具有类似于肉毒杆菌毒素活性的肽及其用途的制作方法

1.本发明涉及具有trolox与肽化学缀合的结构的trolox-肽缀合物及其用途。


背景技术：

2.为了调节肌肉松弛和收缩，在肌肉的上层中存在神经肌肉接点，并且在神经末梢处载有突触囊泡。肌肉通过接收来自神经递质在一种神经囊泡内传递的信息从而收缩。当要释放神经递质时，需要存在被称为可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(snap受体；snare)的受体复合物，该受体复合物能够使神经递质与肌肉对接。如果snare受体复合物略微不稳定，则载体不能主动释放神经递质，因而导致神经肌肉突触产生的冲动不能传递至肌肉，冲动中断，使得肌肉松弛。换句话说，出现了较少的肌肉收缩，这意味着减少了皱纹的形成。
3.同时，面部表情皱纹的形成原因或机制是由于向内牵拉皮肤的表皮肌肉的张力。这种肌肉张力是面部肌肉衰弱和神经亢进的结果。神经亢进是刺激肌肉纤维的神经递质过度释放不受控制的特征。为此，控制神经递质释放的分子使肌肉张力松弛，以有助于去除面部皱纹。
4.基于这种机制，已经研究和上市了许多用于抑制皱纹形成的材料。
5.肉毒杆菌神经毒素(bont)是使snare蛋白(它是神经递质释放所涉及的关键蛋白)裂解的蛋白酶，并且bont最常用于去除面部皱纹的临床试验和美容。bont使snare蛋白裂解，以抑制神经递质的释放并阻断神经传递，最终导致bont渗透的肌细胞麻痹。
6.然而，由于bont的麻痹效果是可逆的，平均为6个月，因此需要反复注射bont，并且由于具有可被患者的免疫系统识别的尺寸，因而会引起对药品的免疫应答。bont的抗体的形成会导致治疗功效显著损失，这是一个严重的问题。
7.因此，需要开发这样的新的活性成分，其具有通过调节神经递质的释放治疗肌肉痉挛和减少或去除面部不对称和/或面部皱纹(特别是面部表情皱纹)的效果，同时具有更简单且更稳定的分子结构而不引起免疫应答。


技术实现要素：

8.[技术问题]
[0009]
本发明的目的是提供一种trolox-肽缀合物，其中一种新的肽和trolox缀合以抑制神经递质的释放。
[0010]
本发明的另一目的是提供一种用于缓解肌肉收缩或松驰肌肉的组合物。
[0011]
本发明的另一目的是提供一种用于肌肉松弛的方法。
[0012]
本发明的又一目的是提供一种trolox-肽缀合物，其用于肌肉松弛。
[0013]
本发明的又一目的是提供一种用于预防或治疗神经肌肉障碍的药物组合物。
[0014]
本发明的又一目的是提供一种用于预防或治疗神经肌肉障碍的方法。
[0015]
本发明的又一目的是提供一种trolox-肽缀合物，其用于预防或治疗神经肌肉障
碍。
[0016]
本发明的又一目的是提供一种用于改善皮肤状况(包括皱纹改善)的组合物。
[0017]
本发明的又一目的是提供一种用于改善皮肤状况的方法。
[0018]
本发明的又一目的是提供一种trolox-肽缀合物，其用于改善皮肤状况。
[0019]
[技术方案]
[0020]
本发明的一个方面提供了一种trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽和trolox缀合。
[0021]
本发明的另一方面提供了一种用于肌肉松弛的组合物，其包含trolox-肽缀合物作为活性成分。
[0022]
此外，本发明提供了一种用于肌肉松弛的方法，包括向受试者施用trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽和trolox缀合。
[0023]
此外，本发明提供了一种用于肌肉松弛的trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合。
[0024]
本发明的又一方面提供了一种用于预防或治疗神经肌肉障碍的药物组合物，其包含trolox-肽缀合物作为活性成分。
[0025]
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗神经肌肉障碍的方法，包括向受试者施用trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合。
[0026]
