用于治疗多发性硬化的肽和方法与流程

1.本发明涉及免疫原性肽。特别地，本发明涉及来源于髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，mog)的包含与t细胞表位连接的氧化还原酶基序的免疫原性肽、以及由这些肽产生的溶细胞性cd4+t细胞，其用于治疗脱髓鞘病症，例如多发性硬化(multiple sclerosis，ms)或视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，nmo)。


背景技术：

2.已描述了数种策略来防止针对抗原的不希望免疫应答的产生。wo2008/017517描述了使用包含给定抗原蛋白mhc ii类t细胞表位和氧化还原酶基序的肽的新策略。这些肽将cd4+t细胞转化成具有溶细胞特性的细胞类型，称为溶细胞性cd4+t细胞。这些细胞能够通过触发凋亡杀伤那些抗原呈递细胞(antigen presenting cell，apc)，所述抗原呈递细胞呈递从中获得肽的抗原。wo2008/017517示出了用于变态反应和自身免疫病(例如i型糖尿病)的这一概念。
3.wo2009101207和carlier et al.(2012)plos one 7,10e45366进一步更详细地描述了抗原特异性溶细胞性细胞。wo2016059236还公开了经修饰的肽，其中在氧化还原酶基序附近存在另外的组氨酸。wo2012069568还公开了包含抗原蛋白nkt细胞表位和氧化还原酶基序的肽。这些肽能够引发nkt细胞的活化，其代表用于治疗许多疾病例如感染性疾病和自身免疫病或癌症的有价值的方法。wo2017182528描述了包含mog表位的免疫原性肽用于治疗多发性硬化的用途。
4.多发性硬化(ms)是中枢神经系统的最常见自身免疫病症，并且在过去二十年，其发生率在大多数地区显著提高。据估计，在2016年，全世界超过220万人患有ms。ms的全球发生率在男性与女性之间显著不同。在青春期前(preteen)的儿童中，发生率大致相等。然而，在青少年和年长群体组中，发生该疾病的女性约为两倍(gdb 2016motor neuron disease collaborators.2018.lancet neurol.17(12),1083-1097)。ms最常见是通过评估临床症状与医学成像和/或实验室测试组合来诊断的。
5.可在对象中表现出的临床症状是多样的并且包括许多神经症状。然而，自主性、视觉、运动和感觉问题显示为最常见的(compston and coles.2008.lancet.372(9648):1502-17)。
6.髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)是仅在少突胶质细胞膜和髓鞘的最外层表面处表达的糖蛋白。mog的确切分子功能仍有争议，然而，本领域中显示出一致的是：其参与髓鞘的完成和/或维持，并且在此可能充当髓鞘上的黏附分子以提供结构完整性(peschl et al.front.immunol.(2017).8,529)。mog的假设的重要性是通过以下来证实的：哺乳动物中mog的高度同源编码区(pham-dinh et al.(1994)j.neurochem.63(6),2353-2356)，以及mog可在实验模型和炎性脱髓鞘疾病中充当t和b细胞应答的自身抗原的观察结果(peschl et al.front.immunol.(2017).8,529)。已经报道了针对mog的抗体(抗mog ab)在ms发病机制中的作用，并且可被认为是ms诊断中的生物标志物，但是人mog ab的确切病理学作用和
no：11)，flrvpswkitlfh(seq id no：12)，flrvpcwkitlfhh(seq id no：13)，flrvpswkitlfhh(seq id no：14)，flrvpcwkitlfhhh(seq id no：15)，或flrvpswkitlfhhh(seq id no：16)，
22.作为替代地，所述免疫原性肽另外包含一个或更多个在所述表位c端侧翼的r氨基酸残基，产生例如以下接头-t细胞表位-侧翼的序列中的任一者：
23.flrvpcwkitlfr(seq id no：17)，flrvpswkitlfr(seq id no：18)，
24.flrvpcwkitlfrr(seq id no：19)，flrvpswkitlfrr(seq id no：20)，或
25.flrvpcwkitlfrrr(seq id no：21)，或flrvpswkitlfrrr(seq id no：22)。
26.方面4.根据方面1至3中任一项所述的肽，其中所述氧化还原酶基序具有z
m-c-x
n-c-(seq id no：116至140)的序列。
27.方面5.根据方面1至3中任一项所述的肽，其中所述氧化还原酶基序具有z
m-[cst]-xx-c-或z
m-c-xx-[cst]-的序列。
[0028]
方面6.根据方面1至5中任一项所述的肽，其中所述氧化还原酶基序选自以下氨基酸基序：
[0029]
(a)z
m-[cst]-x
n-c-或z
m-c-x
n-[cst]-，
[0030]
其中n是0，并且其中m是选自0、1或2的整数，
[0031]
其中z是任意氨基酸，优选是碱性氨基酸并优选选自h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，更优选k或h，最优选k；
[0032]
(b)z
m-[cst]-x
n-c-或z
m-c-x
n-[cst]-，
[0033]
其中n是1，其中x是任意氨基酸，优选是碱性氨基酸并选自h、k、r和非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，更优选k或r，
[0034]
其中m是选自0、1或2的整数，
[0035]
其中z是任意氨基酸，优选是碱性氨基酸并优选选自h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，更优选k或h，最优选k；
[0036]
(c)如方面1中所限定的z
m-[cst]-x
n-c-或z
m-c-x
n-[cst]-，其中n是2，从而在氧化还原酶基序内产生内部x1x2氨基酸偶联物，其中x是任意氨基酸，优选地其中至少一个x是选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，更优选k或r，
[0037]
其中m是选自0、1或2的整数，
[0038]
其中z是任意氨基酸，优选是碱性氨基酸并优选选自h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，更优选k或h，最优选k；
[0039]
(d)如方面1中所限定的z
m-[cst]-x
n-c-或z
m-c-x
n-[cst]-，其中n是3，从而在氧化还原酶基序内产生内部x1x2x3氨基酸段，其中x是任意氨基酸，优选地其中至少一个x是选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，更优选k或r，
[0040]
其中m是选自0、1或2的整数，
[0041]
其中z是任意氨基酸，优选是碱性氨基酸并优选选自h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，更优选k或h；
[0042]
(e)如方面1中所限定的z
m-[cst]-x
n-c-或z
m-c-x
n-[cst]-，其中n是4，从而在氧化还原酶基序内产生内部x1x2x3x4(seq id no：154)氨基酸段，其中m是选自0、1或2的整数，其中z是任意氨基酸，优选是碱性氨基酸并选自h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸
例如l-鸟氨酸，优选k或h，最优选k；
[0043]
(f)如方面1中所限定的z
m-[cst]-x
n-c-或z
m-c-x
n-[cst]-，其中n是5，从而在氧化还原酶基序内产生内部x1x2x3x4x5(seq id no：166)氨基酸段，其中m是选自0、1或2的整数，其中z是任意氨基酸，优选是碱性氨基酸并选自h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h，最优选k；
[0044]
(g)如方面1中所限定的z
m-[cst]-x
n-c-或z
m-c-x
n-[cst]-，其中n是6，从而在氧化还原酶基序内产生内部x1x2x3x4x5x6(seq id no：177)氨基酸段，其中m是选自0、1或2的整数，其中z是任意氨基酸，优选是碱性氨基酸并选自h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h，最优选k；或者
[0045]
(h)z
m-[cst]-x
n-c-或z
m-c-x
n-[cst]-，其中n是0至6并且其中m是0，并且其中c或[cst]残基之一已被修饰以在基序的氨基酸残基的n端酰胺上或在c端羧基上携带乙酰基、甲基、乙基或丙酰基(seq id no：184至203)。
[0046]
方面7.根据方面1至6中任一项所述的肽，其中至少一个x是脯氨酸(p)或酪氨酸(y)，优选地其中每个x是脯氨酸或酪氨酸，更优选地其中所述氧化还原酶基序的xn或xx部分包含序列py，优选地其中氧化还原酶基序包含序列cpyc(seq id no：23)。
[0047]
方面8.根据方面1至7中任一项所述的肽，其中所述氧化还原酶基序的氨基酸z是碱性氨基酸，优选选自由以下组成的氨基酸的组的碱性氨基酸：h、k、r和任意非天然碱性氨基酸，更优选选自以下的碱性氨基酸：h、k和r，最优选地其中z是h或k。
[0048]
方面9.根据方面1至8中任一项所述的肽，其中所述氧化还原酶基序b1)具有hcpyc(seq id no：24)的序列。
[0049]
方面10.根据方面1至9中任一项所述的肽，其中所述肽包含以下或由以下组成：氨基酸序列hcpycvryflrvpswkitlf(seq idno：25)，hcpycvryflrvpcwkitlf(seq id no：26)，khcpycvryflrvpswkitlfkk(seq id no：27)，khcpycvryflrvpcwkitlfkk(seq id no：28)，khcpycvryflrvpswkitlf(seq id no：247)，或khcpycvryflrvpcwkitlf(seq id no：248)，
[0050]
优选包含以下或由以下组成：氨基酸序列khcpycvryflrvpswkitlfkk(seq id no：27)。
[0051]
方面11.根据方面1至10中任一项所述的免疫原性肽，其中所述t细胞表位是nkt细胞表位，并且所述肽的长度为12至50个氨基酸，优选12至30个氨基酸；或者
[0052]
其中所述t细胞表位是mhc ii类t细胞表位，并且所述肽的长度为12至50个氨基酸，优选12至30个氨基酸。
[0053]
方面12.多核苷酸(核酸分子)，其编码根据方面1至11中任一项所述的免疫原性肽，所述多核苷酸优选选自分离的脱氧核糖核酸(desoxyribonucleic acid，dna)、质粒dna(plasmid dna，pdna)、编码dna(coding dna，cdna)、核糖核酸(ribonucleic acid，rna)、信使rna(messenger rna，mrna)、或其经修饰形式。在一些实施方案中，所述核酸可以是表达盒的一部分，其任选地并入到可用于基因治疗的(病毒)载体或质粒中，或者可以以根据药物和基因治疗领域中已知的技术待施用的经包封的或裸的dna或rna的形式存在。
[0054]
方面13.根据方面1至11中任一项所述的肽，或根据方面12所述的多核苷酸，其用作药物。
[0055]
方面14.根据方面13所述的肽或多核苷酸，其用于治疗脱髓鞘病症、改善脱髓鞘病
症的症状和/或预防脱髓鞘病症。
[0056]
脱髓鞘病症包括但不限于：多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、巴洛病(balo’s disease)、htlv-i相关脊髓病、希尔德病(schilder’s disease)、横贯性脊髓炎、特发性炎性脱髓鞘病、维生素b12诱导的中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、包括脊髓痨(tabes dorsalis)的脊髓病、脑白质营养不良例如肾上腺脑白质营养不良、白质脑病例如进行性多灶性白质脑病(progressive multifocal leukoencephalopathy，pml)、消失性白质病(vanishing white matter disease)和风疹诱导的智力低下。
[0057]
优选的是由mog自身抗原和/或抗mog抗体引起或加重的脱髓鞘病症，例如多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、消失性白质病和风疹诱导的智力低下。更优选的脱髓鞘病症是多发性硬化(ms)和视神经脊髓炎(nmo)。在某些实施方案中，所述ms选自临床孤立综合征(clinically isolated syndrome，cis)、复发缓解型ms(elapse-remitting ms，rrms)、继发进展型ms(secondary progressive ms，spms)、原发进展型ms(primary progressive ms，ppms)、急性暴发性多发性硬化和疑似ms的放射学孤立综合征(radiology isolated syndrome，ris)。
[0058]
方面15.用于产生针对呈递mog表位的apc的溶细胞性cd4+t细胞的群体的体外方法，其包括以下步骤：
[0059]-提供外周血细胞；
[0060]-使所述细胞在体外与方面1至11中任一项所述的肽或根据方面12所述的多核苷酸接触；以及
[0061]-在存在il-2的情况下扩增所述细胞。
[0062]
方面16.用于产生针对呈递mog表位的apc的溶细胞性cd4+t细胞的群体的方法，其包括以下步骤：
[0063]-向对象施用有效量的方面1至11中任一项所述的肽，或根据方面12所述的多核苷酸；
[0064]-从所述对象的外周血细胞群中获得所述溶细胞性cd4+t细胞。
[0065]
方面17.用于产生针对呈递mog表位的apc的nkt细胞的群体的方法，其包括以下步骤：
[0066]-向对象施用有效量的方面1至11中任一项所述的肽，或根据方面12所述的多核苷酸；
[0067]-从所述对象的外周血细胞群中获得所述nkt细胞。
[0068]
方面18.针对呈递mog表位的apc的溶细胞性cd4+t细胞或nkt细胞的群体，其可通过方面15、16或17所述的方法获得。
[0069]
方面19.针对呈递mog表位的apc的溶细胞性cd4+t细胞或nkt细胞的群体，其可通过方面15、16或17所述的方法获得，其用作药物。
[0070]
方面20.根据方面19所述应用的溶细胞性cd4+t细胞或nkt细胞的群体，其用于治疗脱髓鞘病症、改善脱髓鞘病症的症状、和/或预防脱髓鞘病症或减轻脱髓鞘病症的症状。
[0071]
脱髓鞘病症包括但不限于：多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性
播散性脑脊髓炎、巴洛病、htlv-i相关脊髓病、希尔德病、横贯性脊髓炎、特发性炎性脱髓鞘病、维生素b12诱导的中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、包括脊髓痨的脊髓病、脑白质营养不良例如肾上腺脑白质营养不良、白质脑病例如进行性多灶性白质脑病(pml)、消失性白质病和风疹诱导的智力低下。
[0072]
优选的是由mog自身抗原和/或抗mog抗体引起或加重的脱髓鞘病症，例如多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、消失性白质病和风疹诱导的智力低下。更优选的脱髓鞘病症是多发性硬化(ms)和视神经脊髓炎(nmo)。在某些实施方案中，所述ms选自临床孤立综合征(cis)、复发缓解型ms(rrms)、继发进展型ms(spms)、原发进展型ms(ppms)、急性暴发性多发性硬化和疑似ms的放射学孤立综合征(ris)。
[0073]
方面21.药物组合物，其包含方面1至11中任一项所述的肽、根据方面12所述的多核苷酸、或方面18至20中任一项所述的cd4+t细胞或nkt细胞、或其任意混合物。
[0074]
方面22.方面21所述的药物组合物，其任选地还包含可药用载体，并且任选地还包含适合于治疗脱髓鞘病症、或减轻脱髓鞘病症的症状或预防脱髓鞘病症的另外的活性成分。
[0075]
脱髓鞘病症包括但不限于：多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、巴洛病、htlv-i相关脊髓病、希尔德病、横贯性脊髓炎、特发性炎性脱髓鞘病、维生素b12诱导的中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、包括脊髓痨的脊髓病、脑白质营养不良例如肾上腺脑白质营养不良、白质脑病例如进行性多灶性白质脑病(pml)、消失性白质病和风疹诱导的智力低下。
[0076]
优选的是由mog自身抗原和/或抗mog抗体引起或加重的脱髓鞘病症，例如多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、消失性白质病和风疹诱导的智力低下。更优选的脱髓鞘病症是多发性硬化(ms)和视神经脊髓炎(nmo)。在某些实施方案中，所述ms选自临床孤立综合征(cis)、复发缓解型ms(rrms)、继发进展型ms(spms)、原发进展型ms(ppms)、急性暴发性多发性硬化和疑似ms的放射学孤立综合征(ris)。
[0077]
方面23.方面21或22所述的药物组合物，其用作药物。
[0078]
方面24.根据方面23所述应用的药物组合物，其用于治疗脱髓鞘病症、改善脱髓鞘病症的症状和/或预防脱髓鞘病症。
[0079]
脱髓鞘病症包括但不限于：多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、巴洛病、htlv-i相关脊髓病、希尔德病、横贯性脊髓炎、特发性炎性脱髓鞘病、维生素b12诱导的中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、包括脊髓痨的脊髓病、脑白质营养不良例如肾上腺脑白质营养不良、白质脑病例如进行性多灶性白质脑病(pml)、消失性白质病和风疹诱导的智力低下。
[0080]
优选的是由mog自身抗原和/或抗mog抗体引起或加重的脱髓鞘病症，例如多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、消失性白质病和风疹诱导的智力低下。更优选的脱髓鞘病症是多发性硬化(ms)和视神经脊髓炎(nmo)。在某些实施方案中，所述ms选自临床孤立综合征(cis)、复发缓解型ms(rrms)、继发进展型ms(spms)、原发进展型ms(ppms)、急性暴发性多发性硬化和疑似
ms的放射学孤立综合征(ris)。
[0081]
