方案中，所述第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸和第四不可逆阻断核苷酸各不相同。

51、在某些实施方案中，所述第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸和第四不可逆阻断核苷酸分别是a，t，c，g。

52、在某些实施方案中，所述不可逆阻断核苷酸为双脱氧核苷酸。

53、在某些实施方案中，当第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸和经第四标记物标记的第四核苷酸时；第二核苷酸混合物包含未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸。

54、在某些实施方案中，当第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸，或者，经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸时，第二核苷酸混合物包含未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸和未经标记的第三核苷酸。

55、在第二方面，本技术提供了一种试剂盒，其包含：

56、(a)第一核苷酸混合物，所述第一核苷酸混合物包含至少一种经标记物标记的核苷酸；

57、任选地，所述第一核苷酸混合物还包含至少一种未经标记的核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，或其任何组合；

58、其中所述第一核苷酸混合物中的各个核苷酸各自在其核糖或脱氧核糖部分包含能够可逆阻断核酸链延伸的保护基团(例如通过2’或3’氧原子附接的保护基团)；

59、(b)第二核苷酸混合物，所述第二核苷酸混合物包含：至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)(1)未经标记的核苷酸、或(2)不可逆阻断核苷酸，或(3)所述未经标记的核苷酸和不可逆阻断核苷酸的组合；

60、在某些实施方案中，所述第二核苷酸混合物包含至少一种未经标记的核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，或其任何组合。

61、其中所述第二核苷酸混合物中的各个未经标记的核苷酸各自在其核糖或脱氧核糖部分包含能够可逆阻断核酸链延伸的保护基团(例如通过2’或3’氧原子附接的保护基团)；

62、(c)若所述第二核苷酸混合物不包含不可逆阻断核苷酸，则所述试剂盒包含第三核苷酸混合物，所述第三核苷酸混合物包含至少一种不可逆阻断核苷酸；

63、若所述第二核苷酸混合物中的至少一种核苷酸包含不可逆阻断核苷酸，则所述试剂盒不包含第三核苷酸混合物。

64、在某些实施方案中，所述第二核苷酸混合物包含至少一种未经标记的核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，或其任何组合。

65、在某些实施方案中，所述不可逆阻断核苷酸为双脱氧核苷酸。

66、在某些实施方案中，所述第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸和经第四标记物标记的第四核苷酸或未经标记的第四核苷酸，或者，经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸。任选地，所述第一核苷酸混合物还包含至少一种未经标记的核苷酸。

67、在某些实施方案中，所述第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸、经第四标记物标记的第四核苷酸、未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸，或者，经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸、未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸和未经标记的第三核苷酸。

68、在某些实施方案中，所述经第一标记物标记的第一核苷酸与未经标记的第一核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第一标记物标记的第一核苷酸与未经标记的第一核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第一标记物标记的第一核苷酸与未经标记的第一核苷酸的比率为3∶2。

69、在某些实施方案中，所述经第二标记物标记的第二核苷酸与未经标记的第二核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第二标记物标记的第二核苷酸与未经标记的第二核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第二标记物标记的第二核苷酸与未经标记的第二核苷酸的比率为3∶2。

70、在某些实施方案中，所述经第三标记物标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第三标记物标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第三标记物标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为3∶2。

71、在某些实施方案中，所述经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为3∶2。

72、在某些实施方案中，所述经第四标记物标记的第四核苷酸与未经标记的第四核苷酸的比率为20∶1至1∶10(例如，10∶1至1∶10，5∶1至1∶5，3∶1至1∶3)。在某些实施方案中，所述经第四标记物标记的第四核苷酸与未经标记的第四核苷酸的比率为20∶1、1∶10、1∶1或3∶2。在某些实施方案中，所述经第四标记物标记的第四核苷酸与未经标记的第四核苷酸的比率为3∶2。

73、在某些实施方案中，当第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸和经第四标记物标记的第四核苷酸时；第二核苷酸混合物包含未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸。

74、在某些实施方案中，当第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸，或者，经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸时，第二核苷酸混合物包含未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸和未经标记的第三核苷酸。

75、在某些实施方案中，所述第二核苷酸混合物包含：

76、(1)未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸；或者，

77、(2)第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸、第四不可逆阻断核苷酸；或者，

78、(3)未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，以及第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸、第四不可逆阻断核苷酸。

79、在某些实施方案中，所述未经标记的第一核苷酸与第一不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1至1∶100或者仅为不可逆阻断核苷酸。在某些实施方案中，所述未经标记的第一核苷酸与第一不可逆阻断核苷酸的比率为1∶100、50∶1或100∶1。在某些实施方案中，所述未经标记的第一核苷酸与第一不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1。