此外，本发明提供了一种trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合，所述trolox-肽缀合物用于预防或治疗神经肌肉障碍。
[0027]
本发明的又一方面提供了一种用于改善皮肤状况的组合物，其包含trolox-肽缀合物作为活性成分。
[0028]
此外，本发明提供了一种用于改善皮肤状况的方法，包括向受试者施用trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合。
[0029]
此外，本发明提供了一种trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合，所述trolox-肽缀合物用于改善皮肤状况。
[0030]
[有利效果]
[0031]
根据本发明，trolox-肽缀合物通过抑制神经递质的释放，可用作snare和神经递质参与的胞内应答的调节剂。因此，本发明的trolox-肽缀合物可用作用于肌肉松弛的组合物、用于预防或治疗神经肌肉障碍的组合物或用于改善皮肤状况(包括皱纹改善)的组合物。
[0032]
然而，本发明的效果不限于上述效果，并且本领域技术人员将根据以下描述清楚地理解未提及的其他效果。
附图说明
[0033]
图1示出了通过在神经细胞中用本发明的trolox-肽缀合物处理来抑制神经递质释放的效果：烟碱和氯化钾(kcl)为促进神经递质释放的诱导因子；破伤风毒素(tetanus)为阳性对照组。
[0034]
图2为确认通过用本发明的trolox-肽缀合物处理实验动物产生的肌肉松弛效果的照片；bont作为肉毒杆菌神经毒素，为阳性对照组。
[0035]
图3为确认通过用本发明的trolox-肽缀合物处理实验动物产生的肌肉松弛效果的持续时间的图：上方的图示出了当用trolox-肽缀合物处理时的das结果，并且下方的图示出了当用肉毒杆菌神经毒素处理时的das结果。
[0036]
图4示出了本发明的trolox-肽缀合物增加成纤维细胞中构成真皮的col1a1、纤连蛋白和弹性蛋白的表达的效果。
具体实施方式
[0037]
以下，将详细描述本发明。
[0038]
本发明的一个方面提供了一种包括seq id no:1的氨基酸序列的肽和一种活性物质-肽缀合物，其中活性物质与肽缀合。
[0039]
可以使用(例如)装置或基因工程技术进行本发明的肽的合成。在使用装置进行合成的情况下，可以在自动肽合成仪中使用fmoc固相法合成所需的肽。
[0040]
在具体的示例性实施方案中，使用fmoc固相法合成和鉴定本发明的包括seq id no:1的氨基酸序列的肽，并通过验证经鉴定的肽的功效进行选择。
[0041]
在具体的示例性实施方案中，为了验证经鉴定的肽的功效，通过验证对snare复合物形成的抑制效果和对神经递质释放的抑制效果来选择用于抑制神经递质释放的肽。
[0042]
此外，可以通过将由该方法选择的肽与活性物质缀合从而制备本发明的活性物质-肽缀合物。在具体的示例性实施方案中，通过验证与包括seq id no:1的氨基酸序列的肽化学缀合制备而成的活性物质-肽缀合物的功效来选择活性物质。
[0043]
在具体的示例性实施方案中，在将10种活性物质-肽缀合物施用至小鼠、然后首先选择das分析结果为4的缀合物后，观察肌肉松弛效果的持续时间，最后选择出在相同剂量下显示出了最长持续时间的活性物质-肽缀合物。
[0044]
在本说明书中，术语“肽”是指由氨基酸残基组成的线性分子，并且具体而言，本发明的肽可包括由seq id no:1表示的氨基酸序列。
[0045]“肽”可以是通过在不影响功能的范围内的氨基酸残基的缺失、插入、置换或它们的组合而得到的具有不同序列的氨基酸变体或片段。不完全改变肽的活性的氨基酸交换在本领域中是已知的。在一些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸酯化、糖基化、甲基化、法尼基化等对氨基酸交换进行修饰。因此，本发明包括具有与具有seq id no:1的氨基酸序列的肽基本上相同的氨基酸序列的肽，以及该肽的变体或活性片段。基本上相同的蛋白是指与seq id no:1的氨基酸序列的序列同源性为至少75％、优选至少80％、例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列，但不限于此，并且同源性为75％以上且具有相同活性的氨基酸序列包括在本发明的范围内。此外，本发明的肽还可包括为了增加靶向序列、标签、标记的残基和半衰期或肽稳定性的特定目的而制备的氨基酸序列。