方面25.根据前述方面中任一项所述的用于治疗ms、改善ms的症状和/或预防ms的肽、多核苷酸、cd4+t细胞、nkt细胞或药物组合物，其中所述对象被诊断为患有复发缓解型ms(rrms)。
[0082]
方面26.根据前述方面中任一项所述的用于治疗ms、改善ms的症状和/或预防ms的肽、多核苷酸、cd4+t细胞、nkt细胞或药物组合物，其中所述对象具有选自以下的hla-drb1*类型：hla-drb1*15:01、hla-drb1*03:01、hla-drb1*04:01和hla-drb1*07:01，优选地其中所述对象具有hla-drb1*15:01。
[0083]
方面27.根据前述方面中任一项所述的用于治疗nmo、改善nmo的症状和/或预防nmo的肽、多核苷酸、cd4+t细胞、nkt细胞或药物组合物，其中所述对象具有选自以下的hla类型：hla-drb1*03:01和hla-dpb1*05:01。
[0084]
方面28.根据方面1至11中任一项所述的免疫原性肽、根据方面12所述的多核苷酸、或方面18至20中任一项所述的cd4+t细胞或nkt细胞、或其任意混合物用于制备用于治疗脱髓鞘病症、改善脱髓鞘病症的症状和/或预防脱髓鞘病症的药物的用途，所述脱髓鞘病症优选是由mog自身抗原和/或抗mog抗体引起或加重的脱髓鞘病症，最优选是多发性硬化(ms)或视神经脊髓炎(nmo)。
[0085]
方面29.用于在对象中治疗脱髓鞘病症、改善脱髓鞘病症的症状和/或预防脱髓鞘病症的方法，其包括以下步骤：向对象提供根据方面1至11所述的肽、根据方面12所述的多核苷酸、或方面18至20中任一项所述的cd4+t细胞或nkt细胞、或其任意混合物。
[0086]
方面30.根据方面29所述的方法，其中所述脱髓鞘病症选自：多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、巴洛病、htlv-i相关脊髓病、希尔德病、横贯性脊髓炎、特发性炎性脱髓鞘病、维生素b12诱导的中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、包括脊髓痨的脊髓病、脑白质营养不良例如肾上腺脑白质营养不良、白质脑病例如进行性多灶性白质脑病(pml)、消失性白质病和风疹诱导的智力低下。
[0087]
在一些优选实施方案中，脱髓鞘病症由mog自身抗原和/或抗mog抗体引起或加重，并且因此选自：多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、消失性白质病和风疹诱导的智力低下。在一些更优选的实施方案中，脱髓鞘病症是多发性硬化(ms)或视神经脊髓炎(nmo)。在某些实施方案中，所述ms选自临床孤立综合征(cis)、复发缓解型ms(rrms)、继发进展型ms(spms)、原发进展型ms(ppms)、急性暴发性多发性硬化和疑似ms的放射学孤立综合征(ris)。
[0088]
方面31.根据方面29或30所述的方法，其还包括向所述对象施用富马酸酯化合物的步骤。富马酸酯化合物的一些实例是：富马酸单甲酯(monomethyl fumarate，mmf)，富马酸二甲酯(dimethyl fumarate，dmf)，可在体内代谢成mmf的化合物，富马酸单甲酯前药例如富马酸地洛西美酯(diroximel fumarate)或tepilamide fumarate，或者其任何一种或更多种的组合，或者其任何一种或更多种的氘化形式、包合物、溶剂合物、互变异构体、立体异构体或可药用盐，或者前述中任一种的组合。
[0089]
方面32.用于检测样品中对mog抗原具有特异性的mhc ii类限制性cd4+t细胞的体外方法，其包括以下步骤：
[0090]-使对象样品与分离的mhc ii类分子和根据方面1至11所述的肽或根据方面12所
述的多核苷酸的复合物接触；
[0091]-通过测量所述复合物与所述样品中细胞的结合来检测cd4+t细胞，其中所述复合物与细胞的结合指示所述样品中存在cd4+t细胞。
[0092]
本发明的上述和另一些方面以及一些优选实施方案在以下部分和所附权利要求书中描述。所附权利要求书的主题在此特别地并入本说明书中。
附图说明
[0093]
图1：p1至p5免疫原性肽的氧化还原活性的动力学。dtt用作阳性对照，而空白表示测定缓冲剂。结果以相对荧光单位(relative fluorescent unit，rfu)表示。在实施例部分详细描述了该测定。
[0094]
图2：p1至p5肽与hla-dr3(drb1*03:01mhc ii)蛋白的结合。降低的荧光信号(rfu)表明在与生物素标记的高亲和力对照肽竞争之后产生并通过eu
3+
链霉亲和素相互作用揭示的剂量依赖性关系。
[0095]
图3：p1至p5肽与hla-dr4(drb1*04:01mhc ii)蛋白的结合。降低的荧光信号(rfu)表明在与生物素标记的高亲和力对照肽竞争之后产生并通过eu
3+
链霉亲和素相互作用揭示的剂量依赖性关系。
[0096]
图4：p1至p5肽与hla-dr15(drb1*15:01mhc ii)蛋白的结合。降低的荧光信号(rfu)表明在与生物素标记的高亲和力对照肽竞争之后产生并通过eu
3+
链霉亲和素相互作用揭示的剂量依赖性关系。
[0097]
图5：p1、p6和p7肽与hla-dr3(drb1*03:01mhc ii)蛋白的结合。降低的荧光信号(rfu)表明在与生物素标记的高亲和力对照肽竞争之后产生并通过eu
3+
链霉亲和素相互作用揭示的剂量依赖性关系。
[0098]
图6：p1、p6和p7肽与hla-dr4(drb1*04:01mhc ii)蛋白的结合。降低的荧光信号(rfu)表明在与生物素标记的高亲和力对照肽竞争之后产生并通过eu
3+
链霉亲和素相互作用揭示的剂量依赖性关系。
[0099]
图7：p1、p6和p7肽与hla-dr15(drb1*15:01mhc ii)蛋白的结合。降低的荧光信号(rfu)表明在与生物素标记的高亲和力对照肽竞争之后产生并通过eu
3+
链霉亲和素相互作用揭示的剂量依赖性关系。
[0100]
图8：p4和p8至p11肽与hla-dr3(drb1*03:01mhc ii)蛋白的结合。降低的荧光信号(rfu)表明在与生物素标记的高亲和力对照肽竞争之后产生并通过eu
3+
链霉亲和素相互作用揭示的剂量依赖性关系。
[0101]
图9：p4和p8至p11肽与hla-dr4(drb1*04:01mhc ii)蛋白的结合。降低的荧光信号(rfu)表明在与生物素标记的高亲和力对照肽竞争之后产生并通过eu
3+
链霉亲和素相互作用揭示的剂量依赖性关系。
[0102]
图10：p4和p8至p11肽与hla-dr15(drb1*15:01mhc ii)蛋白的结合。降低的荧光信号(rfu)表明在与生物素标记的高亲和力对照肽竞争之后产生并通过eu
3+
链霉亲和素相互作用揭示的剂量依赖性关系。
[0103]
图11：在患者ms017(s9)、ms022(s10)和ms027(s12)(s，刺激)的cd4+细胞系上对p2肽具有特异性的效应细胞(cd154+)的频率。
[0104]
图12：在ms026 cd4+细胞系(s11)的培养上清液中由p2诱导的细胞因子(il-5和il-13)的特异性分泌。
[0105]
图13：在患者ms017(s12)、ms020(s7)、ms021(s9)、ms024(s7)、ms026(s12)、ms027(s12)、ms028(s11)和ms029(s9)(s，刺激)的cd4+细胞系上对p4肽具有特异性的效应细胞(cd154+)的频率。
[0106]
图14：在患者ms017(s9)和ms020(s10)(s，刺激)的cd4+细胞系上对p4肽具有特异性的效应细胞(cd154+)和表达fas配体的效应细胞(cd154+/fasl+)的频率。
[0107]
图15：在ms017(s15)、ms024(s20)和ms026(s14)cd4+细胞系(s，刺激)的培养上清液中由p4诱导的细胞因子(il-5)的特异性分泌。
[0108]
图16：在患者ms017(s14)和ms026(s13)(s，刺激)的cd4+细胞系上，对p4肽及其对应的短c-wt表位(dphflrvpcwkitlfkk，seq id no：29)具有特异性的效应细胞(cd154+)的频率。
[0109]
图17：在患者ms024(s20)、ms017(s9)、ms026(s13)、ms028(s11)和ms029(s9)(s，刺激)的cd4+细胞系上，对p4肽及其对应的短s-wt表位(klhrtfdphflrvpswkitlfk，seq id no：253)具有特异性的效应细胞(cd154+)的频率。
[0110]
图18：在ms017(s15)cd4+细胞系(s，刺激)的培养上清液中，由p4肽及其对应的短c-wt表位(dphflrvpcwkitlfkk，seq id no：29)和长c-wt表位(qyrlrgklraeienlhrtfdphflrvpcwkitlfvivpvlgp，seq id no：30)诱导的细胞因子(il-5)的特异性分泌。
[0111]
图19：在ms017(s12)和ms024(s20)cd4+细胞系(s，刺激)的培养上清液中，由p4肽及其对应的短s-wt表位(klhrtfdphflrvpswkitlfk，seq id no：253)诱导的细胞因子(il-5)的特异性分泌。
[0112]
图20：当将加载有p4肽或其对应的短s-wt表位(klhrtfdphflrvpswkitlfk，seq id no：253)的经标记自体lcl与患者ms017(s7)、ms026(s12)、ms028(s11)和ms029(s9)(s，刺激)的p4特异性cd4+细胞系共培养时，特异性lcl凋亡的百分比。
[0113]
图21：从第7天至第28天每天进行的临床eae评分(0至5)的盲法评价。在第0天，向小鼠注射mog
35至55
以诱导eae，并且不用imcy-0189或p4进行处理或用imcy-0189或p4进行治疗性处理(细节参见表2)。每天确定各组小鼠的平均临床评分。
[0114]
图22：由图21中针对各组小鼠所显示的eae评分计算的auc。如下参考显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
[0115]
图23：由图21中针对各组小鼠所显示的eae评分计算的mms。如下参考显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
[0116]
图24：表2中示出的各组小鼠的炎性水平。在各h&e染色切片中对约20个细胞的炎性病灶进行计数。当炎性浸润由多于20个细胞组成时，对存在多少20个细胞的病灶进行估计。如下参考显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
[0117]
图25：表2中示出的各组小鼠的脱髓鞘水平。在各抗mbp(使用免疫组织化学)染色切片中对脱髓鞘进行评分。脱髓鞘评分表示对各切片的脱髓鞘面积的估计。如下参考显著性差异：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0118]
图26：表2中示出的各组小鼠的血清神经丝水平。在quanterix
tm
下通过nf-light测定优势试剂盒对神经丝轻(nf-l)蛋白水平进行定量。如下参考显著性差异：*p《
0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0119]
图27：从第4天至第43天每天进行的临床eae评分(0至5)的盲法评价。用或不用imcy-0189对小鼠进行预防性免疫接种，然后在第0天注射mog
35至55
以诱导eae，并再次用或不用imcy-0189进行免疫接种(细节参见表4)。每天确定各组小鼠的平均临床评分。
[0120]
图28：由图27中针对各组小鼠所显示的eae评分计算的auc。如下参考显著性差异：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0121]
图29：由图27中针对各组小鼠所显示的eae评分计算的mms。如下参考显著性差异：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0122]
图30：表4中示出的各组小鼠的炎性水平。在各h&e染色切片中对约20个细胞的炎性病灶进行计数。当炎性浸润由多于20个细胞组成时，对存在多少20个细胞的病灶进行估计。如下参考显著性差异：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0123]
图31：表4中示出的各组小鼠的脱髓鞘水平。在各抗mbp(使用免疫组织化学)染色切片中对脱髓鞘进行评分。脱髓鞘评分表示对各切片的脱髓鞘面积的估计。如下参考显著性差异：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0124]
图32：表4中示出的各组小鼠的血浆神经丝水平。在quanterix
tm
下通过nf-light测定优势试剂盒对神经丝轻(nf-l)蛋白水平进行定量。如下参考显著性差异：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
具体实施方式
[0125]
将针对具体实施方案来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。权利要求书中的任何附图标记不应被解释为限制范围。仅提供以下术语或定义以帮助理解本发明。除非本文中明确定义，否则本文中使用的所有术语具有与其对于本发明领域的技术人员来说相同的含义。本文中提供的定义的范围不应被解释为小于本领域普通技术人员所理解的范围。
[0126]
除非另外指明，否则对本领域技术人员将明显的是，可以以本身已知的方式进行并且已经进行了未具体详细描述的所有方法、步骤、技术和操作。例如，再次参考标准手册、上面提及的一般背景技术以及其中引用的另一些参考文献。
[0127]
除非上下文另外明确地指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种和更多个/种。当与本文中使用的方面、权利要求或实施方案相关使用时，术语“任何/任意”是指所涉及的所述方面、权利要求或实施方案中任何单个(即任一)以及所有组合。
[0128]
本文中使用的术语“包含/包括”和“由......构成”与“包括/包含”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的，而不排除另外的非记载成员、要素或方法步骤。所述术语还涵盖“基本上由......组成”和“由......组成”的实施方案。
[0129]
通过端点对数值范围的列举包括在相应范围内纳入的所有数字和分数，以及所列举的端点。
[0130]
本文中涉及可测量值例如参数、量、时距(temporal duration)等时使用的术语“约/大约”意在涵盖指定值的或相对于指定值的+/-10％或更小、优选+/-5％或更小、更优选+/-1％或更小、并且还更优选+/-0.1％或更小的变化，在此范围内这样的变化适合于在所公开的发明中实施。应理解，修饰语“约/大约”所指的值本身也被具体地且优选地公开。
[0131]
如本文中所用的，在“用于治疗疾病的组合物”中使用的术语“用于”还应公开相应的治疗方法和相应的制剂用于制备用于治疗疾病的药物的用途。
[0132]
本文中使用的术语“肽”是指包含通过肽键连接的9至200个氨基酸的氨基酸序列但其可包含非氨基酸结构、合成氨基酸或经修饰氨基酸的分子。
[0133]
根据本发明的肽可包含蛋白原性和/或非蛋白原性氨基酸。所述肽可包含任何常规的20种氨基酸或其经修饰形式，或者可包含通过化学肽合成或通过化学或酶修饰而并入的非天然存在的氨基酸。
[0134]
本文中使用的术语“抗原”是指大分子，通常是蛋白质(具有或不具有多糖)的结构，或者由包含一种或更多种半抗原并包含t细胞表位的蛋白质组合物构成的结构。
[0135]
本文中使用的术语“抗原蛋白”是指包含一个或更多个t细胞表位的蛋白质。本文中使用的自身抗原或自身抗原蛋白是指存在于体内的人或动物蛋白，其在同一人或动物体内引发免疫应答。
[0136]
术语“表位”是指抗原蛋白的一个或数个部分(其可定义构象表位)，其被抗体或其部分(fab’，fab2’等)或者在b或t细胞淋巴细胞的细胞表面存在的受体特异性地识别并结合，并且所述b或t细胞淋巴细胞能够通过所述结合诱导免疫应答。
[0137]
在本发明的上下文中，术语“t细胞表位”是指优势(dominant)、亚优势(sub-dominant)或次要(minor)的t细胞表位，即抗原蛋白的一部分，其被在t细胞或nkt细胞的细胞表面处的受体特异性地识别并结合。表位是优势、亚优势还是次要的取决于针对该表位引发的免疫反应。优势性取决于在蛋白质的所有可能的t细胞表位中这样的表位被t细胞或nkt细胞识别并能够活化它们的频率。
[0138]
在本发明的上下文中，t细胞表位可以是由mhc ii类分子识别并呈递至cd4+t细胞的表位，或者可以是由cd1d分子识别并呈递至nkt细胞的表位。
[0139]
由mhc ii类分子识别的表位通常包含以下或由以下组成：适合mhc ii分子的沟(groove)的+/-9个氨基酸的序列。在表示t细胞表位的肽序列中，表位中的氨基酸编号为p1至p9，表位的n端氨基酸编号为p-1、p-2等，表位的c端氨基酸编号为p+1、p+2等。由mhc ii类分子而非mhc i类分子识别的肽被称为mhc ii类限制性t细胞表位。
[0140]
术语“mhc”是指“主要组织相容性抗原(major histocompatibility antigen)”。在人中，mhc基因被称为hla(“人白细胞抗原(human leukocyte antigen)”)基因。尽管没有始终遵循的惯例，但是一些文献使用hla指代hla蛋白分子，并且使用mhc指代编码hla蛋白的基因。因此，当在本文中使用时，术语“mhc”和“hla”是等同物。人中的hla系统在小鼠中具有其等同物，即h2系统。研究最深入的hla基因是九种所谓的经典mhc基因：hla-a、hla-b、hla-c、hla-dpa1、hla-dpb1、hla-dqa1、hla dqb1、hla-dra和hla-drb1。在人中，mhc分为三个区域：i、ii和iii类。a、b和c基因属于mhc i类，而六个d基因属于ii类。mhc i类分子由包含3个结构域(α1、2和3)的单一多态链构成，该链与细胞表面上的β-2-微球蛋白缔合。ii类分子由2种多态链构成，每种链包含2条链(α1和2，以及β1和2)。i类mhc分子在几乎所有的有核细胞上表达。由于hla系统以孟德尔(mendelian)方式遗传，因此可在给定群体的对象中区分hla系列基因或单倍型。
[0141]
一般而言，本公开内容的肽与wo2017182528中所公开的现有技术肽相比，与hla-drb1*03:01、hla-drb1*04:01和hla-drb1*15:01的结合得到改善，并且具有高得多的亲和