80、在某些实施方案中，所述未经标记的第二核苷酸与第二不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1至1∶100或者仅为不可逆阻断核苷酸。在某些实施方案中，所述未经标记的第二核苷酸与第二不可逆阻断核苷酸的比率为1∶100、50∶1或100∶1。在某些实施方案中，所述未经标记的第二核苷酸与第二不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1。

81、在某些实施方案中，所述未经标记的第三核苷酸与第三不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1至1∶100或者仅为不可逆阻断核苷酸。在某些实施方案中，所述未经标记的第三核苷酸与第三不可逆阻断核苷酸的比率为1∶100、50∶1或100∶1。在某些实施方案中，所述未经标记的第三核苷酸与第三不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1。

82、在某些实施方案中，所述未经标记的第四核苷酸与第四不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1至1∶100或者仅为不可逆阻断核苷酸。在某些实施方案中，所述未经标记的第四核苷酸与第四不可逆阻断核苷酸的比率为1∶100、50∶1或100∶1。在某些实施方案中，所述未经标记的第四核苷酸与第四不可逆阻断核苷酸的比率为100∶1。

83、在某些实施方案中，所述不可逆阻断核苷酸为双脱氧核苷酸。

84、在某些实施方案中，所述试剂盒还包含选自以下的一种或多种：核酸聚合酶，用于进行扩增的试剂，用于进行测序的试剂，或其任何组合。

85、在某些实施方案中，所述用于进行扩增的试剂包括选自以下的一种或多种：与所述多核苷酸全部或部分互补的引物、dnb制备缓冲液、酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、水、包含离子(例如mg2+)的溶液、单链dna结合蛋白、或其任何组合。

86、在某些实施方案中，所述用于测序的试剂包括选自以下的一种或多种：测序载片、去除核苷酸上的保护基团和标记物的试剂、检测所述标记物的发光信号的试剂(例如，荧光混合液)。

87、在某些实施方案中，所述核酸聚合酶为dna聚合酶，例如热稳定的dna聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的dna聚合酶获自，thermus aquaticus(taq)，thermusthermophiles(tth)，thermus filiformis，thermis flavus，thermococcus literalis，thermus antranildanii，thermus caldophllus，thermus chliarophilus，thermusflavus，thermus igniterrae，thermus lacteus，thermus oshimai，thermus ruber，thermus rubens，thermus scotoductus，thermus silvanus，thermus thermophllus，thermotoga maritima，thermotoga neapolitana，thermosipho africanus，thermococcuslitoralis，thermococcus barossi，thermococcus gorgonarius，thermotoga maritima，thermotoga neapolitana，thermosiphoafricanus，pyrococcus woesei，pyrococcushorikoshii，pyrococcus abyssi，pyrodictium occultum，aquifexpyrophilus和aquifexaeolieus。

88、在某些实施方案中，所述试剂盒用于对多核苷酸进行分析。

89、在某些实施方案中，所述试剂盒用于对多核苷酸进行测序。

90、在某些实施方案中，所述标记物的存在通过发光信号来检测。

91、在某些实施方案中，所述标记物的存在通过1种或多种(例如，2种，3种，4种)发光信号来检测。

92、在某些实施方案中，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物各自独立地相同或不同。

93、在某些实施方案中，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物不同。

94、在某些实施方案中，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物为发光标记物(例如，荧光标记物)。

95、在某些实施方案中，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物各自独立地选自香豆素、alexafluor、bodipy、荧光素、四甲基罗丹明、吩噁嗪、吖啶、cy5、cy3、af532、ef700，得克萨斯红及其衍生物。

96、在某些实施方案中，所述靶多核苷酸包含或是dna，rna，或其任何组合。在某些实施方案中，所述核酸分子的延伸产物为dna。

97、在某些实施方案中，所述靶多核苷酸获自来源于真核生物(例如，动物，植物，真菌)，原核生物(例如，细菌，放线菌)，病毒，噬菌体，或其任何组合的样品。

98、在某些实施方案中，所述第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸各自独立地选自a，t，c，g，u。

99、在某些实施方案中，所述第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸各不相同。

100、在某些实施方案中，所述第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸分别是a，t，c，g。在某些实施方案中，所述第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸和第四不可逆阻断核苷酸各自独立地选自a，t，c，g，u。

101、在某些实施方案中，所述第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸和第四不可逆阻断核苷酸各不相同。

102、在某些实施方案中，所述第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸和第四不可逆阻断核苷酸分别是a，t，c，g。

103、在某些实施方案中，所述不可逆阻断核苷酸为双脱氧核苷酸。

104、术语定义

105、除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文提及的所有专利、申请和其他出版物均通过引用整体并入本文。如果本文中提出的定义与通过引用并入本文的专利、申请和其他出版物中所述的定义相抵触或不一致，则以本文所述的定义为准。