[0046]
此外，为了获得更好的化学稳定性、增强的药理学性质(半衰期、吸收性、效价、功效等)、经修饰的特异性(例如，宽的生物活性谱)和降低的抗原性，可以将保护基结合至肽的n端或c端。例如，保护基可为乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基或聚乙二醇(peg)，然而，保护基可以包括可增强对肽的修饰作用、特别是可增强肽的稳定性的任何成分，没有限制。“稳定性”用于指以下含义：其不仅包括保护本发明的肽在体内免受蛋白裂解酶的攻击的体内稳定性，而且包括储存稳定性(例如，室温储存稳定性)。
[0047]
本文所用的术语“活性物质”是指具有至少一个羧基的物质，该活性物质可以与本发明的肽的n端化学缀合，并且协同地诱导肽的活性，具体而言，活性物质可为trolox。
[0048]
本发明的“trolox”为6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸，trolox是维生素e的水溶性类似物，并且用作抗氧化剂。trolox的结构如以下化学式1所示。
[0049]
[化学式1]
[0050][0051]
在本发明的活性物质-肽缀合物中，当活性物质为trolox时，将与trolox缀合的肽称为“trolox-肽缀合物”。
[0052]
具体而言，本发明提供了一种trolox-肽缀合物，其中trolox与具有seq id no:1的氨基酸序列的肽缀合。
[0053]
trolox可与肽的n端、c端或侧链缀合。具体而言，trolox的羧基可与肽的n端肽结合。
[0054]
trolox-肽缀合物的实施方案可由以下化学式2表示。
[0055]
[化学式2]
[0056][0057]
在本发明的具体示例性实施方案中，确认了trolox-肽缀合物在实验动物中具有抑制神经递质从神经细胞末端释放的优异效果以及使收缩的肌肉松弛的效果。
[0058]
此外，在本发明的具体示例性实施方案中，确认了本发明的trolox-肽缀合物具有优异的缓解肌肉收缩的效果，并且还通过增加构成真皮的蛋白的表达从而具有显著的改善皮肤皱纹的效果。
[0059]
另一方面，本发明提供了一种用于肌肉松弛的组合物，其包含trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合。
[0060]
此外，本发明提供了一种用于肌肉松弛的方法，包括向受试者施用trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合。
[0061]
此外，本发明提供了一种trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合，所述trolox-肽缀合物用于肌肉松弛。
[0062]
肽、trolox和trolox-肽缀合物的详细内容如上文所述。
[0063]
trolox-肽缀合物可通过抑制神经递质从神经细胞末端的释放缓解肌肉收缩或松弛肌肉。
[0064]
可以以本领域通常制备的任何制剂制备用于肌肉松弛的组合物，例如可以根据一般方法以诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服制剂、外用制剂、栓剂和无菌注射液的形式配制和使用。
[0065]“受试者”可包括人。此外，术语“受试者”可以是需要施用本发明的trolox-肽缀合物的对象，并且需要施用的受试者可以是需要肌肉松弛的对象。
[0066]“施用”是指通过任何合适的方法为患者提供预定的物质，并且本发明的组合物的施用途径可以是通过所有常用途径的口服或肠胃外施用，只要组合物可以到达靶组织即可。此外，可以通过任何能够将活性物质移动至靶细胞的装置施用组合物。
[0067]
在又一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗神经肌肉障碍的药物组合物，其包含trolox-肽缀合物作为活性成分。
[0068]