力。因此，患有脱髓鞘病症的患者的优选hla类型选自hla-drb1*03:01、hla-drb1*04:01和hla-drb1*15:01。在全球ms患者群体中，约50％至60％具有hla-drb1*类型15:01。此外，ms患者群体中超过75％具有hla-drb1*15:01、hla-drb1*03:01、hla-drb1*04:01或hla-drb1*07:01类型的hla。鉴于本发明，ms患者的优选hla类型因此选自：drb1*15:01、hla-drb1*03:01、hla-drb1*04:01和hla-drb1*07:01。更优选的是具有hla-drb1*类型15:01的ms患者。进一步优选的是具有选自以下的hla类型的经rrms诊断的ms患者：drb1*15:01、hla-drb1*03:01、hla-drb1*04:01和hla-drb1*07:01。进一步优选的是具有hla类型hla-drb1*15:01的经rrms诊断的ms患者。因此，本发明中nmo患者的优选hla单倍型是hla-drb1*03:01和hla-dpb1*05:01，更优选hla-drb1*03:01。在i类mhc分子的背景下呈递的肽片段由cd8+t淋巴细胞(溶细胞性t淋巴细胞或ctl)识别。cd8+t淋巴细胞经常成熟为溶细胞性效应物，其可裂解带有刺激性抗原的细胞。ii类mhc分子主要在活化的淋巴细胞和抗原呈递细胞上表达。cd4+t淋巴细胞(辅助t淋巴细胞或th)通过识别由ii类mhc分子呈递的独特肽片段而活化，该片段通常存在于抗原呈递细胞(例如巨噬细胞或树突细胞)上。cd4+t淋巴细胞增殖并分泌支持抗体介导的和细胞介导的应答的细胞因子，例如il-2、ifn-γ和il-4。
[0142]
功能性hla的特征在于内源性以及外来的、潜在的抗原肽与之结合的深结合沟。该沟的特征还在于明确限定的形状和物理化学特性。hla i类结合位点是封闭的，因为肽末端被固定在沟的末端中。它们还参与具有保守hla残基的氢键网络。考虑到这些限制，结合的肽的长度限制为8、9或10个残基。然而，已表明多至12个氨基酸残基的肽也能够结合hla i类。不同hla复合物结构的比较证实了一般的结合方式，其中肽采用相对线性、延伸的构象或者可涉及中心残基向沟外凸出。
[0143]
与hlai类结合位点相反，ii类位点在两端均开放。这允许肽从实际结合区延伸，从而在两端“悬垂(hanging out)”。因此，ii类hla可结合具有7、8或9个至超过25个氨基酸残基的可变长度的肽配体。与hlai类类似，ii类配体的亲和力由“恒定”和“可变”分量(component)确定。恒定部分同样由hla ii类沟中保守残基与结合肽的主链之间形成的氢键网络产生。然而，该氢键模式不限于肽的n端和c端残基，而是分布在整个链上。后者是重要的，因为它将复合肽的构象限制为严格的线性结合方式。这对于所有ii类同种异型都是常见的。由于ii类结合位点内的某些多态性位置，决定肽结合亲和力的第二分量是可变的。不同的同种异型在沟内形成不同的互补口袋，从而解释了肽的亚型依赖性选择或特异性。重要地，对ii类口袋中保留的氨基酸残基的限制通常比对i类的更“柔和”。在不同的hla ii类同种异型之间，存在多得多的肽交叉反应性。适合于mhc ii分子的沟的mhc ii类t细胞表位的+/-9个氨基酸(即8、9或10)的序列通常编号为p1至p9。另外的表位n端氨基酸编号为p-1、p-2等，表位c端氨基酸编号为p+1、p+2等。
[0144]
由cd1d分子识别的表位是指抗原蛋白的一部分，其由t淋巴细胞，特别是nkt细胞的细胞表面上的受体特异性识别并结合。由cdld分子识别的表位通常包含以下或由以下组成：适合于cdld分子的沟的+/-7个氨基酸的序列。通常，nkt细胞表位是疏水性的。cd1d分子的结构指示需要疏水性氨基酸残基占据位于cd1d槽(cleft)末端的两个疏水性口袋，并且脂肪族残基应占据槽中间的位置。因此，作为cd1d结合序列的一个一般但非限制性实例，可使用基序[fwhy]-xx-[ilmv]-xx-[fwhy](seq id no：147)，其中[fwhy]指示f、w、h或y可占据第一锚定残基(p1)，p4位置可被i、l、m或v占据，并且p7可被f、w、h或y占据。在该通用模型
基序中，“x”代表任意氨基酸。在一个具体实施方案中，通用模型基序可由序列[fvv]-xx-[ilm]-xx-[fvv](seq id no：148)，优选由序列[fw]-xx-[ilm]-xx-[w](seq id no：149)所限定。
[0145]
术语“nkt细胞”是指先天免疫系统的细胞，其特征在于其携带受体例如nk1.1和nkg2d且识别由cd1d分子呈递的表位的事实。在本发明的上下文中，nkt细胞可属于1型(不变的)或2型亚群，或者属于比1型或2型nkt细胞具有更多的多态t细胞受体的较少表征的nkt细胞中的任一者。已经在许多场合报道了nkt细胞参与自身免疫病中的或者针对同种因子(allofactor)或变应原的免疫应答的控制(jahng et al journal of experimental medicine 199：947-957，2004；van belle and von herrath，molecular immunology 47：8-11，2009)，但其相对难以描述。在本发明的上下文中，得出了肽可由cd1d分子呈递的出乎意料的观察结果。cd1d分子的特征是由两条反平行的α链构成，形成位于由两条反平行β链构成的平台的顶部的槽。槽是窄且深的，并且仅接受疏水性残基，典型地仅视为脂质。实际上，具有疏水性残基的肽具有与cd1d槽结合的能力。此外，由于槽在两侧均是开放的，因此可容纳比7个氨基酸更长的肽。在自身抗原、同种因子和变应原中存在携带cd1d基序的疏水肽，从而赋予所述自身抗原、同种因子或变应原活化cd4+nkt细胞的能力。通过杀伤呈递所述自身抗原、同种因子或变应原的细胞进行的直接消除消除了建立针对这些抗原/因子的免疫应答的能力。
[0146]
术语“cd1d分子”是指由3条α链和反平行β链组构成的非mhc来源的分子，所述β链被布置到两侧开放并且能够将脂质、糖脂或疏水肽呈递至nkt细胞的深疏水沟中。术语“免疫病症”或“免疫疾病”是指其中免疫系统的反应负责或维持生物体中功能异常或非生理状况的疾病。
[0147]
关于本发明上下文中使用的表位，本文中使用的术语“同源物”是指这样的分子，其与天然存在表位具有至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸序列同一性，从而维持表位结合抗体或者b和/或t细胞的细胞表面受体的能力。表位的特定同源物对应于在至多三个，更特别地在至多2个，最特别地在一个氨基酸中修饰的天然表位。
[0148]
关于本发明的肽，本文中使用的术语“衍生物”是指这样的分子，其包含至少肽活性部分(即氧化还原基序和能够引发溶细胞性cd4+t细胞活性的mhc ii类表位)并且除此之外还包含可具有不同的目的(例如稳定肽或改变肽的药代动力学或药效学特性)的互补部分。
[0149]
本文中使用的术语两个序列的“序列同一性”涉及当比对当两个序列时，具有相同核苷酸或氨基酸的位置数除以序列中较短者的核苷酸或氨基酸数。特别地，序列同一性为70％至80％、81％至85％、86％至90％、91％至95％、96％至100％、或100％。
[0150]
本文中使用的术语“肽编码多核苷酸(或核酸)”和“编码肽的多核苷酸(或核酸)”是指这样的核苷酸序列，其在适当的环境中表达时导致相关肽序列或其衍生物或同源物的产生。这样的多核苷酸或核酸包括编码该肽的正常序列，以及能够表达具有所需活性的肽的这些核酸的衍生物和片段。编码根据本发明的肽或其片段的核酸是编码源自于哺乳动物或对应于哺乳动物的肽或其片段(最特别是人肽片段)的序列。这样的多核苷酸或核酸分子可使用自动合成仪和遗传密码的公知密码子-氨基酸关系来容易地制备。可将这样的多核
苷酸或核酸并入到表达载体(包括质粒)中，所述表达载体适合于在合适的宿主中表达多核苷酸或核酸并产生多肽，所述合适的宿主例如细菌(例如大肠杆菌(escherichia coli))、酵母细胞、人细胞、动物细胞或植物细胞。对于治疗手段，编码本文中所公开的免疫原性肽的多核苷酸可以是表达系统、盒、质粒或载体系统(例如病毒和非病毒表达系统)的一部分。已知用于治疗目的的病毒载体是腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)、慢病毒和逆转录病毒。也可使用非病毒载体并且一些非限制性实例包括：基于转座子的载体系统，例如来源于sleeping beauty(sb)或piggybac(pb)的那些。核酸也可通过其他载体(例如但不限于纳米粒、阳离子脂质、脂质体等)递送。
[0151]
术语“免疫病症”或“免疫疾病”是指其中免疫系统的反应负责或维持生物体中功能异常或非生理状况的疾病。免疫病症中尤其包括变应性病症和自身免疫病。
[0152]
术语“自身免疫病”或“自身免疫病症”是指由于生物体无法将其自身组成部分(下至亚分子水平)识别为“自身”而引起生物体针对其自身细胞和组织的异常免疫应答所导致的疾病。疾病组可分为两类：器官特异性疾病和全身性疾病。“变应原”被定义为在易患(特别是遗传倾向的)个体(特应性)患者中引发ige抗体的产生的物质，通常为大分子或蛋白质组合物。在liebers et al.(1996)clin.exp.allergy 26,494-516中也提出了类似的定义。
[0153]
本文中所使用的术语“脱髓鞘”是指包围神经元轴突的髓鞘的损伤和/或退化，其结果为形成病变或斑块。应当理解，髓鞘在脑、视神经和脊髓中充当包围神经纤维的保护层。由于脱髓鞘，沿着受影响神经的信号传导受损(即减慢或停止)，并且可引起神经症状，例如感觉、运动、认知和/或其他神经功能的缺陷。患有脱髓鞘疾病的患者的具体症状将根据疾病和疾病进展状态而变化。这些可包括：视力模糊和/或视歧(double vision)、共济失调、阵挛、构音障碍、疲劳、笨拙、手麻痹、轻偏瘫、生殖器麻醉、动作失调、感觉异常、眼麻痹、肌协调受损、肌无力、感觉丧失、视力受损、神经症状、行走方式不稳定(步态)、痉挛性轻截瘫(spastic paraparesis)、失禁、听力问题、言语问题等。
[0154]
因此，本文中使用的且在本领域通常使用的“脱髓鞘疾病”或“脱髓鞘病症”表示涉及损害(例如损伤)的神经系统或神经元的髓鞘的任何病理状况。脱髓鞘疾病可分为中枢神经系统脱髓鞘疾病和周围神经系统。作为替代地，脱髓鞘疾病可根据脱髓鞘的原因进行分类：髓鞘的损坏(脱髓鞘性髓鞘脱失(demyelinating myelinoclastic))，或异常和退化性髓鞘(脱髓鞘性脑白质营养不良(dysmyelinating leukodystrophic))。脱髓鞘疾病的一些非限制性实例是：多发性硬化(ms)-(例如，复发/缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、进展复发型多发性硬化、原发进展型多发性硬化和急性暴发性多发性硬化)、视神经脊髓炎(nmo)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、巴洛病、htlv-i相关脊髓病、希尔德病、横贯性脊髓炎、特发性炎性脱髓鞘病、维生素b12诱导的中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、包括脊髓痨的脊髓病、脑白质营养不良例如肾上腺脑白质营养不良、白质脑病例如进行性多灶性白质脑病(pml)和风疹诱导的智力低下。技术人员理解的是，上述注释中的数种是表示疾病组的通用分类名称，所述疾病的特征在于在分子水平上的相同或类似的异常过程组和/或者相同或类似的(临床)症状组。患有脱髓鞘病症的人患者可具有脱髓鞘病症的一种或更多种症状，例如但不限于视力受损、麻木、四肢无力、震颤或痉挛、热不耐受、言语障碍、失禁、头晕或本体感觉(例如，平衡、协调、肢体位置感觉)受损。出于该方法的目的，具有脱髓鞘病症家族史(例如，脱髓鞘病症的遗传倾向)或者表现出上述脱髓鞘病症的轻度或罕见
症状的人(例如，人患者)，可被认为处于发生脱髓鞘病症(例如，多发性硬化)的风险中。在本公开内容的上下文中，优选的脱髓鞘疾病是由mog自身抗原引起的或涉及抗mog抗体的那些，其包括但不限于多发性硬化(ms)或视神经脊髓炎(nmo)。
[0155]
术语“多发性硬化”，在本文中和本领域中缩写为“ms”，表示影响中枢神经系统的自身免疫病症。ms被认为是年轻成人中最常见的非创伤性致残疾病(dobson and giovannoni,(2019)eur.j.neurol.26(1),27-40)，以及影响中枢神经系统的最常见的自身免疫病症(berer and krishnamoorthy(2014)febs lett.588(22),4207-4213)。在本领域中，ms被认为是中枢神经系统的脱髓鞘病症(lubetzki and stankoff.(2014).handb clin neurol.122,89-99)。ms可通过从身体到心理至精神问题范围的大量不同症状而在对象中表现其自身。典型的症状包括视力模糊或视歧、肌无力、一只眼失明、以及协调和感觉困难。在大多数情况下，ms可被视为两个阶段的疾病，其中早期炎症是复发缓解型疾病的原因并且延迟的神经退行性变导致非复发性进展，即继发和原发进展型ms。尽管在该领域中取得了进展，但疾病的决定性基本原因迄今仍难以理解，并且超过150个单核苷酸多态性已与ms易感性相关(international multiple sclerosis genetics consortium nat genet.(2013).45(11):1353-60)。已报道了维生素d缺乏、吸烟、紫外线b(uvb)暴露、儿童肥胖和通过eb病毒的感染都有助于疾病的发生(ascherio(2013)expert rev neurother.13(12增刊),3-9)。
[0156]
因此，ms可被认为是存在于从复发型(其中炎症是优势特征)延伸至进展型(神经退行性变优势)的范围内的单一疾病。因此，明显的是本文中使用的术语多发性硬化涵盖属于任何类型的疾病病程分类的任何类型的多发性硬化。特别地，本发明被设想为针对被诊断患有或怀疑患有临床孤立综合征(cis)、复发缓解型ms(rrms)、继发进展型ms(spms)、原发进展型ms(ppms)、急性暴发性多发性硬化以及甚至疑似ms的放射学孤立综合征(ris)的患者的有效治疗策略。虽然不严格考虑ms的疾病病程，但ris用于对在对应于ms病变并且不能通过其他诊断初步解释的脑和/或脊髓的磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)上显示异常的对象进行分类。cis是由中枢神经系统中的炎症和脱髓鞘引起的神经症状的首次发作(根据定义，持续超过24小时)。根据ris、cis分类的对象可能继续发生ms或可能不继续发生ms，其中在脑mri上显示ms样病变的对象更可能发生ms。rrms是ms的最常见的疾病病程，其中患有ms的对象中85％被诊断患有rrms。鉴于本发明，经rrms诊断的患者是优选的患者组。rrms的特征在于新的或提高的神经症状的攻击，或者是复发或恶化。在rrms中，所述复发之后是症状的周期或者部分或完全缓解，并且在这些缓解期内没有经历和/或观察到疾病进展。rrms可进一步分类为活性rrms(复发和/或新mri活动的证据)、非活性rrms、恶化的rrms(在复发之后在特定时间段内残疾提高)或未恶化的rrms。一部分经rrms诊断的对象将进展为spms疾病病程，其特征在于神经功能随时间的进展型恶化，即残疾的累积。可对spms进行亚分类，例如活性(复发和/或新的mri活性)、非活性、进展型(疾病随时间恶化)或非进展型spms。最后，ppms是ms疾病病程，其特征在于神经功能恶化以及因此从症状发作开始的残疾累积，无早期复发或缓解。可形成另一些ppms亚组，例如活性ppms(偶尔复发和/或新的mri活性)、非活性ppms、进展型ppms(疾病随时间恶化的证据，无论新的mri活性如何)和非进展型ppms。一般而言，ms疾病病程的特征在于就复发和缓解期而言，在严重程度(在复发的情况下)和持续时间二者上有基本的对象间可变性。
[0157]
数种疾病改善治疗可用于ms，并因此本发明可作为替代治疗策略使用，或与这些现有治疗组合使用。活性药物成分的一些非限制性实例包括：富马酸酯化合物、干扰素β-1a、干扰素β-1b、乙酸格拉替雷(glatiramer acetate)、乙酸格拉替雷、聚乙二醇干扰素β-1a、特立氟胺(teriflunomide)、芬戈莫德(fingolimod)、克拉屈滨(cladribine)、西尼莫德(siponimod)、奥扎莫德(ozanimod)、阿仑单抗(alemtuzumab)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥美珠单抗(ocrelizumab)和那他珠单抗(natalizumab)。富马酸酯化合物的一些实例是：富马酸单甲酯(mmf)，富马酸二甲酯(dmf)，可在体内代谢成mmf的化合物，富马酸单甲酯前药例如富马酸地洛西美酯或tepilamide fumarate，或者其任何一种或更多种的组合，或者其任何一种或更多种的氘化形式、包合物、溶剂合物、互变异构体、立体异构体或可药用盐，或者前述中任一种的组合。作为替代地，本发明可与旨在复发管理的治疗或药物，例如但不限于甲基泼尼松龙、强的松和促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，acth)组合使用。此外，本发明可与旨在减轻特定症状的治疗组合使用。一些非限制性实例包括旨在改善或避免选自以下的症状的药物：膀胱问题、肠功能障碍、抑郁、头晕、眩晕、情绪变化、疲劳、瘙痒、疼痛、性问题、痉挛、震颤和行走困难。
[0158]
ms的特征在于三个交织的标志性特征：1)中枢神经系统中的病变形成，2)炎症，以及3)神经元髓鞘的退化。尽管传统上被认为是中枢神经系统和白质的脱髓鞘疾病，但最近报道表明皮质和深层灰质的脱髓鞘可超过白质脱髓鞘(kutzelnigg et al.(2005).brain.128(11),2705-2712)。已假定关于如何在分子水平上引起ms的两个主要假设。通常可接受的“由外向内假说(outside-in hypothesis)”是基于外周自体反应性效应物cd4+t细胞的活化，该cd4+t细胞迁移到中枢神经系统并启动疾病病程。一旦在中枢神经系统中，所述t细胞通过apc局部再活化并募集另外的t细胞和巨噬细胞以建立炎性病变。值得注意的是，已显示ms病变包含主要存在于病变边缘处的cd8+t细胞以及存在于病变更中心的cd4+t细胞。认为这些细胞引起了脱髓鞘、少突胶质细胞破坏和轴突损伤，导致神经功能障碍。另外，触发免疫调节网络以限制炎症并启动修复，这导致通过临床缓解反映的至少部分髓鞘再生。然而，在没有足够的治疗的情况下，进一步的攻击通常导致疾病的进展。
[0159]
认为ms的发作远在检测到第一临床症状之前就开始了，如由患者的mri上明显的较老和不活跃病变的典型出现所证明的。由于在诊断方法的发展中的进步，现可检测到ms，甚至在疾病的临床表现之前(即症状前ms)也是如此。在本发明的上下文中，“ms的治疗”和类似的表达设想了针对有症状ms和症状前ms二者的治疗和治疗策略。特别地，当免疫原性肽和/或所产生的溶细胞性cd4+t细胞可用于治疗症状前ms患者时，疾病在可部分或甚至完全避免临床表现的这样的早期阶段停止。
[0160]