106、如本文所用，术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或其类似物。多核苷酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列两者。多核苷酸分子可以来源于双链dna(dsdna)形式(例如，基因组dna、pcr和扩增产物等)，或者可以来源于单链形式的dna(ssdna)或rna并且其可以转化为dsdna形式，并且反之亦然。多核苷酸分子的准确序列可以是已知的或未知的。以下是多核苷酸的示例性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、est或sage标签)、基因组dna、基因组dna片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核糖酶、cdna、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、任何上述序列的核酸探针、引物或扩增拷贝。

107、多核苷酸可以包括核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸通常含有糖(如核糖或脱氧核糖)、碱基和至少一个磷酸基。核苷酸可以是无碱基的(即，缺少碱基)。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰磷酸盐糖主链核苷酸及其混合物。核苷酸的实例包括(例如)腺苷一磷酸(amp)、腺苷二磷酸(adp)、腺苷三磷酸(atp)、胸苷一磷酸(tmp)、胸苷二磷酸(tdp)、胸苷三磷酸(ttp)、胞苷酸(cmp)、胞苷二磷酸(cdp)、胞苷三磷酸(ctp)、鸟苷一磷酸(gmp)、鸟苷二磷酸(gdp)、鸟苷三磷酸(gtp)、尿苷一磷酸(ump)、尿苷二磷酸(udp)、尿苷三磷酸(utp)、脱氧腺苷酸(damp)、脱氧腺苷二磷酸(dadp)、脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胸腺嘧啶核苷一磷酸(dtmp)、脱氧胸腺嘧啶核苷二磷酸(dtdp)、脱氧胸苷三磷酸(dttp)、去氧胞二磷(dcdp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷一磷酸(dgmp)、脱氧鸟苷二磷酸(dgdp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧尿苷一磷酸(dump)、脱氧尿苷二磷酸(dudp)和脱氧尿苷三磷酸(dutp)。还可以在本文所述的方法中使用包含修饰的碱基的核苷酸类似物。无论是具有天然主链还是类似结构，可以包含在多核苷酸中的示例性修饰的碱基包括(例如)肌苷、黄嘌呤(xathanine)、次黄嘌呤(hypoxathanine)、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-卤代脲嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤素取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤、3-去氮腺嘌呤等。如本领域中已知的，某些核苷酸类似物不能引入多核苷酸，例如，核苷酸类似物，如腺苷5’-磷酰硫酸。

108、通常而言，核苷酸包括核苷酸a、c、g、t或u。如本文所用，术语“核苷酸a”是指含有腺嘌呤(a)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如atp、datp。“核苷酸g”是指含有鸟嘌呤(g)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如gtp、dgtp。“核苷酸c”是指含有胞嘧啶(c)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如ctp、dctp。“核苷酸t”是指含有胸腺嘧啶(t)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如ttp、dttp。“核苷酸u”是指含有尿嘧啶(u)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如utp、dutp。如本文所用，术语“双脱氧核苷酸”是指在核糖的2′和3′位碳上脱氧的核苷酸，又被称为2′，3′-双脱氧核苷酸。通常而言，双脱氧核苷酸包括双脱氧核苷酸a、c、g、t或u。术语“双脱氧核苷酸a”是指含有腺嘌呤(a)或类似物的双脱氧核苷酸，例如ddatp。“双脱氧核苷酸g”是指含有鸟嘌呤(g)或类似物的双脱氧核苷酸，例如ddgtp。“双脱氧核苷酸c”是指含有胞嘧啶(c)或类似物的双脱氧核苷酸，例如ddctp。“双脱氧核苷酸t”是指含有胸腺嘧啶(t)或类似物的双脱氧核苷酸，例如ddtp。“双脱氧核苷酸u”是指含有尿嘧啶(u)或类似物的双脱氧核苷酸，例如ddutp。如本文所用，ddntp为双脱氧腺苷三磷酸(dideoxyadenosinetriphosphate，ddatp)、双脱氧鸟苷三磷酸(dideoxyguanosine triphosphate，ddgtp)、双脱氧胞苷三磷酸(dideoxycytidine triphosphate，ddctp)、双脱氧尿苷三磷酸(dideoxyuridine triphosphate ddutp)、双脱氧胸苷三磷酸(dideoxythymidinetriphosphate，ddttp)之一或者它们两种或者两种以上的组合，双脱氧尿苷三磷酸和双脱氧胸苷三磷酸不同时出现。