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗神经肌肉障碍的方法，包括向受试者施用trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合。
[0069]
受试者可以是需要施用trolox-肽缀合物的对象，或可以是需要预防或治疗神经肌肉障碍的对象。
[0070]
此外，本发明提供了一种trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合，所述trolox-肽缀合物用于预防或治疗神经肌肉障碍。
[0071]
trolox-肽缀合物可用于通过抑制snare复合物的形成来抑制神经递质，并且trolox-肽缀合物可用于预防或治疗神经肌肉障碍，以缓解肌肉收缩或使肌肉松弛。
[0072]“神经肌肉障碍”是指由于神经递质的过度释放引起的肌肉收缩或僵硬造成的疾病。例如，神经肌肉障碍可以选自由以下组成的组：肌阵挛、偏侧面肌痉挛、痉挛性斜颈、肛裂、眼睑痉挛、面肌痉挛、大脑性麻痹、斜视、颞下颌关节紊乱病、神经痛、肌痛、膀胱过度活动症、急迫性尿失禁、肌张力障碍、多汗症和由胆碱能神经系统控制的腺体过度释放表达的疾病。
[0073]“预防”是指通过施用trolox-肽缀合物或包含trolox-肽缀合物的组合物抑制或延迟疾病发作的全部作用。
[0074]“治疗”或“改善”是指通过施用trolox-肽缀合物或包含trolox-肽缀合物的组合物改善或有益地改变疾病症状的全部作用。
[0075]
用于预防或治疗神经肌肉障碍的组合物可以根据常规方法以诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服制剂、外用制剂、栓剂和无菌注射液的形式配制和使用，并且可以包括通常用于制备制剂用药物组合物的合适的载体、赋形剂或稀释剂。
[0076]
药学上可接受的载体可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、金合欢胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，这些载体通常用于制剂中。
[0077]
除了上述成分之外，药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
[0078]
药物组合物可以根据所需方法口服施用或肠胃外施用(例如，肌内给药、静脉内给药、腹腔内给药、皮下给药、皮内给药或局部给药)，并且其剂量根据患者的状况和体重、疾
病的程度、药品形式以及施用途径和时间而变化，而且可以由本领域技术人员适当地选择。
[0079]
药物组合物以药学有效剂量施用。在本发明中，“药学有效剂量”是指以适用于医学治疗的合理的效益/风险比治疗疾病的足够的量，并且可以根据包括患者的疾病类型和严重程度、药品活性、对药品的敏感性、施用时间、施用途径、排出速率、治疗持续时间和同时使用的药品在内的因素以及医学领域中公知的其他因素确定有效剂量水平。药物组合物可以作为单独的治疗剂或者可以与其他治疗剂组合施用，并且药物组合物可以与常规治疗剂同时、分开或顺序施用，并且药物组合物可以单独或多次施用。重要的是，通过考虑所有要素施用能够以最少用量获得最大效果而没有副作用的量，这可以由本领域技术人员容易地确定。
[0080]
药物组合物的有效剂量可以根据患者的年龄、性别、状况和体重、活性成分在体内的吸收、失活速率、排泄速率、疾病类型和组合使用的药品而变化，并且可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少。例如，可以以每天每1kg患者体重约0.0001μg至500mg、优选0.01μg至100mg施用药物组合物。
[0081]
在又一方面，本发明提供了一种用于改善皮肤状况的组合物，其包含trolox-肽缀合物作为活性成分，在trolox-肽缀合物中，具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合。
[0082]
此外，本发明提供了用于改善皮肤状况的方法，包括向受试者施用trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合。
[0083]