术语“视神经脊髓炎”或“nmo”和“nmo谱系障碍(nmo spectrum disorder，nmosd)”也称为“德维克氏病(devic’s disease)”，是指其中白细胞和抗体主要攻击视神经和脊髓但也可攻击脑的自身免疫病症(在wingerchuk 2006，int ms j.2006may；13(2)：42-50中进行了综述)。视神经的损伤产生引起疼痛和视力丧失的肿胀和炎症；脊髓的损伤引起腿或臂的无力或瘫痪、感觉丧失、以及膀胱和肠功能的问题。nmo是复发缓解型疾病。在复发期间，视神经和/或脊髓的新的损伤可导致累积性残疾。与ms不同，没有该疾病的进展期。因此，预防攻击对于良好的长期结局至关重要。在与抗mog抗体相关的情况下，认为抗mog抗体可触发对髓鞘的攻击，引起脱髓鞘。在大多数情况下，nmo的原因是由于对自身抗原的特异性攻
击。至多三分之一的对象可对针对称为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)的髓鞘组分的自身抗体呈阳性。患有抗mog相关nmo的患者类似地具有横贯性脊髓炎和视神经炎的发作。
[0161]
术语“治疗有效量”是指在患者中产生期望的治疗或预防作用的本发明的肽或其衍生物的量。例如，关于疾病或病症，其是在一定程度上降低该疾病或病症的一种或更多种症状的量，并且更特别地是使与该疾病或病症相关或引起该疾病或病症的生理或生化参数部分或完全地恢复正常的量。通常来说，治疗有效量是将导致正常生理状况的改善或恢复的本发明的肽或其衍生物的量。例如，当用于治疗性治疗受免疫病症影响的哺乳动物时，其为每日量肽/所述哺乳动物的kg体重。或者，在通过基因治疗施用的情况下，调节裸dna或病毒载体的量以确保局部产生本发明的肽、其衍生物或同源物的相关剂量。
[0162]
当涉及肽时，术语“天然”涉及以下事实：序列与天然存在蛋白质(野生型或突变型)的片段相同。与此相反，术语“人工”是指其本身在自然界中不存在的序列。人工序列通过有限的修饰，例如在天然存在序列内改变/缺失/插入一个或更多个氨基酸或者通过添加/去除天然存在序列的n端或c端氨基酸而从天然序列获得。
[0163]
术语“氧化还原酶基序”、“巯基-氧化还原酶基序”、“硫还原酶基序”、“硫氧化还原基序”或“氧化还原基序”在此作为同义术语使用，并且是指通用序列硫还原酶序列基序c-x
n-[cst]-(seq id no：91至95)或[cst]-x
n-c-(seq id no：66至70)的基序，其中n是0至6的整数。这样的肽基序通过以下保守活性结构域共有序列内的氧化还原活性半胱氨酸对蛋白质(例如酶)上的二硫键发挥还原活性：c-x
n-[cst]-或[cst]-xx-c-，例如如在c-xx-c(seq id no：116)，c-xx-s(seq id no：150)，c-xx-t(seq id no：151)，s-xx-c(seq id no：152)，t-xx-c(seq id no：153)中的(fomenko et al.(2003)biochemistry 42，11214-11225)，其中“x”代表任意氨基酸，其中c代表半胱氨酸，s代表丝氨酸，t代表苏氨酸，以及x代表除酪氨酸，苯丙氨酸或色氨酸以外的任意氨基酸。
[0164]
当根据本文中所公开的氧化还原酶基序中存在的氨基酸残基使用时，术语“半胱氨酸”(“c”)、“丝氨酸”(“s”)和“苏氨酸”(“t”)分别是指天然存在的半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸氨基酸。除非明确不同地说明，否则所述术语因此不包括经化学修饰的半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸，例如经修饰以在基序的氨基酸残基的n端酰胺上或在c端羧基上携带乙酰基、甲基、乙基或丙酰基的那些。
[0165]
在其另一个实施方案中，所述氧化还原酶基序位于t细胞表位的n端。
[0166]
作为替代地，免疫原性肽可包含以下通用氨基酸式形式的氧化还原酶基序：z
m-[cst]-x
n-c-(seq id no：66至90)或z
m-c-x
n-[cst]-(seq id no：91至115)，
[0167]
其中n是选自0至6的整数，其中m是选自0至3的整数，其中x是任意氨基酸，其中z是任意氨基酸，其中c代表半胱氨酸，s代表丝氨酸，t代表苏氨酸。
[0168]
优选地，所述氧化还原酶基序不是标准c-xx-[cst]或[cst]-xx-c氧化还原酶基序的重复序列的一部分，例如可通过一个或更多个氨基酸彼此间隔的所述基序的重复序列(例如，cxxc x cxxc x cxxc(seq id no：249))、如彼此相邻的重复序列(cxxccxxccxxc(seq id no：250)或者如彼此重叠的重复序列cxxcxxcxxc(seq id no：251)或cxccxccxcc(seq id no：252))，尤其当n是0或1并且m是0时。
[0169]
因此，由此设想的是形式z
m-[cst]-c-或z
m-c-[cst]-的基序，其中m是选自0至3的整数，其中z是任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和如本文中所限定的非天然
碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。优选的是其中m是1或2并且z是选自以下的碱性氨基酸的基序：h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。这样的基序的一些非限制性优选实例是：
[0170]
kcc，kkcc(seq id no：31)，rcc，rrcc(seq id no：32)，rkcc(seq id no：33)，或krcc(seq id no：34)。
[0171]
还设想的是形式z
m-[cst]-x-c-或z
m-c-x-[cst]-的基序，其中x是任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或r，其中m是选自0至3的整数，其中z是任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。优选的是其中m是1或2并且z是选自以下的碱性氨基酸的基序：h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。这样的基序的一些非限制性优选实例是：
[0172]
kcxc，kkcxc，rcxc，rrcxc，rkcxc，krcxc，kckc，kkckc，kcrc，kkcrc，rcrc，rrcrc，rkckc，krckc(对应于seq id no：35至48)，或rckc(seq id no：240)。
[0173]
还设想的是形式z
m-[cst]-xx-c-或z
m-c-xx-[cst]-的基序。在这些基序中，内部x1x2氨基酸偶联物位于氧化还原酶基序内，其中m是选自0至3的整数，其中z是任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和如本文中所限定非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。优选的是其中m是1或2并且z是选自以下的碱性氨基酸的基序：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。x1和x2各自独立地可以是选自以下的任意氨基酸：g、a、v、l、i、m、f、w、p、s、t、c、y、n、q、d、e、k、r和h，或者非天然氨基酸。优选地，所述基序中的x1和x2是除c、s或t之外的任意氨基酸。在另一个实例中，所述基序中的x1或x2中的至少一者是选自以下的碱性氨基酸：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸。在基序的另一个实例中，所述基序中的x1或x2中的至少一者是p或y。氧化还原酶基序内的内部x1x2氨基酸偶联物的一些特定非限制性实例是：py，hy，ky，ry，ph，pk，pr，hg，kg，rg，hh，hk，hr，gp，hp，kp，rp，gh，gk，gr，gh，kh，和rh。这种形式的特别优选的基序是hcpyc，khcpyc，kcpyc，rcpyc，hcghc，kcghc，和rcghc(对应于seq id no：49至55)。这种形式的替代优选基序是kkcpyc，krcpyc，khcghc，kkcghc，和krcghc(seq id no：210至214)。
[0174]
还设想的是形式z
m-[cst]-xxx-c-或z
m-c-xxx-[cst]-的基序，从而在氧化还原酶基序内产生内部x1x2x3氨基酸段，其中m是选自0至3的整数，其中z是任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。优选的是其中m是1或2并且z是选自以下的碱性氨基酸的基序：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。在某些实例中，x1、x2和x3各自独立地可以是选自以下的任意氨基酸：g、a、v、l、i、m、f、w、p、s、t、c、y、n、q、d、e、k、r和h，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中x1、x2和x3是除c、s或t之外的任意氨基酸。在一个具体实施方案中，所述基序中的x1、x2或x3中的至少一者是选自以下的碱性氨基酸：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸。氧化还原酶基序内的内部x1x2x3氨基酸段的一些特定实例是：xpy、pxy和pyx，其中x可以是任意氨基酸，优选碱性氨基酸例如k、r或h或非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸。一些非限制性实例包括：kpy，rpy，
[0175]
hpy，gpy，apy，vpy，lpy，ipy，mpy，fpy，wpy，ppy，spy，tpy，cpy，ypy，npy，qpy，dpy，epy，kpy，pky，pry，phy，pgy，pay，pvy，ply，piy，pmy，pfy，pwy，ppy，psy，pty，pcy，pyy，pny，
pqy，pdy，pey，ply，pyk，pyr，pyh，pyg，pya，pyv，pyl，pyi，pym，pyf，pyw，pyp，pys，pyt，pyc，pyy，pyn，pyq，pyd，或pye。
[0176]
氧化还原酶基序内的内部x1x2x3氨基酸段的一些替代实例是xhg、hxg和hgx，其中x可以是任意氨基酸，例如：
[0177]
khg，rhg，hhg，ghg，ahg，vhg，lhg，ihg，mhg，fhg，whg，phg，shg，thg，chg，yhg，nhg，qhg，dhg，ehg，和khg，hkg，hrg，hhg，hgg，hag，hvg，hlg，hig，hmg，hfg，hwg，hpg，hsg，htg，hcg，hyg，hng，hqg，hdg，heg，hlg，hgk，hgr，hgh，hgg，hga，hgv，hgl，hgi，hgm，hgf，hgw，hgp，hgs，hgt，hgc，hgy，hgn，hgq，hgd，或hge。
[0178]
氧化还原酶基序内的内部x1x2x3氨基酸段的又一些替代实例是xgp、gxp和gpx，其中x可以是任意氨基酸，例如：kgp，rgp，hgp，ggp，agp，vgp，lgp，igp，mgp，fgp，wgp，pgp，sgp，tgp，cgp，ygp，ngp，qgp，dgp，egp，kgp，gkp，grp，ghp，ggp，gap，gvp，glp，gip，gmp，gfp，gwp，gpp，gsp，gtp，gcp，gyp，gnp，gqp，gdp，gep，glp，gpk，gpr，gph，gpg，gpa，gpv，gpl，gpi，gpm，gpf，gpw，gpp，gps，gpt，gpc，gpy，gpn，gpq，gpd，或gpe。
[0179]
氧化还原酶基序内的内部x1x2x3氨基酸段的又一些替代实例是xgh、gxh和ghx，其中x可以是任意氨基酸，例如：
[0180]
kgh，rgh，hgh，ggh，agh，vgh，lgh，igh，mgh，fgh，wgh，pgh，sgh，tgh，cgh，ygh，ngh，qgh，dgh，egh，kgh，gkh，grh，ghh，ggh，gah，gvh，glh，gih，gmh，gfh，gwh，gph，gsh，gth，gch，gyh，gnh，gqh，gdh，geh，glh，ghk，ghr，ghh，ghg，gha，ghv，ghl，ghi，ghm，ghf，ghw，ghp，ghs，ght，ghc，ghy，ghn，ghq，ghd，或ghe。
[0181]
氧化还原酶基序内的内部x1x2x3氨基酸段的又一些替代实例是xgf、gxf和gfx，其中x可以是任意氨基酸，例如：kgf，rgf，hgf，ggf，agf，vgf，lgf，igf，mgf，fgf，vvgf，pgf，sgf，tgf，cgf，ygf，ngf，qgf，dgf，egf，和kgf，gkf，grf，ghf，ggf，gaf，gvf，glf，gif，gmf，gff，gwf，gpf，gsf，gtf，gcf，gyf，gnf，gqf，gdf，gef，glf，gfk，gfr，gfh，gfg，gfa，gfv，gfl，gfi，gfm，gff，gfw，gfp，gfs，gft，gfc，gfy，gfn，gfq，gfd，或gfe。
[0182]
氧化还原酶基序内的内部x1x2x3氨基酸段的又一些替代实例是xrl、rxl和rlx，其中x可以是任意氨基酸，例如：
[0183]
krl，rrl，hrl，grl，arl，vrl，lrl，irl，mrl，frl，wrl，prl，srl，trl，crl，yrl，nrl，qrlrl，drl，erl，krl，gkf，grf，ghf，ggf，gaf，gvf，glf，gif，gmf，gff，gwf，gpf，gsf，gtf，gcf，gyf，gnf，gqf，gdf，gef，和glf，rlk，rlr，rlh，rlg，rla，rlv，rll，rli，rlm，rlf，rlw，rlp，rls，rlt，rlc，rly，rln，rlq，rld，或rle。
[0184]
氧化还原酶基序内的内部x1x2x3氨基酸段的又一些替代实例是xhp、hxp和hpx，其中x可以是任意氨基酸，例如：
[0185]
khp，rhp，hhp，ghp，ahp，vhp，lhp，ihp，mhp，fhp，whp，php，shp，thp，chp，yhp，nhp，qhp，dhp，ehp，khp，hkp，hrp，hhp，hgp，haf，hvf，hlf，hif，hmf，hff，hwf，hpf，hsf，htf，hcf，hyp，hnf，hqf，hdf，hef，hlp，hpk，hpr，hph，hpg，hpa，hpv，hpl，hpi，hpm，hpf，hpw，hpp，hps，hpt，hpc，hpy，hpn，hpq，hpd，或hpe。
[0186]
一些特别优选的实例是：crpyc，kcrpyc，khcrpyc，rcrpyc，hcrpyc，cpryc，kcpryc，rcpryc，hcpryc，cpyrc，kcpyrc，rcpyrc，hcpyrc，ckpyc，kckpyc，rckpyc，hckpyc，cpkyc，kcpkyc，rcpkyc，hcpkyc，cpykc，kcpykc，rcpykc，和hcpykc
[0187]
(对应于seq id no：215至239)。
[0188]
还设想的是形式z
m-[cst]-xxxx-c-或z
m-c-xxxx-[cst]-的基序，从而在氧化还原酶基序内产生内部x1x2x3x4(seq id no：154)氨基酸段，其中m是选自0至3的整数，其中z是任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。优选的是其中m是1或2并且z是选自以下的碱性氨基酸的基序：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。x1、x2、x3和x4各自独立地可以是选自以下的任意氨基酸：g、a、v、l、i、m、f、w、p、s、t、c、y、n、q、d、e、k、r和h，或如本文中所限定的非天然氨基酸。优选地，所述基序中的x1、x2、x3和x4是除c、s或t之外的任意氨基酸。在某些非限制性实例中，所述基序中的x1、x2、x3或x4中的至少一者是选自以下的碱性氨基酸：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。一些特定实例包括lavl(seq id no：56)、tvqa(seq id no：57)或gavh(seq id no：58)及其变体，例如：x1avl、lx2vl、lax3l或lavx4；x1vqa、tx2qa、tvx3a或tvqx4；x1avh、gx2vh、gax3h或gavx4(对应于seq id no：155至165)；其中x1、x2、x3和x4各自独立地可以是选自以下的任意氨基酸：g、a、v、l、i、m、f、w、p、s、t、c、y、n、q、d、e、k、r和h，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
[0189]
还设想的是形式z
m-[cst]-xxxxx-c-或z
m-c-xxxxx-[cst]-的基序，从而在氧化还原酶基序内产生内部x1x2x3x4x5(seq id no：166)氨基酸段，其中m是选自0至3的整数，其中z是任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。优选的是其中m是1或2并且z是选自以下的碱性氨基酸的基序：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。x1、x2、x3、x4和x5各自独立地可以是选自以下的任意氨基酸：g、a、v、l、i、m、f、w、p、s、t、c、y、n、q、d、e、k、r和h，或非天然氨基。优选地，所述基序中的x1、x2、x3、x4和x5是除c、s或t之外的任意氨基酸。在某些实例中，所述基序中的x1、x2、x3、x4或x5中的至少一者是选自以下的碱性氨基酸：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。一些特定实例包括pafpl(seq id no：59)或dqgge(seq id no：60)及其变体，例如：x1afpl、px2fpl、pax3pl、pafx4l或pafpx5；x1qgge、dx2gge、dqx3ge、dqgx4e或dqggx5(对应于seq id no：167至176)，其中x1、x2、x3、x4和x5各自独立地可以是选自以下的任意氨基酸：g、a、v、l、i、m、f、w、p、s、t、c、y、n、q、d、e、k、r和h，或如本文中所限定的非天然氨基酸。
[0190]
还设想的是如方面1中所限定的形式z
m-[cst]-xxxxxx-c-或z