109、如本文所用，术语“标记物”是指在一定条件下，能够发出发光信号的基团。

110、如本文所用，术语“发光标记物”是指在被合适的激发波长激发时，能够以特定的发射波长发射荧光的任何物质。这样的发光标记物可以是化学发光标记物，例如，选自引发不同发光动力学的生物化学发光标记物及其任意组合，例如，所述化学发光标记物选自引发不同发光动力学的荧光素酶及其任意组合；这样的发光标记物可以是例如荧光团，例如选自香豆素、alexafluor、bodipy、荧光素、四甲基罗丹明、吩噁嗪、吖啶、cy5、cy3、af532、得克萨斯红及其衍生物。

111、如本文所用，术语“保护基团”意指这样的基团，其阻止聚合酶(其将含有该基团的核苷酸掺入到正在合成的多核苷酸链上的)在将含有该基团的核苷酸掺入到正在合成的多核苷酸链上后继续催化另一核苷酸的掺入。这样的保护基团在本文中也被称为3’-oh保护基团。包含这样的保护基团的核苷酸在本文中也被称为3’阻断的核苷酸。保护基团可以是能够被添加到核苷酸上任何合适的基团，只要该保护基团能防止另外的核苷酸分子被加入至多核苷酸链中且同时在不破坏该多核苷酸链的情况下易于从核苷酸的糖部分除去。此外，经保护基团修饰的核苷酸需要耐受聚合酶或用于将该修饰的核苷酸掺入多核苷酸链内的其他适合的酶。因此，理想的保护基团表现出长期的稳定性，可被聚合酶高效地掺入，阻止核苷酸的二次掺入或进一步掺入，并且能够在不破坏多核苷酸结构的温和条件下优选地在水性条件下被除去。

112、现有技术已描述了多种符合上述描述的保护基团。例如，wo 91/06678公开3′-oh保护基团包括酯和醚，-f，-nh2，-och3，-n3，-opo3，-nhcoch3，2硝基苯碳酸酯，2,4-次磺酰二硝基和四氢呋喃醚。metzker等人(nucleic acids research，22(20)：4259-4267，1994)公开了八种3’-修饰的2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸酯(3’-修饰的dntp)的合成和应用。wo2002/029003描述了在聚合酶反应中使用烯丙基保护基团对dna生长链上的3’-oh基团加帽。优选地，可以使用国际申请公开wo2014139596和wo2004/018497中报导的各种保护基团，包括例如wo2014139596的图1a中示例的那些保护基团和权利要求书中限定的那些3’羟基保护基(即保护基团)，和例如wo2004/018497的图3和4中示例的那些保护基团和权利要求书中限定的那些保护基团。上述参考文献均通过引用整体并入本文。

113、如本文所用，术语“可逆阻断基团”是指这样的基团，将其掺入到正在合成的多核苷酸链上后，聚合酶将无法继续进行下一轮的聚合反应，从而聚合反应将被终止。在这种情况下，在每一轮的聚合反应中，将有且只有一个碱基被掺入生长的核酸链。此外，该基团能够被去除，随后，可对生长的核酸链进行下一轮的聚合反应，并再次引入一个碱基。可逆阻断基团的示例为3′-oh中的h被以下基团所替换：酯，醚，-f，-nh2，-och3，-n3，-opo3，-nhcoch3，2-硝基苯碳酸酯，2，4-次磺酰二硝基和四氢呋喃醚-ch2-ch＝ch2，s-s，或者碱基上用大空间位阻基团及荧光基团一起进行阻断并通过s-s连接荧光。

114、如本文所用，术语“不可逆阻断核苷酸”是指这样的核苷酸，将其掺入到正在合成的多核苷酸链上后，后续核苷酸由于其的阻断作用无法继续掺入多核苷酸链。并且这种阻断作用是不可逆的。不可逆阻断核苷酸通常包含双脱氧核苷酸，或者3’-oh被以下基团所替换的核苷酸：3’端带有甲氧基(3’-ome，即3’-och3)、3’端带有叠氮(3’-n3)和3’端带有乙氧基(3’-oet，即3’-och2ch3)等的核苷酸。

115、发明的有益效果

116、在测序中，本发明通过增加聚合反应的次数，实现更高效的聚合反应，以使得这种聚合速率能够满足测序的需求，提升测序的读长和质量。进一步的，本发明通过缩短第一轮聚合反应，且快速进行第二轮或第二轮、第三轮的聚合，同时调整参与聚合反应的核苷酸组分(例如，聚合不带有荧光标记的核苷酸组分)，以达到更高效的聚合反应。

117、本发明的方法，不仅能够增加聚合反应的效率，确保聚合反应充分，以提升测序的读长和质量。还降低了因荧光切除不干净，或者切除的荧光洗脱不干净导致的信号干扰，提高了切除效率，降低了测序错误率。