受试者可以是需要施用trolox-肽缀合物的对象，或需要改善皮肤状况的对象。
[0084]
此外，本发明提供了一种trolox-肽缀合物，其中具有seq id no:1的氨基酸序列的肽与trolox缀合，所述trolox-肽缀合物用于改善皮肤状况。
[0085]
肽、trolox和trolox-肽缀合物的详细内容如上文所述。
[0086]“皮肤状况”是指由皮肤老化造成的皮肤弹性的下降、皱纹的形成或面部细纹的形成，并且老化包括由时间推移、外部环境等造成的内源性老化和外源性老化。
[0087]
此外，皱纹是指在包括面部在内的全部身体部位中出现的皱纹，并且可以包括静态皱纹和动态皱纹这两者。
[0088]“改善皮肤状况”是指保持或增强与皮肤皱纹和弹性相关的能力，例如，可以是选自由以下组成的组中的任一者：减少细纹外观、减少皱纹外观、使眼睛扩张(winding)、使嘴角抬升、减少肌肉量、减少面部不对称、以及使从上唇延伸的线变平。
[0089]
trolox-肽缀合物抑制snare复合物的形成，以防止神经递质的释放，从而缓解面部肌肉的收缩，并表现出改善皮肤状况的效果。
[0090]
此外，trolox-肽缀合物诱导i)增加coliα1(iα1型胶原)的表达、ii)增加纤连蛋白基因的表达或iii)增加弹性蛋白基因的表达，以预防或改善皮肤皱纹，从而表现出改善皮肤状况的效果。
[0091]
具体而言，胶原是构成皮肤的主要蛋白，它在皮肤真皮中存在的成纤维细胞中以原胶原的形式合成，然后释放至细胞外基质中，并转化为活性胶原，然而，本发明的trolox-肽缀合物可以通过增加皮肤真皮中活性胶原蛋白的合成来抑制皱纹形成。此外，皮肤真皮由作为胶原纤维的胶原和作为弹性纤维的弹性蛋白组成。就此而言，胶原纤维实现了皮肤张力的形成和结构的整体性，而弹性蛋白纤维可以参与皮肤弹性使皮肤弹性增强。具体而
言，根据本发明的trolox-肽缀合物促进了弹性蛋白的表达，从而表现出增强皮肤弹性的效果。
[0092]
用于改善皮肤状况的组合物可以为化妆品组合物。
[0093]
可以以本领域通常制备的任何制剂制备化妆品组合物，并且可以通过例如溶液、混悬剂、乳剂、糊剂、凝胶剂、霜剂、洗剂、粉末剂、肥皂、含表面活性剂的清洗剂、油剂、粉末粉底、乳液粉底、蜡质粉底、喷雾剂等进行配制，但不限于此。
[0094]
化妆品组合物可以制备成各种形式，例如柔肤水、滋养乳液、滋养霜、按摩霜、精华液、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、洁肤水、面膜、喷雾、粉末、生发油、发乳、洗发液、洗发香波、染发剂、护发素、头发喷雾剂、头发气雾剂、润发油、诸如凝胶之类的溶液、溶胶凝胶、乳液、油、蜡、气雾剂等，但不限于此。
[0095]
除了trolox-肽缀合物之外，化妆品组合物还可以包含其他添加剂，例如赋形剂和载体，并且可以根据需要与一般皮肤化妆品中混合的常用成分一起施加和混合。
[0096]
当化妆品组合物的制剂形式为糊剂、霜剂或凝胶剂时，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等作为载体成分。
[0097]
当化妆品组合物的制剂形式为粉末剂或喷雾剂时，可使用乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或者聚酰胺粉末作为载体成分，特别是，在喷雾剂的情况下，制剂还可包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或者二甲醚之类的推进剂，但不限于此。
[0098]
当化妆品组合物的制剂形式为溶液或乳剂时，可使用溶剂、增溶剂或者乳化剂作为载体成分。例如，载体成分可以采用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、丙三醇脂肪族酯、聚乙二醇或者山梨糖醇的脂肪酸酯。
[0099]
当化妆品组合物的制剂形式为混悬剂时，可使用诸如水、乙醇或丙二醇之类的液体稀释剂、诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨聚糖酯之类的混悬剂、微晶性纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶等作为载体成分。
[0100]