m-c-xxxxxx-[cst]-的基序，其中n是6，从而在氧化还原酶基序内产生内部x1x2x3x4x5x6(seq id no：177)氨基酸段，其中m是选自0至3的整数，其中z是任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：h、k、r和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。优选的是其中m是1或2并且z是选自以下的碱性氨基酸的基序：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸，优选k或h。x1、x2、x3、x4、x5和x6各自独立地可以是选自以下的任意氨基酸：g、a、v、l、i、m、f、w、p、s、t、c、y、n、q、d、e、k、r和h，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的x1、x2、x3、x4、x5和x6是除c、s或t之外的任意氨基酸。在某些实例中，所述基序中的x1、x2、x3、x4、x5或x6中的至少一者是选自以下的碱性氨基酸：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。一些特定实例包括diadky(seq id no：61)或其变体，例如：x1iadky、dx2adky、dix3dky、diax4ky、diadx5y或diadkx6(对应于seq id no：178至183)，其中x1、x2、x3、x4、x5和x6各自独立地可以是选自以下的任意氨基酸：g、a、v、l、i、m、f、w、p、s、t、c、y、n、q、d、e、k、r和h，或如本文中所
限定的非天然碱性氨基酸。
[0191]
还设想的是形式z
m-[cst]-x
n-c-或z
m-c-x
n-[cst]-的基序，其中n是0至6并且其中m是0(即[cst]-x
n-c-或c-x
n-[cst]-)，并且其中c或[cst]残基之一已被修饰以在基序的氨基酸残基的n端酰胺上或在c端羧基上携带乙酰基、甲基、乙基或丙酰基。在这样的基序的一些优选实施方案中，n是2并且m是0，其中内部x1x2各自独立地可以是选自以下的任意氨基酸：g、a、v、l、i、m、f、w、p、s、t、c、y、n、q、d、e、k、r和h，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的x1和x2是除c、s或t之外的任意氨基酸。在另一个实例中，所述基序中的x1或x2中的至少一者是选自以下的碱性氨基酸：h、k或r或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸例如l-鸟氨酸。在基序的另一个实例中，所述基序中的x1或x2中的至少一者是p或y。氧化还原酶基序内的内部x1x2氨基酸偶联物的一些特定非限制性实例是：py，hy，ky，ry，ph，pk，pr，hg，kg，rg，hh，hk，hr，gp，hp，kp，rp，gh，gk，gr，gh，kh，和rh。优选地，所述修饰导致基序中第一半胱氨酸的n端乙酰化(n-乙酰基-半胱氨酸)。
[0192]
上述免疫原性肽中的氧化还原基序紧邻于免疫原性肽内的t细胞表位序列放置，或者通过接头与t细胞表位隔开。更特别地，接头包含7个氨基酸或更少的氨基酸序列。最特别地，接头包含1、2、3或4、5、6或7个氨基酸。所述接头可涵盖侧接天然mog氨基酸序列中的表位的氨基酸，或者可与这些氨基酸不同。
[0193]
另外，免疫原性肽可在表位序列之后具有侧翼序列(“侧翼”)。所述侧翼可涵盖侧接天然mog氨基酸序列中的表位的氨基酸(例如tlf)，或者可与这些氨基酸不同。本发明中优选的侧翼是tlf、tlfk(seq id no：264)和tlfkk(seq id no：263)。
[0194]
接头和/或侧翼序列的序列可对作为整体的免疫原性肽的免疫原性具有影响。
[0195]
术语髓鞘少突胶质细胞糖蛋白是指由mog基因编码的人蛋白质。本文中使用的术语mog(蛋白质)或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白由对应于ncbi基因4340和uniprotkb标识符q16653(mog_human)的氨基酸序列(seq id no：62)所限定：
[0196]
maslsrpslpsclcsfllllllqvsssyagqfrvigprhpiralvgdevelpcrispgknatgmevgwyrppfsrvvhlyrngkdqdgdqapeyrgrtellkdaigegkvtlrirnvrfsdeggftcffrdhsyqeeaamelkvedpfywvspgvlvllavlpvlllqitvgliflclqyrlrgklraeienlhrtfdphflrvpcwkitlfvivpvlgplvaliicynwlhrrlagqfleelrnpf
[0197]
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白是在少突胶质细胞细胞表面和髓鞘最外层表面上表达的膜蛋白，并且是参与免疫介导的脱髓鞘的主要靶抗原。这种蛋白质可参与髓鞘的完成和维持以及细胞间通讯。已经鉴定了编码不同同种型的选择性剪接转录变体。因此，设想并入本发明的免疫原性肽中的mog表位可以是存在于典型mog氨基酸序列(seq id no：62)和/或一种或更多种mog蛋白同种型中的表位。在本发明的上下文中，合适的mog表位是包含flrvpcwki(seq id no：1)或由flrvpcwki(seq id no：1)组成的mog表位。人和小鼠mog蛋白的seq id no：1部分的特征在于100％序列同一性。作为替代地，可在人和小鼠mog蛋白二者中检索到seq id no：1。作为替代地，可将点突变引入mog表位seq id no：1中以形成氨基酸序列flrvpswki(seq id no：2)，其是本发明的上下文中的优选mog表位。flrvpcwki(seq id no：1)和flrvpswki(seq id no：2)t细胞表位是长度为9个氨基酸的mhc ii类表位，其也分别包含7个氨基酸长的nkt细胞表位flrvpcw(seq id no：63)和flrvpsw(seq id no：64)。
[0198]
在本文中，氨基酸以其全称、其三字母缩写或其单字母缩写来提及。
[0199]
氨基酸序列的基序在本文中根据prosite的格式书写。基序用于描述在序列的特定部分处的某个序列变化。符号x用于其中接受任意氨基酸的位置。通过在方括号(“[]”)之间列出给定位置的可接受氨基酸来指明替代项。例如：[cst]代表选自cys、ser或thr的氨基酸。被排除作为替代项的氨基酸通过在波形括号(“{}”)之间将它们列出来指明。例如：{am}代表除ala和met之外的任意氨基酸。基序中的不同要素任选地由连字符(-)彼此隔开。在本说明书所公开的基序的上下文中，所公开的通用氧化还原酶基序通常伴有连字符而不与基序外的不同要素形成连接。这些“开放的”连字符指示基序与免疫原性肽的另一部分例如接头序列或表位序列的物理连接的位置。例如，形式“z
m-c-xx-[cst]
‑”
的基序指示[cst]是与免疫原性肽的其它部分连接的氨基酸，并且z是免疫原性肽的末端氨基酸。优选的物理连接是肽键。基序内相同要素的重复可通过在该要素后放置圆括号之间的数值或数值范围来指明。例如在该方面中，“x
n”指的是n个“x”。x(2)对应于x-x或xx；x(2，5)对应于2、3、4或5个x氨基酸，a(3)对应于a-a-a或aaa。为了区分氨基酸，氧化还原酶基序之外的那些可被称为外部氨基酸，氧化还原基序内的那些被称为内部氨基酸。除非另有说明，x表示任意氨基酸，特别是l-氨基酸，更特别是20种天然存在的l-氨基酸中的一种。
[0200]
具有还原活性的包含mog的t细胞表位和经修饰的肽基序序列的本文中所公开的任一种肽能够产生针对抗原呈递细胞的抗原特异性溶细胞性cd4+t细胞或nkt细胞的群体。
[0201]
因此，在其最广泛的意义上，本发明涉及包含具有触发免疫反应的潜力的mog的至少一种t细胞表位以及对肽二硫键具有还原活性的经修饰氧化还原酶序列基序的肽。t细胞表位和经修饰氧化还原酶基序序列可在肽中彼此紧邻或任选地被一个或更多个氨基酸(所谓的接头序列)隔开。
[0202]
任选地，该肽另外地包含内体靶向序列和/或另外的“侧翼”序列。
[0203]
本发明的肽包含具有触发免疫反应潜力的mog的mhc ii类t细胞表位或nkt细胞表位、以及经修饰氧化还原酶基序。肽中基序序列的还原活性可针对例如在胰岛素溶解度测定(其中胰岛素的溶解度在还原之后改变)中其还原巯基的能力来测定，或者用经荧光标记的底物(例如胰岛素)来测定。这样的测定的一个实例使用荧光肽，并在tomazzolli et al.(2006)anal.biochem.350,105
–
112中描述。当带有fitc标记的两个肽通过二硫桥彼此共价连接时，它们会自猝灭。在被根据本发明的肽还原之后，被还原的单独肽再次变为具有荧光。
[0204]
经修饰氧化还原酶基序可位于t细胞表位的氨基末端侧或t细胞表位的羧基末端处。
[0205]
如进一步详细说明的，本发明的肽可通过化学合成来制备，其允许并入非天然氨基酸。因此，在以上记载的氧化还原酶基序中“c”代表半胱氨酸或具有巯基的另一种氨基酸，例如巯基缬氨酸(mercaptovaline)、高半胱氨酸或者其他具有巯基官能团的天然或非天然氨基酸。为了具有还原活性，存在于经修饰氧化还原酶基序中的半胱氨酸不应作为胱氨酸二硫桥的一部分出现。x可以是20种天然氨基酸中的任一种，包括s、c或t，或者可以是非天然氨基酸。在一些具体实施方案中，x是具有小侧链的氨基酸，例如gly、ala、ser或thr。在另一些具体实施方案中，x不是具有大侧链的氨基酸，例如trp。在另一些具体实施方案中，x不是半胱氨酸。在另一些具体实施方案中，在经修饰氧化还原酶基序中的至少一个x是his。在另外的另一些具体实施方案中，在经修饰氧化还原酶中的至少一个x是pro。
[0206]
肽还可包含修饰以提高稳定性或溶解性，例如n端nh2基团或c端cooh基团的修饰(例如，将cooh修饰成conh2基团)。
[0207]
在包含经修饰氧化还原酶基序的本发明的肽中，对基序进行定位以使得当表位适合于mhc或cd1d沟时，基序保留在mhc或cd1d结合沟的外部。经修饰氧化还原酶基序置于紧邻肽内的表位序列[换言之，基序与表位之间的接头序列为零个氨基酸]，或者通过包含7个氨基酸或更少的氨基酸序列的接头与t细胞表位隔开。更特别地，接头包含1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。一些具体实施方案是在表位序列与经修饰氧化还原酶基序序列之间具有0、1、2或3个氨基酸接头的肽。在其中经修饰氧化还原酶基序序列与表位序列相邻的那些肽中，这表示为与表位序列相比的第p-4位至第p-1位或第p+1位至第p+4位。除肽接头之外，其他有机化合物也可用作接头，以将肽的部分彼此(例如，经修饰氧化还原酶基序序列与t细胞表位序列)连接。
[0208]
本发明的肽还可在包含t细胞表位和经修饰氧化还原酶基序的序列的n端或c端包含另外的短氨基酸序列。这样的氨基酸序列在本文中通常被称为“侧翼序列”。侧翼序列可位于表位与内体靶向序列之间和/或经修饰氧化还原酶基序与内体靶向序列之间。在某些不包含内体靶向序列的肽中，短氨基酸序列可在肽中经修饰氧化还原酶基序和/或表位序列的n端和/或c端存在。更特别地，侧翼序列是1至7个氨基酸的序列，最特别是1、2或3个氨基酸的序列。
[0209]
优选地，氧化还原酶基序中的z对应于免疫原性肽的n端或c端末端。
[0210]
经修饰氧化还原酶基序可位于表位的n端。
[0211]
在本发明的某些实施方案中，提供了包含一个表位序列和经修饰氧化还原酶基序序列的肽。在另一些具体实施方案中，经修饰氧化还原酶基序在肽中出现数次(1、2、3、4或甚至更多次)，例如作为可通过一个或更多个氨基酸彼此间隔的经修饰氧化还原酶基序的重复序列，或者作为彼此紧邻的重复序列。作为替代地，在t细胞表位序列的n和c端二者均提供一个或更多个经修饰氧化还原酶基序。
[0212]
针对本发明的肽设想的其他变化形式包含含有t细胞表位序列的重复序列的肽，其中每个表位序列在经修饰氧化还原酶基序之前和/或之后(例如“经修饰氧化还原酶基序-表位”的重复序列或“经修饰氧化还原酶基序-表位-经修饰氧化还原酶基序”的重复序列)。在本文中，经修饰氧化还原酶基序可都具有相同的序列，但这不是必须的。应注意，包含其本身包含经修饰氧化还原酶基序的表位的肽的重复序列还将导致序列包含“表位”和“经修饰氧化还原酶基序”二者。在这样的肽中，在一个表位序列内的经修饰氧化还原酶基序作为在第二个表位序列外的经修饰氧化还原酶基序发挥作用。
[0213]
通常，本发明的肽仅包含一个t细胞表位。如下所述，可通过功能测定和/或二氧化硅预测测定中的一个或更多个来鉴定蛋白质序列中的t细胞表位。t细胞表位序列中的氨基酸根据其在mhc蛋白的结合沟中的位置来编号。存在于肽中的t细胞表位由8至25个氨基酸，但更特别地8至16个氨基酸组成，但最特别地由8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸组成。
[0214]
在一个更具体的实施方案中，t细胞表位由9个氨基酸的序列组成。在另一个具体实施方案中，t细胞表位是由mhc ii类分子呈递至t细胞的表位[mhc ii类限制性t细胞表位]。在一个替代实施方案中，t细胞表位是由cd1d分子呈递至t细胞的nkt细胞表位[nkt细
胞特异性表位]。通常，t细胞表位序列是指适合mhc ii蛋白或cd1d蛋白的槽的八肽或更特别地是九肽序列。
[0215]
本发明的肽的t细胞表位可对应于蛋白质的天然表位序列，或者可以是其经修饰形式，前提是：与天然t细胞表位序列类似，经修饰t细胞表位保留其在mhc或cd1d槽内结合的能力。经修饰t细胞表位可具有与天然表位相同的对mhc或cd1d蛋白的结合亲和力，但也可具有降低的亲和力。特别地，经修饰肽的结合亲和力是原始肽的不少于10倍小，更特别地是不少于5倍小。本发明的肽对蛋白质复合物具有稳定作用。因此，肽-mhc/cd1d复合物的稳定作用补偿了经修饰表位对mhc或cd1d分子的降低的亲和力。
[0216]
肽内包含t细胞表位和还原性化合物的序列可进一步与促进肽被摄取到晚期内体中以进行加工并在mhc ii类或cd1d决定簇中呈递的氨基酸序列(或另一种有机化合物)连接。晚期内体靶向是由存在于蛋白质的胞质尾中的信号介导的，并且对应于公认的肽基序。晚期内体靶向是由存在于蛋白质的胞质尾中的信号介导的，并且对应于公认的肽基序，例如基于双亮氨酸的[de]xxxl[li](seq id no：204)或dxxll基序(seq id no：205)(例如dxxxll，seq id no：206))、基于酪氨酸的yxx0基序或所谓的酸性簇基序(seq id no：207)。符号0表示具有大疏水性侧链的氨基酸残基，例如phe、tyr和trp。晚期内体靶向序列允许对抗原来源的t细胞表位进行加工并通过mhc ii类或cd1d分子高效呈递。这样的内体靶向序列包含在例如gp75蛋白(vijayasaradhi et al.(1995)j.cell.biol.130，807-820)、人cd3γ蛋白、hla-bm 11(copier et al.(1996)j.lmmunol.157,1017-1027)、dec205受体胞质尾(mahnke et al.(2000)j.cell biol.151,673-683)内。在bonifacio和traub(2003)annu.rev.biochem.72,395-447的综述中公开了作为内体的分拣信号发挥作用的肽的其他实例。作为替代地，该序列可以是来自蛋白质的亚优势或次要t细胞表位的序列，其促进晚期内体中的摄取但未克服针对抗原的t细胞应答。晚期内体靶向序列可位于抗原来源肽的氨基端或羧基端末端处，以用于高效摄取和加工，并且也可通过侧翼序列，例如多至10个氨基酸的肽序列偶联。当出于靶向目的使用次要t细胞表位时，后者通常位于抗原来源肽的氨基端末端处。
[0217]
因此，本发明设想了抗原蛋白的肽及其在引发特异性免疫反应中的用途。这些肽可对应于在其序列内包含即被至多10个，优选7个氨基酸或更少的氨基酸隔开的还原性化合物和t细胞表位的蛋白质片段。作为替代地，并且对于大多数抗原蛋白，本发明的肽是通过将还原性化合物，更特别地本文中所述的还原性经修饰氧化还原酶基序与抗原蛋白的t细胞表位在n端或c端偶联(与其直接相邻或用至多10个、更特别地至多7个氨基酸的接头)而产生的。此外，与天然存在的序列相比，可对蛋白质的t细胞表位序列和/或经修饰氧化还原酶基序进行修饰和/或可引入一个或更多个侧翼序列和/或靶向序列(或对其进行修饰)。因此，取决于本发明的特征是否可存在于目的抗原蛋白的序列内，本发明的肽可包含“人工的”或“天然存在的”序列。
[0218]
当提及肽时，术语“天然”涉及序列与天然存在蛋白质(野生型或突变体)的片段相同的事实。与此相反，术语“人工”是指其本身在自然界中不存在的序列。通过有限的修饰，例如在天然存在序列内改变/缺失/插入一个或更多个氨基酸，或者通过添加/去除天然存在序列的n端或c端的氨基酸，而从天然序列中获得人工序列。
[0219]
本发明的肽的长度可显著变化。肽的长度可以为9或11个氨基酸(即由7至9个氨基
酸的表位、与其相邻的2至11个氨基酸的经修饰氧化还原酶基序组成)多至12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40或50个氨基酸而不等。例如，肽可包含40个氨基酸的内体靶向序列、约2个氨基酸的侧翼序列、2至11个氨基酸的如本文中所述的氧化还原酶基序、4至7个氨基酸的接头以及7、8或9个氨基酸最小长度的t细胞表位肽。
[0220]
因此，在一些具体实施方案中，完整的肽由9个氨基酸多至20、25、30、40、50、75或100个氨基酸组成。更特别地，在还原性化合物是如本文中所述的经修饰氧化还原酶基序的情况下，无内体靶向序列的包含任选地通过接头连接的表位和经修饰氧化还原酶基序的(人工或天然)序列(本文中称为“表位-经修饰氧化还原酶基序”序列)的长度是至关重要的。“表位-经修饰氧化还原酶基序”更特别地具有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸的长度。这样的9、10、11、12、13或14至19个氨基酸的肽可任选地与其大小不太关键的内体靶向信号偶联。
[0221]
如上所述，在一些具体实施方案中，本发明的肽包含与t细胞表位序列连接的如本文中所述的还原性经修饰氧化还原酶基序。
[0222]
在另一些具体实施方案中，本发明的肽是包含t细胞表位的肽，该t细胞表位不包含在其天然序列内具有氧化还原酶特性的氨基酸序列。
[0223]
一般而言，本发明的肽不是天然的(因此没有像这样的蛋白质片段)而是人工肽，其除t细胞表位之外还包含如本文中所述的经修饰氧化还原酶基序，其中经修饰氧化还原酶基序通过由多至七个氨基酸、最特别地多至四个或多至2个氨基酸组成的接头与t细胞表位直接隔开。
[0224]
已表明，在向哺乳动物施用(即注射)根据本发明的肽(或包含这样的肽的组合物)之后，该肽引发识别抗原来源的t细胞表位的t细胞活化，并通过还原表面受体向t细胞提供另外的信号。这种超最佳活化导致t细胞获得对呈递t细胞表位的细胞的溶细胞特性，以及对旁观者t细胞的抑制特性。以这种方式，本发明中所述的包含抗原来源的t细胞表位以及表位之外的经修饰氧化还原酶基序的肽或包含所述肽的组合物可用于哺乳动物包括人的直接免疫接种。因此，本发明提供了本发明的肽或其衍生物，其用作药物。因此，本发明提供了治疗方法，其包括向有此需要的患者施用一种或更多种根据本发明的肽。
[0225]
本发明提供了这样的方法，通过该方法，被赋予溶细胞特性的抗原特异性t细胞可通过用小肽进行的免疫接种来引发。已经发现包含以下的肽引发抑制性t细胞：(i)编码来自抗原的t细胞表位的序列和(ii)具有氧化还原特性的共有序列，并且另外任选地还包含促进该肽被摄取到晚期内体中以用于高效的mhc ii类或cd1d呈递的序列。