当化妆品组合物的制剂为含表面活性剂的清洗剂时，可使用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。
[0101]
当化妆品组合物的制剂为洗发香波时，化妆品组合物的基础制剂为洗发香波，用于形成香波的基础成分如增稠剂、表面活性剂、粘度调节剂、保湿剂、ph调节剂、防腐剂和精油，可与本发明的trolox-肽缀合物混合。cde可用作增稠剂，作为阴离子表面活性剂的les和作为两性表面活性剂的椰油甜菜碱可用作表面活性剂，聚季铵盐可以用作粘度调节剂，甘油可以用作保湿剂，并且柠檬酸和氢氧化钠可以用作ph调节剂。葡萄柚提取物等可用作防腐剂，并且还可以添加诸如杉木、薄荷和迷迭香之类的精油、丝氨基酸、戊醇或维生素e。
[0102]
除了作为活性成分的本发明的trolox-肽缀合物和载体成分之外，化妆品组合物中所含的成分还可以包括化妆品组合物中通常使用的成分，例如常规助剂如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料。
[0103]
用于改善皮肤状况的组合物可以为准药品组合物。
[0104]“准药品”是指在用于诊断、治疗、改善、减轻、治疗或预防人或动物疾病的制品中，
比药品的作用更温和的制品。例如，根据药事法(pharmaceutical affairs act)，准药品包括用于治疗或预防人/动物疾病的制品、对人体具有温和或没有直接作用的制品等，排除了用于药品目的的制品。
[0105]
准药品组合物可以通过选自由以下组成的组中的一种或多种进行制备：身体清洁剂、泡沫剂、肥皂、面膜、软膏剂、霜剂、洗剂、精华液和喷雾剂，但不限于此。此外，可以将组合物制备成条带、卫生巾等形式，但不限于此。
[0106]
当trolox-肽缀合物用作准药品添加剂时，trolox-肽缀合物可以原样添加或与其他准药品或准药品成分一起使用，并且可以根据常规方法适当使用。
[0107]
如上所述，本发明的trolox-肽缀合物抑制了神经递质从神经细胞末端的释放，从而具有缓解肌肉收缩或松弛肌肉的效果，因此可用作药品、准药品或化妆品组合物的原料，以缓解肌肉收缩。
[0108]
以下，将通过实施例和实验例详细说明本发明。
[0109]
然而，以下的实施例和实验例仅是对本发明的说明，并且本发明的内容不限于以下的实施例和实验例。
[0110]
[实施例1]
[0111]
新肽的合成和物理性质的确认
[0112]
1-1.包括seq id no:1的氨基酸序列的肽的合成
[0113]
使用已知方法制备由seq id no:1表示的氨基酸序列组成的新的肽序列“kflik”。使用分子量测定仪测定包括seq id no:1的氨基酸序列的肽的分子量，结果确认包括seq id no:1的氨基酸序列的肽的分子量相当于647.4da。
[0114]
1-2.长期储存时的高温稳定性的评价
[0115]
将由seq id no:1的氨基酸序列组成的本发明的肽以1000ppm的浓度溶解于无菌蒸馏水中，并且在45℃储存7天、14天、28天、60天和75天，然后进行hplc分析。
[0116]
作为结果，如图1a所示，确认了在45℃的条件下，在75天的最长观察天数内，本发明的肽的稳定性得以维持。
[0117]
1-3.高温稳定性的评价
[0118]
将本发明的肽以1000ppm的浓度溶解于无菌蒸馏水中，在121℃加热15分钟和30分钟，然后进行hplc分析。
[0119]
作为结果，如图1b所示，确认了在121℃，在30分钟的最长加热时间内，本发明的肽的稳定性得以维持。
[0120]
[实施例2]
[0121]
trolox-肽缀合物的制备
[0122]
在肽反应器中，添加1摩尔的肽基树脂和10ml的1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)，并且添加270mg(2.0当量)的1-羟基苯并三唑(1-hobt)和759mg(2.0当量)的n,n,n',n'-四甲基-o-(1h-苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(hbtu)，并且反应30分钟。然后，向反应产物中添加388mg(3.0当量)的n,n'-二异丙基乙胺(diea)和500mg(2.0当量)的trolox，在室温反应72小时，然后过滤。然后，滤液和裂解溶液在室温反应2小时以除去树脂和保护基。最后，向滤液中添加10ml的乙醚并结晶，以制备trolox-肽缀合物(即，seq id no:1的肽与trolox的缀合物)。用于制备trolox-肽缀合物的反应式示于以下反应式1。