[0226]
本发明的肽的免疫原性特性在治疗和预防免疫反应中是特别令人感兴趣的。
[0227]
本文中所述的肽用作药物，更特别地用于制备用于在哺乳动物中(更特别地在人中)预防或治疗免疫病症的药物。
[0228]
本发明描述了通过使用本发明的肽、其同源物或衍生物来治疗需要这样的治疗的哺乳动物的免疫病症的方法，该方法包括向患有免疫病症或处于免疫病症的风险之中的所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的肽、其同源物或衍生物例如以降低免疫病症的症状的步骤。设想了对人和动物(例如宠物和农场动物)二者的治疗。在一个实施方案中，待治疗的哺乳动物是人。在一个具体实施方案中，以上提及的免疫病症选自变应性疾病和自身免疫病。更特别地，提供了这样的免疫原性肽，其用于治疗或减轻ms的症状。
[0229]
本发明的肽或包含如本文中所限定的这样的肽的药物组合物优选通过皮下或肌内施用来施用。优选地，可将肽或包含这样的肽的药物组合物皮下(sc)注射到位于肘和肩中间的上臂的外侧部的区域中。当需要两次或更多次分开的注射时，其可伴随地在两条臂中施用。
[0230]
根据本发明的肽或包含这样的肽的药物组合物以治疗有效剂量施用。一些示例性但非限制性的剂量方案为50至1500μg，优选100至1200μg。一些更具体的剂量方案可以为50至250μg、250至450μg、或850至1300μg，这取决于患者的状况和疾病的严重程度。剂量方案可包含以单剂量或者以2、3、4、5或更多个剂量同时或连续地施用。一些示例性的非限制性施用方案如下：
[0231]-低剂量方案，其包括sc施用50μg肽，以各25μg(各100μl)的两次分开注射进行；随后三次连续注射25μg肽，所述注射25μg肽是以各12.5μg(各50μl)的两次分开注射进行的。
[0232]-中剂量方案，其包括sc施用150μg肽，以各75μg(各300μl)的两次分开注射进行；随后三次连续施用75μg肽，所述施用75μg肽是以各37.5μg(各150μl)的两次分开注射进行的。
[0233]-高剂量方案，其包括sc施用450μg肽，以各225μg(各900μl)的两次分开注射进行；随后三次连续施用225μg肽，所述施用225μg肽是以各112.5μg(各450μl)的两次分开注射进行的。
[0234]
另一些示例性非限制性施用方案如下：
[0235]-剂量方案，其包括6次sc施用(间隔2周)450μg肽，所述施用450μg肽是以各225μg的两次分开注射进行的。
[0236]-剂量方案，其包括6次sc施用(间隔2周)1350μg肽，所述施用1350μg肽是以各675μg的两次分开注射进行的。
[0237]
如本文中所限定的免疫原性肽的一个特定但非限制性剂量方案是50至1500μg，优选450至1500μg。剂量方案可包含以单剂量或者以2、3、4、5、6或更多个剂量同时或连续地施用。所述用免疫原性肽进行的治疗可进行1至6次，例如1至4次，优选每5至9天，例如约每7天。
[0238]
对于所有上述肽，设想了另外的变体，其中在组氨酸侧翼残基和氧化还原酶基序的第一半胱氨酸之间存在一个或两个氨基酸x。通常来说，这些外部氨基酸x不是his、cys、ser或thr。
[0239]
本发明的肽还可在用于在样品中检测ii类限制性cd4+t细胞或nkt细胞的体外诊断方法中使用。在该方法中，使样品与mhc ii类或cd1d分子和根据本发明的肽的复合物接触。通过测量复合物与样品中细胞的结合来检测cd4+t细胞或nkt细胞，其中复合物与细胞的结合指示样品中存在cd4+t细胞或nkt细胞。
[0240]
复合物可以是肽与mhc ii类或cd1d分子的融合蛋白。
[0241]
作为替代地，复合物中的mhc或cd1d分子是四聚体。复合物可作为可溶性分子提供或者可与载体连接。
[0242]
因此，在一些具体实施方案中，本发明的治疗和预防方法包括施用如本文中所述的免疫原性肽，其中所述肽包含在待治疗的疾病中发挥作用的抗原蛋白的t细胞表位(例如如以上描述的那些)。在另一些具体实施方案中，使用的表位是优势表位。
[0243]
根据本发明的肽将通过合成其中t细胞表位与经修饰氧化还原酶基序将被0至7个氨基酸隔开的肽来制备。在某些实施方案中，经修饰氧化还原酶基序可通过在表位序列之外引入1、2或3个突变来获得，以保留如在蛋白质中存在的序列背景。通常来说，参照作为天然序列的一部分的九肽，p-2和p-1以及p+10和p+11中的氨基酸被保留在肽序列中。这些侧翼残基通常使与mhc ii类或cd1d的结合稳定。在另一些实施方案中，表位的n端或c端序列与包含t细胞表位序列的抗原蛋白的序列无关。
[0244]
因此，基于以上用于设计肽的方法，通过化学肽合成、重组表达方法或在更特殊情况下的蛋白质的蛋白水解或化学片段化来产生肽。
[0245]
可在体外和体内方法中测试如在上述方法中产生的肽的t细胞表位的存在，并且可在体外测定中测试其还原活性。作为最终的品质控制，可在体外测定中测试肽以验证该肽是否可产生cd4+t细胞或nkt细胞，这些细胞通过针对呈递包含表位序列(其也存在于具有经修饰氧化还原酶基序的肽中)的抗原的抗原呈递细胞的凋亡途径而具有溶细胞性。
[0246]
本发明的肽可使用重组dna技术在细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中产生。考虑到肽的有限长度，其可通过化学肽合成来制备，其中通过将不同的氨基酸彼此偶联来制备肽。化学合成特别适合于包含例如d-氨基酸、具有非天然存在侧链的氨基酸等。
[0247]
化学肽合成方法已被充分描述，并且肽可从公司例如applied biosystems和其他公司订购。
[0248]
肽合成可以作为固相肽合成(solid phase peptide synthesis，spps)或与液相肽合成相反地进行。最著名的spps方法是t-boc和fmoc固相化学：
[0249]
在肽合成期间，使用了数个保护基。例如，羟基和羧基官能团被叔丁基保护，赖氨酸和色氨酸被t-boc基团保护，并且天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和组氨酸被三苯甲基保护，并且精氨酸被pbf基团保护。如果合适的话，这样的保护基可在合成之后留在肽上。可使用如kent(schnelzer&kent(1992)lnt.j.pept.protein res.40,180-193)最初所描述并且例如在tam et al.(2001)biopolymers 60,194-205中所综述的连接策略(两个未经保护的肽片段的化学选择性偶联)将肽彼此连接以形成更长的肽，所述连接策略为实现蛋白质合成提供了巨大的潜力，这超出了spps的范围。通过这种方法已成功地合成了大小为100至300个残基的许多蛋白质。由于spps的巨大进步，合成肽在生物化学、药理学、神经生物学、酶学和分子生物学的研究领域中继续发挥着越来越重要的作用。
[0250]
作为替代地，所述肽可通过在包含编码核苷酸序列的合适的表达载体中使用编码本发明肽的核酸分子来合成。这样的dna分子可使用自动dna合成仪和遗传密码的公知密码子-氨基酸关系来容易地制备。这样的dna分子还可使用寡核苷酸探针和常规杂交方法作为基因组dna或作为cdna来获得。可将这样的dna分子并入到表达载体(包括质粒)中，所述表达载体适合于在合适的宿主中表达dna和产生多肽，所述合适的宿主例如细菌(例如大肠杆菌)、酵母细胞、动物细胞或植物细胞。
[0251]
检查目的肽的物理和化学特性(例如溶解性、稳定性)，以确定该肽是否/是否将适合用于治疗性组合物中。通常来说，这是通过调节肽的序列来优化的。任选地，可在合成之后使用本领域已知的技术对肽进行修饰(化学修饰，例如添加/缺失官能团)。
[0252]
认为t细胞表位本身通过与抗原呈递细胞表面的适当hla分子结合并刺激相关t细
胞亚群来触发早期的t辅助细胞水平事件。这些事件导致t细胞增殖、淋巴因子分泌、局部炎性反应、向该部位募集另外的免疫细胞以及激活b细胞级联反应，从而产生抗体。这些抗体的一种同种型ige在变应性症状的发展中具有根本性的重要性，并且它的产生在t辅助细胞水平事件的级联早期受到分泌的淋巴因子性质的影响。t细胞表位是t细胞受体识别的基本要素或最小单位，其中表位包含受体识别所必需的氨基酸残基，所述氨基酸残基在蛋白质的氨基酸序列中是连续的。
[0253]
然而，在施用具有t细胞表位和氧化还原酶基序的肽之后，认为会发生以下事件：
[0254]
由与mhc ii类分子呈递的抗原来源肽的同源相互作用引起的抗原(i)特异性t细胞的活化；
[0255]
还原酶序列还原t细胞表面蛋白，例如cd4分子，其第二结构域包含受限制的二硫桥。这将信号转导到t细胞中。在与氧化途径提高相关的一系列结果中，重要事件是钙内流提高和nf-kb转录因子易位至细胞核。后者导致ifn-γ和颗粒酶的转录提高，这使得细胞通过凋亡诱导机制获得溶细胞特性；溶细胞特性通过涉及颗粒酶b分泌和fas-fasl相互作用的机制影响呈递肽的细胞。由于细胞杀伤作用是通过凋亡途径获得的，因此与细胞毒性细胞相比，溶细胞性细胞是更适合这些细胞的术语。抗原呈递靶细胞的破坏阻止了针对位于同一抗原上的表位或针对将由同一抗原呈递细胞加工的不相关抗原的表位特异性的其他t细胞的活化；t细胞活化的另外的结果是通过细胞间接触依赖机制抑制旁观者t细胞的活化。在这样的情况下，由不同抗原呈递细胞呈递的抗原活化的t细胞也被抑制，前提是溶细胞性t细胞和旁观者t细胞二者非常接近，即在同一抗原呈递细胞的表面上被活化。
[0256]
以上假定的作用机制由以上引用的pct申请wo2008/017517和本发明人的出版物中公开的实验数据证实。
[0257]
类似地，如wo2012/069568和本发明人的出版物中所假定和显示的，nkt细胞表位将根据以下机制降低免疫应答。当nkt细胞通过经修饰为以含有硫还原酶活性的肽而活化时，后者显著提高了nkt细胞的特性，并且从而提高了通过抗原特异性cd4+nkt细胞对携带自身抗原的细胞的杀伤，这抑制了针对所述自身抗原的免疫应答。已经在许多场合报道了nkt细胞参与自身免疫病中的或者针对同种因子或变应原的免疫应答的控制(jahng et al journal of experimental medicine 199：947-957，2004；van belle and von herrath，molecular immunology 47：8-11，2009)，但其相对难以描述。在wo2012/069568中，显示了肽可由cd1d分子呈递。cd1d分子的特征是由2条反平行的α链构成，形成位于由两条反平行β链构成的平台的顶部的槽。槽是窄且深的，并且仅接受疏水性残基，典型地仅视为脂质。具有疏水性残基的肽具有与cd1d槽结合的能力。此外，由于槽在两侧均是开放的，因此可容纳比7个氨基酸更长的肽。在自身抗原、同种因子和变应原中通常存在携带cd1d基序的疏水肽，从而赋予所述自身抗原、同种因子或变应原活化cd4+nkt细胞的能力。通过杀伤呈递所述自身抗原、同种因子或变应原的细胞进行的直接消除消除了建立针对这些抗原/因子的免疫应答的能力。
[0258]
本发明涉及包含来源于mog的疏水性残基的肽的产生，所述疏水性残基赋予与cd1d分子结合的能力。在施用之后，这样的肽被apc吸收，被引导至晚期内体，在那里它们被加载到cd1d上并在apc表面处呈递。所述疏水性mog肽的特征在于对应于通用序列[fwhy]-xx-[ilmv]-xx-[fwthy](seq id no：208)或[fw]-xx-[ilmv]-xx-[fw](seq id no：209)的
基序，其中第p1和p7位被疏水性残基例如苯丙氨酸(f)或色氨酸(w)占据。然而，p7在其接受苯丙氨酸或色氨酸的替代疏水性残基例如苏氨酸(t)或组氨酸(h)的意义上是允许的。第p4位被脂肪族残基例如异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)或甲硫氨酸(m)占据。
[0259]
本发明提供了用于在体内或体外产生抗原特异性溶细胞性cd4+t细胞的方法，以及与其无关的，基于特征表达数据区分溶细胞性cd4+t细胞与其他细胞群例如foxp3+treg的方法。
[0260]
本发明描述了用于产生抗原特异性cd4+t细胞的体内方法。一个具体实施方案涉及用于通过以下来产生或分离cd4+t细胞的方法：用如本文中所述的本发明的肽来免疫接种动物(包括人)，并随后从经免疫接种的动物中分离cd4+t细胞。本发明描述了用于产生针对apc的抗原特异性溶细胞性cd4+t细胞的体外方法。本发明提供了用于产生针对apc的抗原特异性溶细胞性cd4+t细胞的方法。
[0261]
在一个实施方案中，提供了这样的方法，其包括分离外周血细胞，通过根据本发明的免疫原性肽体外刺激细胞群，以及扩增经刺激的细胞群，更特别地在存在il-2的情况下进行。根据本发明的方法具有以下优点：产生高数目的cd4+t细胞，并且可产生对抗原蛋白具有特异性的cd4+t细胞(通过使用包含抗原特异性表位的肽)。
[0262]
在一个替代实施方案中，cd4+t细胞可在体内产生，即通过向对象注射本文中所述的免疫原性肽，并收集体内产生的溶细胞性cd4+t细胞来产生。
[0263]
可通过本发明的方法获得的针对apc的抗原特异性溶细胞性cd4+t细胞在预防变应性反应和治疗自身免疫病中向哺乳动物施用免疫治疗是特别令人感兴趣的。设想了使用同种细胞和自体细胞(autogeneic cell)二者。
[0264]
溶细胞性cd4+t细胞群如下文中所述获得。
[0265]
如本文中所述的抗原特异性溶细胞性cd4+t细胞可用作药物，更特别地用于过继细胞治疗，更特别地用于治疗急性变应性反应和自身免疫病(例如多发性硬化)的复发。如所述产生的分离的溶细胞性cd4+t细胞或细胞群，更特别地抗原特异性溶细胞性cd4+t细胞群用于制备用于预防或治疗免疫病症的药物。公开了通过使用分离的或产生的溶细胞性cd4+t细胞进行治疗的方法。
[0266]
如wo2008/017517中说明的，基于细胞的表达特征，可将针对apc的溶细胞性cd4+t细胞与天然treg细胞区分开。更特别地，与天然treg细胞群相比，溶细胞性cd4+t细胞群表现出以下特征中的一种或更多种：
[0267]
活化之后表面标志物(包括cd103、ctla-4、fasl和icos)的表达提高，
[0268]
cd25中等表达，
[0269]
cd4、icos、ctla-4、gitr表达，以及cd127(il7-r)低表达或不表达，cd27不表达，
[0270]
转录因子t-bet和egr-2(krox-20)表达，但转录阻遏物foxp3不表达，高的ifn-γ产生，以及没有或仅痕量的il-10、il-4、il-5、il-13或tgf-β。
[0271]
此外，溶细胞性t细胞表达cd45ro和/或cd45ra，不表达ccr7、cd27，并且呈递高水平的颗粒酶b和其他颗粒酶以及fas配体。
[0272]
在施用于活的动物(通常是人)之后，本发明的肽将引发对旁观者t细胞发挥抑制活性的特异性t细胞。
[0273]
在一些具体实施方案中，本发明的溶细胞性细胞群的特征在于fasl和/或干扰素
γ的表达。在一些具体实施方案中，本发明的溶细胞性细胞群的特征还在于颗粒酶b的表达。
[0274]
该机制还意味着并且实验结果表明，本发明的肽尽管包含某抗原的特定t细胞表位，但可用于预防或治疗由针对相同抗原的其他t细胞表位的免疫反应引发的病症，或者在某些情况下甚至用于治疗由针对其他不同抗原的其他t细胞表位的免疫反应引发的病症，如果所述其他不同抗原将由mhc ii类分子在被本发明肽活化的t细胞附近通过相同的机制来呈递的话。
[0275]
公开了具有上述特征的细胞类型的分离的细胞群，其另外是抗原特异性的，即能够抑制抗原特异性免疫应答。
[0276]
本发明提供了包含一种或更多种根据本发明的肽的药物组合物，所述药物组合物还包含可药用载体。如上所详述的，本发明还涉及用作药物的组合物或涉及通过使用所述组合物来治疗哺乳动物免疫病症的方法，以及涉及所述组合物用于制备用于预防或治疗免疫病症的药物的用途。药物组合物可例如是疫苗，其适用于治疗或预防免疫病症，尤其是空气源性(airborne)和食源性(foodborne)变态反应以及变应性源的疾病。作为药物组合物的本文中进一步描述的一个实例，将根据本发明的肽吸附在适合于向哺乳动物施用的佐剂，例如氢氧化铝(明矾)上。通常来说，以2周的间隔通过皮下途径注射3次50μg的吸附在明矾上的肽。对于本领域技术人员来说应明显的是，其他施用途径也是可能的，包括经口、鼻内或肌内。同样，注射次数和注射量可根据待治疗的病症而变化。此外，可使用除明矾之外的其他佐剂，前提是其促进mhc ii类或cd1d呈递中的肽呈递和t细胞活化。因此，尽管可单独施用活性成分，但它们通常作为药物制剂存在。本发明的用于兽用用途和用于人用途二者的制剂均包含至少一种如上所述的活性成分以及一种或更多种可药用载体。本发明涉及药物组合物，其包含与可药用载体混合的作为活性成分的一种或更多种根据本发明的肽。本发明的药物组合物应包含治疗有效量的活性成分，例如下文关于治疗或预防方法所指示的。任选地，组合物还包含其他治疗性成分。合适的其他治疗性成分以及其取决于其所属类别的常用剂量是本领域技术人员公知的，并且可选自用于治疗免疫病症的其他已知药物。
[0277]
如本文中所限定的免疫原性肽可吸附在适合于向哺乳动物施用的佐剂，例如氢氧化铝(明矾)上。通常，通过皮下途径以2周的间隔注射3次50μg的吸附在明矾上的肽。对于本领域技术人员来说应明显的是，其他施用途径也是可能的，包括但不限于经口、鼻内或肌内。此外，注射次数和注射量可根据待治疗的病症的严重程度和其他参数，例如患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食而变化。此外，可使用除明矾之外的其他佐剂，前提是其促进mhc ii类或cd1d中的肽呈递以及t细胞或nkt细胞活化。因此，尽管免疫原性肽可在没有任何佐剂的情况下施用，但其通常作为药物制剂存在。用于兽用用途和用于人用途二者的制剂均包含至少一种如上所述的免疫原性肽以及一种或更多种可药用载体。
[0278]
本文中使用的关于如本文中所限定的免疫原性肽的术语“可药用载体”意指与免疫原性肽一起配制以便于例如通过溶解、分散或扩散该组合物来有助于其在待治疗的部位的施加或散布，和/或在不损害其效力的情况下有助于其储存、运输或处理的任何材料或物质。可药用载体包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂(例如酚、山梨酸、氯丁醇)、等张剂(例如糖或氯化钠)等。为了控制药物制剂中免疫原性肽的作用持续时间，可包含另外的成分。可药用载体可以是固体或液体或已被压缩以形成液体的气体，即制剂
可合适地用作浓缩剂、乳剂、溶液剂、颗粒剂、粉尘剂(dust)、喷雾剂、气雾剂、混悬剂、软膏剂、乳膏剂、片剂、丸剂或粉剂。用于肽的药物制剂的合适的药物载体是本领域技术人员公知的，并且在本发明内对其选择没有特别限制。可药用载体还可包括添加剂，例如润湿剂、分散剂、黏贴剂(sticker)、黏合剂、乳化剂、溶剂、包衣、抗细菌和抗真菌剂(例如酚、山梨酸、氯丁醇)、等张剂(例如糖或氯化钠)等，前提是它们与药学实践一致，即不会对哺乳动物造成永久损害的载体和添加剂。免疫原性肽的药物制剂可以以任何已知方式制备，例如通过以一步或多步操作将活性成分与所选的载体材料以及(合适的话)其他添加剂(例如表面活性剂)一起均质地混合、对其进行包衣和/或研磨来制备。它们也可通过微粉化(micronisation)来制备，例如，考虑到以通常具有约1至10μm直径的微球形式获得它们，即用于制备用于控制或持续释放免疫原性肽的微胶囊剂。