[0123]
[反应式1]
[0124][0125]
对制备的trolox-肽缀合物进行质谱分析，结果确认合成了分子量为880.1da的trolox-肽缀合物。
[0126]
[实验例1]
[0127]
trolox-肽缀合物对神经细胞中神经递质释放的抑制效果
[0128]
为了确认trolox-肽缀合物对神经细胞中神经递质释放的抑制效果，使用成神经细胞瘤衍生细胞系(sh-sy5y)测定作为神经递质的乙酰胆碱的释放量。
[0129]
具体而言，将sh-sy5y细胞注入培养皿，并且在37℃、5％co2培养箱中培养24小时，然后将培养基更换为无血清培养基。随后，用浓度为1μm、10μm和50μm的trolox-肽缀合物处理培养皿，作为阳性对照组则用50nm的破伤风毒素处理培养皿，并培养48小时。然后通过用烟碱(nic)和氯化钾(kcl)处理30分钟来诱导乙酰胆碱的释放。然后，使用乙酰胆碱分析试剂盒(abcam)测定培养基中所含乙酰胆碱的释放量。
[0130]
作为结果，如图1所示，在仅用烟碱(nic)和氯化钾(kcl)处理的组中，乙酰胆碱的释放是未处理的对照组的至少三倍，但是在用trolox-肽缀合物处理的全部组中，都显著抑制了乙酰胆碱的释放。
[0131]
[实验例2]
[0132]
trolox-肽缀合物在实验动物中的肌肉松弛效果
[0133]
2-1.动物模型的准备
[0134]
具体而言，在动物实验中使用7周龄的雌性sprague-dawley大鼠(sam taco bio korea)，并且将大鼠分成分别用1u和3u的肉毒杆菌神经毒素(bont)处理的组和用本发明的trolox-肽缀合物以2.5mg/只和5mg/只的剂量处理的组。
[0135]
将肉毒杆菌神经毒素和本发明的trolox-肽缀合物分别施用至实验动物的右小腿肌肉。
[0136]
2-2.肌肉收缩缓解效果的确认
[0137]
为了确认trolox-肽缀合物对肌肉松弛的效果，通过目视观察分析来比较上述例2-1的每个处理组的麻痹的趾部肌肉松弛所花费的时间。
[0138]
具体而言，观察各处理组处理后的大鼠的右脚，并使用脚趾外展评分(das)分析来测定肌肉麻痹。在das分析中，通过鼠尾部使鼠漂浮较短的一段时间，以诱导大鼠的特征性惊吓应答，其中后肢伸展，并且后脚趾打开。用5分等级(0至4)评价大鼠惊吓反应的程度。在此，0分表示正常惊吓反应，并且4分表示脚趾外展和腿伸展达到最大程度的减少(0分：全部五个脚趾都分开；1分：外展期间一个向外的脚趾并拢；2分：三个脚趾并拢；3分：四个脚趾并拢；4分：全部五个脚趾都并拢)。
[0139]
作为结果，如表2和图2和3所示，3天后肌肉松弛效果在全部组中都最高，并且该效果随时间的推移有一定程度的下降，与注射botox的组相比，注射本发明的trolox-肽缀合
物的组的肌肉松弛效果持续的时间更长。
[0140]
[表1]
[0141][0142]
[实验例3]
[0143]
trolox-肽缀合物改善皮肤皱纹的效果
[0144]
使用小鼠成纤维细胞(nih3t3)来确认构成真皮的蛋白的表达模式，以确认本发明的trolox-肽缀合物是否具有改善皮肤皱纹的效果。
[0145]
具体而言，将nih3t3细胞以1.5
×
105细胞/孔的密度接种至6孔平板，并在37℃、5％co2培养箱中培养16小时。接下来，用浓度为1μm、10μm和50μm的trolox-肽缀合物处理平板，再次培养16小时，然后从培养细胞中分离rna。使用cdna合成试剂盒(intron，韩国)由分离的rna合成cdna。此时使用的引物碱基序列如表3所示。扩增的pcr产物在琼脂糖凝胶上进行电泳以确认dna条带。
[0146]
[表2]
[0147][0148]
作为结果，如图4所示，确认了与对照组相比，在trolox-肽缀合物处理时，胶原、纤
连蛋白和弹性蛋白的表达水平显著增加。
[0149]
作为结果，可以看出，trolox-肽缀合物可通过增加构成真皮的蛋白的表达水平表现出预防或改善皮肤皱纹的效果。