[0279]
用于免疫原性肽的药物制剂的合适表面活性剂(也称为乳化剂(emulgent)或乳化剂(emulsifier))是具有良好的乳化、分散和/或润湿特性的非离子型、阳离子型和/或阴离子型材料。合适的阴离子型表面活性剂包括水溶性皂和水溶性合成表面活性剂二者。合适的皂是高级脂肪酸(c
10
至c
22
)的碱金属盐或碱土金属盐、未经取代或经取代的铵盐，例如油酸或硬脂酸的钠盐或钾盐，或者可从椰子油或动物脂油(tallow oil)获得的天然脂肪酸混合物的钠盐或钾盐。合成的表面活性剂包括聚丙烯酸的钠盐或钙盐；脂肪磺酸盐和硫酸盐；磺化苯并咪唑衍生物和烷基芳基磺酸盐。脂肪磺酸盐或硫酸盐通常为以下形式：碱金属盐或碱土金属盐、未经取代的铵盐或被具有8至22个碳原子的烷基或酰基基团取代的铵盐，例如，木质素磺酸(lignosulphonic acid)或十二烷基磺酸的钠盐或钙盐，或从天然脂肪酸中获得的脂肪醇硫酸盐的混合物、硫酸酯或磺酸酯的碱金属盐或碱土金属盐(例如月桂基硫酸钠)和脂肪醇/环氧乙烷加合物的磺酸。合适的磺化苯并咪唑衍生物通常包含8至22个碳原子。烷基芳基磺酸盐的一些实例是十二烷基苯磺酸或二丁基-萘磺酸或萘-磺酸/甲醛缩合产物的钠盐、钙盐或链烷醇胺盐。同样合适的是相应的磷酸盐，例如磷酸酯和对壬基苯酚与环氧乙烷和/或环氧丙烷的加合物，或磷脂的盐。用于此目的的合适的磷脂是脑磷脂或卵磷脂类型的天然的(来源于动物或植物细胞的)或合成的磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、溶血卵磷脂、心磷脂、二辛基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱，及其混合物。合适的非离子型表面活性剂包括烷基酚、脂肪醇、脂肪酸、分子中包含至少12个碳原子的脂肪族胺或酰胺、烷基芳烃磺酸盐和二烷基磺基琥珀酸盐的聚乙氧基化和聚丙氧基化衍生物，例如脂肪族和脂环族醇、饱和和不饱和脂肪酸和烷基酚的聚乙二醇醚衍生物，所述衍生物通常在(脂肪族)烃部分中包含3至10个乙二醇醚基和8至20个碳原子，并且在烷基酚的烷基部分中包含6至18个碳原子。另外的合适的非离子型表面活性剂是聚环氧乙烷与聚丙二醇、在烷基链中包含1至10个碳原子的乙二胺基聚丙二醇(ethylenediaminopolypropylene glycol)的水溶性加合物，该加合物包含20至250个乙二醇醚基和/或10至100个丙二醇醚基。这样的化合物通常包含1至5个乙二醇单元/丙二醇单元。非离子型表面活性剂的代表性实例是壬基酚-聚乙氧基乙醇、蓖麻油聚乙醇醚(castor oil polyglycolic ether)、聚丙烯/聚环氧乙烷加合物、三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。如下物质也是合适的非离子型表面活性剂：聚乙烯脱水山梨糖醇的脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯)、甘油、脱水山梨糖醇、蔗糖和季戊四醇。合适的阳离子型表面活性剂包括具有4个任选地被卤素、苯基、经取代的苯基或
羟基取代的烃基的季铵盐，特别是卤化物；例如包含作为n-取代基的至少一个c8c
22
烷基基团(例如鲸蜡基、月桂基、棕榈基、肉豆蔻基、油烯基等)以及作为另外的取代基的未经取代或卤代的低级烷基、苄基和/或羟基-低级烷基的季铵盐。
[0280]
适合于可注射使用的免疫原性肽的药物剂型或药物制剂包括无菌水溶液剂或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于无菌可注射溶液剂或分散体的即用型(extemporaneous)制剂的无菌散剂。在所有情况下，形式必须是无菌的并且必须存在为达到易注射性之程度的流体。其在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须抵御微生物(例如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体也可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。适当的流动性可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过在分散体情况下维持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的防止可通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等来产生。在许多情况下，将优选地包含等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来产生。
[0281]
无菌可注射溶液剂是通过将所需量的免疫原性肽根据需要与以上列举的多种其他成分一起并入适当的溶剂中，随后通过过滤灭菌来制备的。一般而言，分散体是通过将灭菌的免疫原性肽并入到无菌载剂中来制备的，所述无菌载剂包含基础分散介质和所需要的来自以上列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌散剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其由经预先无菌过滤的溶液产生免疫原性肽以及任何另外期望成分的散剂。
[0282]
在配制时，如本文中所限定的药物制剂或如本文中所限定的肽或如本文中所限定的富马酸酯化合物可以以与剂型相容的方式和以如治疗有效的这样的量来施用。
[0283]
本发明的肽或包含如本文中所限定的这样的肽的药物组合物优选通过皮下或肌内施用来施用。优选地，可将肽或包含这样的肽的药物组合物皮下(sc)注射到位于肘和肩中间的上臂的外侧部的区域中。当需要两次或更多次分开的注射时，其可伴随地在两条臂中施用。
[0284]
根据本发明的肽或包含这样的肽的药物组合物以治疗有效剂量施用。一些示例性但非限制性的剂量方案为50至1500μg，优选100至1200μg。一些更具体的剂量方案可以为50至250μg，250至450μg或850至1300μg，这取决于患者的状况和疾病的严重程度。剂量方案可包含以单剂量或者以2、3、4、5或更多个剂量同时或连续地施用。
[0285]
在某些实施方案中，治疗可在对象的整个疾病中重复数次。这样的连续治疗可每天进行，或者以1至10天的间隔，例如如每5至9天(例如约每7天)进行。
[0286]
作为替代地，所述治疗可每周、每两周、每月、每两个月或每三至四个月重复一次。
[0287]
一些示例性的非限制性施用方案如下：
[0288]-低剂量方案，其包括sc施用50μg肽，以各25μg(各100μl)的两次分开注射进行；随后三次连续注射25μg肽，所述注射25μg肽是以各12.5μg(各50μl)的两次分开注射进行的。
[0289]-中剂量方案，其包括sc施用150μg肽，以各75μg(各300μl)的两次分开注射进行；随后三次连续施用75μg肽，所述施用75μg肽是以各37.5μg(各150μl)的两次分开注射进行的。
[0290]-高剂量方案，其包括sc施用450μg肽，以各225μg(各900μl)的两次分开注射进行；随后三次连续施用225μg肽，所述施用225μg肽是以各112.5μg(各450μl)的两次分开注射进行的。
[0291]
另一些示例性非限制性施用方案如下：
[0292]-剂量方案，其包括6次sc施用(间隔2周)450μg肽，所述施用450μg肽是以各225μg的两次分开注射进行的。
[0293]-剂量方案，其包括6次sc施用(间隔2周)1350μg肽，所述施用1350μg肽是以各675μg的两次分开注射进行的。
[0294]
另一些示例性非限制性施用方案如下：
[0295]-剂量方案，其包括6次sc施用(间隔2周)450μg肽，所述施用450μg肽是以各225μg的两次分开注射进行的。
[0296]-剂量方案，其包括6次sc施用(间隔2周)1350μg肽，所述施用1350μg肽是以各675μg的两次分开注射进行的。
[0297]
免疫原性肽制剂易于以多种剂型(例如以上所述的可注射溶液剂的类型)施用，但也可使用药物释放胶囊剂等。例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要的话，溶液应适当缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等张。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可将一个剂量溶解在1ml等张nacl溶液中，并添加至1000ml皮下灌注流体中，或者在建议的输注部位注射。根据所治疗对象的情况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定用于个体对象的适当剂量。
[0298]
技术人员可容易地设想免疫原性肽的其它可药用形式。
[0299]
根据本发明的肽、其同源物或衍生物(及其全部包括在术语“活性成分”中的其生理学上可接受的盐或药物组合物)可通过适合于待治疗病症和适合于所述化合物(在此为待施用的蛋白质和片段)的任何途径来施用。可能的途径包括区域性、全身性、经口(固体形式或吸入)、经直肠、经鼻、局部(包括经眼、经颊和舌下)、经阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)。优选的施用途径可根据例如接受者的状况或待治疗的疾病而变化。如本文中所述，在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体最佳地是“可接受的”。所述制剂包括适用于经口、经直肠、经鼻、局部(包括经颊和舌下)、经阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)施用的那些。
[0300]
适用于肠胃外施用的制剂包括：水性和非水性无菌注射溶液剂，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质(其使制剂与预期接受者的血液等张)；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包括助悬剂和增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量的容器(例如密封的安瓿和小瓶)中，并且可储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用之前立即添加无菌液体载体(例如注射用水)。即用型注射溶液剂和混悬剂可由前述类型的无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。
[0301]
典型的单位剂量制剂是包含如上文中所述的活性成分的每日剂量或单位每日亚剂量或其适当分数的那些。应理解，除以上特别提及的成分之外，考虑到所讨论的制剂的类型，本发明的制剂可包含本领域常规的其他试剂，例如适用于经口施用的那些可包含矫味剂。根据本发明的肽、其同源物或衍生物可用于提供包含一种或更多种本发明化合物作为
活性成分的控制释放药物制剂(“控制释放制剂”)，其中活性成分的释放可被控制和调节，以允许较低频率的给药或改善给定的本发明化合物的药代动力学谱或毒性谱。可根据常规方法制备适用于经口施用的控制释放制剂，其中离散单元包含一种或更多种本发明化合物。为了控制组合物中活性成分的作用持续时间，可包含另外的成分。因此，可通过选择合适的聚合物载体来获得控制释放组合物，所述合适的聚合物载体例如如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白等。药物释放的速率和作用的持续时间还可通过将活性成分并入到聚合物的颗粒(例如微胶囊、微球、微乳剂、纳米粒、纳米胶囊剂等)中来控制。根据施用途径，药物组合物可需要保护性包衣。适用于注射的药物形式包括无菌水溶液剂或分散体以及用于其即用型制剂的无菌散剂。因此，用于此目的的典型载体包括生物相容性水性缓冲剂、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇等，以及其混合物。鉴于以下事实：当组合使用数种活性成分时，其不一定在待治疗的哺乳动物中同时直接发挥其联合的治疗作用，因此相应的组合物也可以是在分开但相邻的储器或室中包含两种成分的医学药盒或包装的形式。因此，在后一种情况下，每种活性成分可以以适合于与另一种成分的施用途径不同的施用途径的方式配制，例如，它们之一可以是经口或肠胃外制剂的形式，而另一种是用于静脉内注射的安瓿或气雾剂的形式。
[0302]
如在体外和体内所证实的，如在本发明中的获得的溶细胞性cd4+t细胞在mhc ii类依赖性的同源活化之后诱导apc凋亡，影响树突细胞和b细胞二者，并且(2)在不存在il-10和/或tgf-β的情况下通过接触依赖性机制抑制旁观者t细胞。如wo2008/017517中详细讨论的，可将溶细胞性cd4+t细胞与天然treg和适应性treg区分开。
[0303]
类似地，在本发明中获得的nkt细胞，即通过包含硫还原酶活性的根据本发明的mog来源的肽活化的，后者显著提高了nkt细胞的特性，并且从而提高了由抗原特异性cd4+nkt细胞对携带mog自身抗原的细胞的杀伤，这抑制了针对所述mog自身抗原的免疫应答。在wo2012/069568中详细讨论了这种机制。
[0304]
虽然已结合本发明的一些特别的实施方案对本发明进行了描述，但明显的是，根据前述描述，许多替代、修改和变化对本领域技术人员将是明显的。因此，其旨在包含在所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有如下这样的替代、修改和变化。以下非限制性实施例进一步支持本文中公开的本发明的一些方面和实施方案。
[0305]
实施例
[0306]
实施例1：肽设计
[0307]
与wo2017182528中所公开的p1肽hchgcggflrvpcwki(seq id no：65)相比，合成了包含与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)的t细胞表位相连的氧化还原酶基序的4种肽(p2至p5)，如在下文所示的比对中所示：
[0308][0309]
所有4种肽均包含天然人mog表位flrvpcwki(seq id no：1)(p3和p5)或用s替代c的变体(p2和p4)、mog蛋白中天然存在的c端tlf侧翼序列、以及人工接头vry。p2和p3具有含有序列hcpyc(seq id no：24)的氧化还原酶基序。p4和p5具有含有序列khcpyc(seq id no：
50)的氧化还原酶基序以及在其c端处的2k。
[0310]
实施例2：免疫原性肽的氧化还原酶活性的评估。
[0311]
免疫原性肽的氧化还原酶活性使用在tomazzolli et al.(2006)anal.biochem.350，105-112中描述的荧光测定来确定。具有fitc标记的两个肽在其形成共价二硫键时会自猝灭。在被根据本发明的肽还原之后，被还原的单独fitc标记的肽再次发射荧光。活性表示为重复的平均值。结果以相对荧光单位(relative fluorescent unit，rfu)表示。所有受试肽p1至p5都显示出氧化还原酶活性(图1)。
[0312]
实施例3：免疫原性肽与可溶性hla-drb1＊03：01、hla-drb1＊04：01和hla-drb1＊15：01mhc ii蛋白的结合活性的评估。
[0313]
为了测试免疫原性肽与mhcii分子的结合，进行了可溶相竞争测定。提高浓度的p1至p5肽与生物素标记的对照肽(对应mhcii分子的高亲和力结合物，eurogentec，seraing，belgium)竞争与可溶性hla-drb1*03：01(也命名为dr3)、hla-drb1*04：01(也命名为dr4)或hla-drb1*15：01(也命名为dr15)人mhc ii蛋白(购自benaroya research institute，seattle，us)结合。当结合接近其平衡(18小时)时，生物素标记的肽/mhc ii复合物被捕获，与未结合的试剂分离，并通过时间分辨荧光(eu
3+
链霉亲和素，perkin elmer，brussels，belgium)进行定量检测。由于生物素化的对照肽负责荧光信号(eu
3+
链霉亲和素/生物素相互作用)，因此荧光强度的降低反映了受试肽的结合。对数据进行处理和绘制以确定受试肽的剂量依赖性结合特性。所有测试一式三份地进行。图2、3和4示出了一个实验的结果。显示肽p2至p5与对照p1肽相比以高得多的亲和力与hla-drb1*03：01、hla-drb1*04：01和hla-drb1*15：01结合。
[0314]
实施例4：接头vry对免疫原性肽与可溶性hla-drb1＊03：01、hla-drbi＊04：01和hla-drb1＊15：01mhc ii蛋白的结合活性的作用的评估。
[0315]
为了确定与p1相比，所观察到的mhcii与p2至p5的改善的结合是否是由于接头vry，测试了以下肽。
[0316]
p6：-hchgcvryflrvpcwki
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
[seq id no：254]
[0317]
p7：-hcpycgg-flrvpcwki
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
[seq id no：255]
[0318]
p6对应于其中接头gg已被接头vry替代的现有技术肽p1。p7对应于其中氧化还原酶基序hchgc已被hcpyc基序替代的现有技术肽p1。p6和p7者均显示出氧化还原酶活性(未示出)。图5至7中示出了肽p6与对照肽p1相比以高得多的亲和力与hla-drb1*03：01、hla-drb1*04：01和hla-drb1*15：01结合。p7肽表现出与p1肽类似的mhcii结合。
[0319]
用p4肽的以下变体进行了相同种类的实验：
[0320][0321]
p8、p9和p10肽对应于其中氧化还原酶基序khcpyc已分别被khchgc、kcrc或kcrpyc基序替代的肽p4。p11对应于其中接头vry已被接头gg替代的肽p4。所有的肽均显示出氧化还原酶活性(未示出)。通过gg替代vry接头诱导了hla-drb1*04：01和hla-drb1*15：01结合的强降低，以及hla-drb1*03：01结合的较小程度的降低(参见图8至10，将p4与p11比较，对数标度)。氧化还原酶基序的修饰未显著改变mhcii结合(参见图8至10，将肽p8、p9和p10与
p4比较)。
[0322]
总之，这些数据表明接头vry增强了本发明肽的mhcii结合，而不依赖于氧化还原酶序列。
[0323]
实施例5：免疫原性肽诱导具有裂解特性的特异性cd4+t细胞的能力。
[0324]
在lymphoprep密度梯度上从经富马酸二甲酯(dmf)治疗的患有多发性硬化的患者的血液样品中分离pbmc。患者的单倍型在下表1中示出。
[0325]
表1：本研究中包括的患者的单倍型：
[0326][0327]
通过用cd14微珠(miltenyi biotec，130-050-201)根据供应商的建议进行阳性免疫磁性分离来从这些pbmc中分离cd14+单核细胞。将cd14+单核细胞培养6天并使其成熟以产生自体树突细胞(mdc)。通过用cd19微珠(miltenyi biotec，130-050-301)根据供应商的建议进行阳性免疫磁性分离来从cd14-pbmc级分中分离cd19+b细胞。将cd19+b细胞进行培养并用ebv使其永生化，以产生自体类淋巴母细胞细胞系(lymphoblastoid cell line，lcl)。
[0328]
也通过用初始cd4+t细胞分离试剂盒(miltenyi biotec，130-094-131)根据供应商的建议进行阴性免疫磁性分离来从cd14-pbmc级分中纯化初始cd4+t细胞。在存在p2和p4肽的情况下，将初始cd4+t细胞与自体mdc或lcl共培养。约每10至12天周期性地再刺激cd4+t细胞。
[0329]
在静止状态下在不具有肽(无肽)或具有肽(p2或p4)的情况下与自体lcl共培养过夜之后，通过流式细胞术分析tcr诱导的表面活化标志物cd154(cd40l)表达来评价肽产生抗原特异性cd4+t细胞的能力。在静止状态下在不具有肽(无肽)或具有肽(p4)的情况下与自体lcl共培养过夜之后，也通过流式细胞术分析来评价裂解标志物fas配体(cd178)的表面表达。
[0330]
在静止状态下在不具有肽(无肽)或具有肽(p2或p4)的情况下与自体mdc共培养过夜之后，通过流式细胞术分析来评价肽诱导cd4+t细胞培养物上清液中细胞因子分泌的能力。用legendplex人th板(13-plex)(biolegend，740721)根据供应商的建议分析上清液。
[0331]
通过量化在用作抗原呈递细胞的lcl上诱导的凋亡来评价抗原特异性cd4+t细胞的溶细胞活性。将荧光标记的加载或未加载肽(p4)的自体lcl在静止状态下与特异性cd4+t细胞共培养过夜，并通过流式细胞术经膜联蛋白v染色来量化lcl凋亡。考虑到用作对照的未经加载的lcl的凋亡百分比，如下计算特异性凋亡百分比：
[0332][0333]
p2的结果
[0334]
能够从四个不同的ms患者(ms017、ms022、ms026和ms027)中产生p2特异性cd4+t细胞系。示出了用p2刺激三个患者的cd4+细胞系(ms017(s9)、ms022(s10)和ms027(s12))诱导高频率的效应细胞(cd3+cd4+cd154+)(图11)。此外，观察到在ms026 cd4+细胞系(s11)的培养上清液中由p2诱导的细胞因子(il-5和il-13)的特异性分泌(图12)。
[0335]
p4的结果
[0336]
能够从八个不同的ms患者(ms017、ms020、ms021、ms024、ms026、ms027、ms028和ms029)中产生p4特异性cd4+t细胞系。示出了用p4刺激八个患者的cd4+细胞系(ms017(s12)、ms020(s7)、ms021(s9)、ms024(s7)、ms026(s12)、ms027(s12)、ms028(s11)和ms029(s9))诱导高频率的效应细胞(cd3+cd4+cd154+)(图13)。还示出了对于患者ms017(s9)和ms020(s10)的cd4+细胞系，用p4刺激诱导表达裂解标志物fas配体的效应细胞(cd3+cd4+cd154+fasl+)的特异性提高(图14)，从而表明p4能够诱导称为溶细胞性cd4+t细胞的具有裂解特性的特异性cd4+t细胞。此外，观察到在ms017(s15)、ms024(s20)和ms026(s14)cd4+细胞系的培养上清液中由p4诱导的细胞因子(il-5)的特异性分泌(图15)。此外，示出了对于患者ms017(s14)和ms026(s13)的cd4+细胞系，在静止状态下将p4特异性cd4+细胞系与p4及其对应的短c-wt t细胞表位肽(序列：dphflrvpcwkitlfkk，seq id no：29)共培养过夜之后的效应细胞(cd3+cd4+cd154+)的特异性诱导(图16)。还示出了对于患者ms024(s20)、ms017(s9)、ms026(s13)、ms028(s11)和ms029(s9)的cd4+细胞系，在静止状态下将p4特异性cd4+细胞系与p4及其对应的短s-wt t细胞表位肽(序列：klhrtfdphflrvpsvvkitlfk，seq id no：253)共培养过夜之后的效应细胞(cd3+cd4+cd154+)的特异性诱导(图17)。此外，观察到在ms017(s15)cd4+细胞系的培养上清液中由p4肽及其对应的短c-wt和长c-wt t细胞表位肽(短序列：dphflrvpcwkitlfkk(seq id no：29)，或长序列：qyrlrgklraeienlhrtfdphflrvpcwkitlfvivpvlgp，seq id no：30)诱导的细胞因子(il-5)的特异性分泌(图18)。还观察到在ms017(s12)和ms024(s20)cd4+细胞系的培养上清液中由p4肽及其对应的短s-wt t细胞表位肽(序列：klhrtfdphflrvpswkitlfk，seq id no：253)诱导的细胞因子(il-5)的特异性分泌(图19)，从而表明p4特异性cd4+t细胞能够与呈递wt mog表位序列的apc交叉反应。
[0337]
最后，示出了当经标记的加载有p4肽或其对应的短s-wt t细胞表位肽(序列：klhrtfdphflrvpswkitlfk，seq id no：253)的自体lcl与来自患者ms017(s7)、ms026(s12)、ms028(s11)和ms029(s9)的p4特异性cd4+t细胞系共培养时，特异性lcl凋亡百分比提高，这进一步表明了p4诱导的溶细胞性cd4+t细胞的裂解活性(图20)。
[0338]
实施例6：p4或imcy-0189肽的治疗性施用对小鼠中实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental auto-immune encephalomyelitis，eae)发生的作用。
[0339]
小鼠组和给药
[0340]
研究使用了总共48只雌性c57bl/6小鼠(taconic biosciences，第0天时9周龄)。使小鼠在第一次注射之前适应7天。在研究开始时，以平衡的方式将小鼠分配至组以实现组间相似的平均体重。下表2示出了施用于各组的处理。
[0341]
表2-处理方案
[0342]
组#动物处理(s.c.)给药日目的116盐水4、9、14、19阴性对照216imcy-01894、9、14、19测试316p44、9、14、19测试
[0343]
所有小鼠的给药在表2中所指示的每一天以0.05ml/部位的体积s.c.进行一次，每只小鼠在两个部位接受注射，总共0.1ml/小鼠/给药日。imcy-0189或p4肽的总剂量为每次施用30μg。
[0344]
所有给药均在每个给药日的相同时间(+/-1小时)进行。
[0345]
化合物制备
[0346]
对于盐水处理，在每个给药日制备0.9％nacl溶液。
[0347]
imcy-0189肽制备：
[0348]
在使用之前立即溶解具有序列hcpycgwyrspfsrvvhlyr(seq id no：260)的冻干免疫原性肽imcy-0189，其包含氧化还原酶基序hcpyc(seq id no：24)、接头gw、鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog
35至55
)mhcii t细胞表位yrspfsrw(seq id no：261)和侧翼序列hlyr(seq id no：262)(smart bioscience)。将冻干的imcy-0189在室温下解冻10分钟，重悬于50mm nacl 0.9％ph 5.4的乙酸钠缓冲液中，并在室温下孵育10分钟。然后在注射之前，将重构的肽与imject
tm
明矾佐剂混合。
[0349]
p4肽制备：
[0350]
在使用之前立即溶解具有序列khcpycvryflrvpswkitlfkk(seq id no：27)的冻干免疫原性肽p4，其包含氧化还原酶基序khcpyc(seq id no：50)、接头vry、人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog
201至212
)mhcii t细胞表位flrvpswki(seq id no：2)和侧翼序列tlfkk(seq id no：263)(smart bioscience)。将冻干的p4在室温下解冻10分钟，重悬于50mm nacl 0.9％ph 5.4的乙酸钠缓冲液中，并在室温下孵育10分钟。然后在注射之前，将重构的肽与imject
tm
明矾佐剂混合。
[0351]
eae诱导
[0352]
如下在所有小鼠中诱导eae：
[0353]
第0天，第0小时-用与mog(mog
35至55
)/cfa的第35至55位氨基酸对应的肽进行免疫接种
[0354]
第0天，第2小时-注射百日咳(pertussis)毒素
[0355]
第1天，第0小时-第2次注射百日咳毒素(在初始免疫接种之后24小时)。
[0356]
在小鼠背部的两个部位处皮下注射hooke kit
tm
mog
35至55
/cfa乳剂ptx(目录号ek-2110(批次号131，hooke实验室，lawrence ma))的乳剂组分(包含mog
35至55
)。一个注射部位在上背部区域，颈线(neck line)尾部约1cm处。第二部位在下背部区域，尾基部的颅骨(cranial)约2cm处。每个部位处的注射体积为0.1ml。每只小鼠接受200μg的mog
35至55
。
[0357]
在注射乳剂的2小时内腹膜内施用试剂盒中的百日咳毒素组分，并且随后在注射乳剂之后24小时时再次腹膜内施用试剂盒中的百日咳毒素组分。对于两次注射，将百日咳毒素(批次号1008，hooke实验室)以90ng/剂进行施用，并且每次注射的体积为0.1ml。
[0358]
eae评分
[0359]
从第7天开始至研究结束每天对动物进行评分。通过不知道每只小鼠的处理和先前评分二者的人来盲法进行评分。对eae以标度0至5进行评分，如下表3中所示。当临床体征落在两个以上限定的评分之间时，指定中间评分。
[0360]
表3-eae评分标准
[0361]
评分临床观察结果0运动功能无明显变化1尾疲软(limp tail)2尾疲软并且后腿无力3尾疲软并且后腿完全瘫痪4尾疲软，后腿完全瘫痪并且前腿部分瘫痪5后腿完全瘫痪并且前腿完全瘫痪，或因瘫痪而死亡
[0362]
血清神经丝水平确定
[0363]
在第28天，从所有小鼠中收集血液到凝胶凝块活化剂管中，并使其在室温下凝结约30分钟。然后将血液在约10000g下离心5分钟。将血清转移到eppendorf管中，并在-80℃下储存直至装运至quanterix
tm
。使用nf-light advantage试剂盒(用于定量确定血清、血浆和csf中nf-l的数字免疫测定)对血清神经丝轻(nf-l)蛋白水平进行定量。所使用的抗体(uman diagnostics,sweden)也与鼠、牛和猕猴的nf-l表位交叉反应，并且因此，该测定可用于使用这些物种的研究。所有样品都以40
×
的稀释因子一式两份地进行测试。
[0364]
终末收集
[0365]
在研究结束时，对所有小鼠实施安乐死，并且收集脊柱并放置于10％缓冲的福尔马林中以用于组织学分析。
[0366]
组织学
[0367]
对于每个脊柱，制备一个h&e染色的载玻片和一个抗mbp染色的载玻片并进行分析。每张载玻片包含具有来自腰、胸和宫颈的脊髓的样品(3个样品)的切片。所有分析均由对实验组和所有临床读出不知情的病理学家进行。
[0368]
在各h&e染色切片中对约20个细胞的炎性病灶进行计数。当炎性浸润由多于20个细胞组成时，对存在多少20个细胞的病灶进行估计。
[0369]
在各抗mbp(使用免疫组织化学)染色的切片中对脱髓鞘进行评分。在抗mbp切片中，观察到脱髓鞘为白质束中明显未染色区域并且与大液泡的存在相关。脱髓鞘评分表示对各切片的脱髓鞘面积的估计，如下：
[0370]0–
无脱髓鞘(小于5％的脱髓鞘面积)
[0371]1–
5％至20％的脱髓鞘面积
[0372]2–
20％至40％的脱髓鞘面积
[0373]3–
40％至60％的脱髓鞘面积
[0374]4–
60％至80％的脱髓鞘面积
[0375]5–
80％至100％的脱髓鞘面积
[0376]
统计学分析
[0377]
通过进行普通单因素anova来分析auc、mms、炎症和脱髓鞘以及nf-l水平定量数据。使用holm-sidak方法进行多重性的调整。如下参考显著性差异：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0378]
结果和数据解释
[0379]
eae评分
[0380]
通过将所有组的临床eae读出与阴性对照(盐水)组的进行比较来评价eae发生。eae评分、auc(曲线下面积)和mms(平均最大评分)在图21、22和23中给出。
[0381]
盐水组(阴性对照)的小鼠在该模型的预期范围内发生eae。该组中无小鼠死亡。
[0382]
与阴性对照组相比，用imcy-0189或用p4处理的小鼠显示出推迟的疾病发作和降低的终点评分，以及统计学上显著降低的auc和mms。这三组中无小鼠死亡。
[0383]
组织学
[0384]
通过将所有组的炎症和脱髓鞘水平与阴性对照(盐水)组的进行比较来评价组织学读出。炎症和脱髓鞘数据在图24和25中给出。
[0385]
盐水组(阴性对照)的组织学结果与临床发现一致，并且如针对该模型所预期的。
[0386]
用imcy-0189处理的小鼠显示出统计学上显著降低的炎症和脱髓鞘二者的水平。用p4处理的小鼠显示出降低的脱髓鞘水平和降低的炎症水平。组织学分析的结果与临床发现一致。
[0387]
血清神经丝水平
[0388]
神经丝轻(nf-l)是在神经元中表达的68kda的细胞骨架丝蛋白，作为向轴突提供结构支持的神经元细胞骨架的主要组分之一。可在轴突损伤或神经元变性之后释放神经丝。已显示出nf-l与神经退行性疾病例如多发性硬化相关。
[0389]
通过将所有组的nf-l水平与阴性对照(盐水)组的进行比较来评价轴突损伤。数据在图26中给出。
[0390]
盐水组(阴性对照)的nf-l水平与临床发现一致，并且如针对该模型所预期的。
[0391]
与阴性对照组相比，用imcy-0189处理的小鼠显示出统计学上显著降低的nf-l水平。与阴性对照组相比，用p4处理的小鼠也显示出统计学上显著降低的nf-l水平。
[0392]
实施例7：包含与hcpyc氧化还原酶基序连接的mog
35至55
mhcii t细胞表位的免疫原性肽的预防性施用对小鼠中实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)发生的作用。
[0393]
eae诱导
[0394]
通过以下在接受体小鼠中诱导eae：用mog
35至55
/cfa免疫接种供体b6.sjl小鼠，并且随后，11天之后，通过获取他们的脾并在培养物中用mog
35至55
肽将脾再刺激3天。在第0天将目前完全致脑炎(encephalitogenic)的那些细胞注射到接受体小鼠组中，所述小鼠发生eae。
[0395]
供体小鼠
[0396]
在研究开始之前，使b6.sjl供体小鼠适应13天，并且在免疫接种时为9周龄。如下使用供体小鼠以产生致脑炎细胞：
[0397]
第-14天：用mog
35至55
/cfa进行免疫接种。
[0398]
第-3天：收获脾。对小鼠实施安乐死并收集脾，将脾合并并制备细胞悬液。将t150烧瓶中400万至500万细胞/ml的细胞悬液在培养物中在存在mog
35至55
肽(20μg/ml)、il-12(20μg/ml)和抗ifnγ(7μg/ml)的情况下建立3天以产生致脑炎t细胞。
[0399]
第0天：细胞收集和转移。收集细胞并旋转沉淀，重悬于rpmi1640(无fcs)中，计数，并以每只小鼠1000万个细胞注射到接受体小鼠中。
[0400]
小鼠(接受体小鼠)组和给药
[0401]
在第一次注射之前，使接受体小鼠适应6天并在处理开始(在第-21天)时为6周龄。在研究开始时，以平衡的方式将小鼠分配至组以实现组间相似的平均体重。下表4示出了施用于各组的处理。
[0402]
表4-接受体小鼠组和处理
[0403]
组#小鼠处理(s.c.)给药日目的116明矾-21、-14、-7、+2、+9阴性对照216imcy-0189-21、-14、-7、+2、+9测试
[0404]
所有小鼠的给药在表4中所指示的每一天以0.05ml/部位的体积s.c.进行一次，每只小鼠在两个部位接受注射，总共0.1ml/小鼠/给药日，对应于100μg肽。
[0405]
所有给药均在每个给药日的相同时间(+/-2小时)进行。
[0406]
化合物制备
[0407]
对于载剂处理，在每个给药日制备imject
tm
明矾溶液。imcy-0189具有实施例6中所述的序列。将冻干的imcy-0189在室温下解冻10分钟，重悬于50mm ph 5.4的乙酸钠缓冲液中，并在室温下孵育5分钟。然后在注射之前，将重构的肽与imject
tm
明矾佐剂混合。
[0408]
血浆神经丝水平确定
[0409]
在终止时，从所有小鼠中收集血液到包含k2edta的管中并轻轻混合。然后将血液在约10000g下离心5分钟。将血浆转移到eppendorf管中，并在-80℃下储存直至装运至quanterix
tm
。如实施例6中所述，使用nf-light advantage试剂盒对血浆神经丝轻(nf-l)蛋白水平进行定量。
[0410]
如实施例6中所述进行eae评分、终末收集、组织学分析和统计学分析。
[0411]
结果和数据解释
[0412]
eae评分
[0413]
通过将受试组(imcy-0189)的临床eae读出与阴性对照组(明矾)的进行比较来评价eae发生。eae评分、auc(曲线下面积)和mms(平均最大评分)在图27、28和29中给出。
[0414]
对于该模型，明矾组(阴性对照)的小鼠发生典型的eae。该组中无小鼠死亡。
[0415]
与阴性对照组相比，用imcy-0189处理的小鼠的所有临床读出(疾病发作、终点评分、auc和mms)在统计学上显著改善。该组中无小鼠死亡。
[0416]
组织学
[0417]
通过将受试组(imcy-0189)的炎症和脱髓鞘水平与阴性对照组(明矾)的进行比较来评价组织学读出。炎症和脱髓鞘数据在图30和31中给出。
[0418]
明矾组(阴性对照)的组织学结果与临床发现一致，并且如针对该模型所预期的。
[0419]
用imcy-0189处理的小鼠显示出统计学上显著降低的炎症和脱髓鞘二者的水平。
组织学分析的结果与临床发现一致。
[0420]
血浆神经丝水平
[0421]
神经丝轻(nf-l)是在神经元中表达的68kda的细胞骨架丝蛋白，作为向轴突提供结构支持的神经元细胞骨架的主要组分之一。可在轴突损伤或神经元变性之后释放神经丝。已显示出nf-l与神经退行性疾病例如多发性硬化相关。
[0422]
通过将受试组(imcy-0189)的nf-l水平与阴性对照组(明矾)的进行比较来评价轴突损伤。数据在图32中给出。
[0423]
明矾组(阴性对照)的nf-l水平与临床发现一致，并且如针对该模型所预期的。
[0424]
与阴性对照组相比，用imcy-0189处理的小鼠显示出统计学上显著降低的nf-l水平。