间充质谱系前体或干细胞的3D培养的制作方法

本公开涉及不含血清的干细胞培养的经改进的方法，具体地涉及生物反应器中的3d培养以及供所述培养使用的细胞培养基和组合物。

背景技术：

1、多能间充质谱系细胞(mlc)因其高增殖和分化潜能以及免疫调节和其它有益特性而被提出作为治疗应用的有吸引力的候选物(caplan ai(2007)《细胞生理学杂志(j.cellphysiol.)》,213,341-347；prockop dj(2007)《临床药理学与治疗学(clin pharmacolther.)》,82,241-243)。然而，面临的最重要且最紧迫的挑战之一是，需要将细胞产物的高度个体化的体外要求转化为可再现、稳健且安全的大规模流线型生物过程。

2、用于分离和扩增msc的常规培养基由限定的基础培养基(例如杜氏改良伊氏培养基(dulbecco's modified eagle's medium，dmem)或α改良最小必需培养基(α-mem))组成，所述培养基由于其高含量的刺激生长因子而补充有胎牛血清。虽然这些培养基总体上被报告为支持多次传代的msc的增殖，但是已经出现了对由于与胎牛血清相关联的潜在风险的担忧(dimarakis和levicar(2006)《干细胞(stem cells)》,24,1407–1408；mannello和tonti(2007)《干细胞》,25,1603–1609)。具体地，胎牛血清可能含有有害污染物，如朊病毒、病毒和人畜共患病介质，并可能引发免疫反应。此外，胎牛血清的不良定义的性质以及其高度批次间差异可能使培养基的生长支持特性不一致，并因此使得细胞产生过程的标准化变得困难。

3、已经研究了人来源的补充物，如人血清和血小板裂解物，作为胎牛血清的替代物。人血清通常不被视为合适的替代物，因为其缺乏可用性并且其促生长潜力不一致。最近已提出将人血小板源性补充物，如血小板裂解物(hpl)和富含血小板的血浆，作为优质替代品(doucet等人(2005)《细胞生理学杂志》,205,228–236；muller等人(2006),《细胞疗法(cytotherapy.)》8,437–444；capelli等人(2007)《骨髓移植术(bone marrowtransplant.)》,40,785–91；lange等人(2007)《细胞生理学杂志》,213,18–26；reinisch等人(2007)《再生医学(regen med.)》,2,371–82)。尽管这些研究表明合并的人血小板衍生物具有相当大的促生长特性，但其对mlc生长的影响不一致(bieback等人(2008)《移注医学和血液疗法(transfus med hemother.)》,35,286–294)。此外，这些hpl调配物的高成本可能阻止商业细胞培养的脚步。

4、因此，对于支持在不含胎牛血清的细胞培养物中分离和快速扩增msc的有成本效益的方法的需求仍未得到满足。

技术实现思路

1、诸位发明人发现，胎牛血清在三维(3d)生物反应器培养中是间充质谱系或干细胞生长的令人惊讶地不良的刺激物，但其在二维(2d)环境中是间充质谱系或干细胞生长的有效刺激物。因此，诸位发明人注意到，在2d环境中有效的生长培养基在3d环境中可能无效。此外，通过从培养基中去除动物血清，诸位发明人发现其它非动物生长刺激物，如人血小板裂解物(hpl)，在促进干细胞在3d环境中的生长方面特别有效。因此，在一实例中，本公开涉及一种在三维培养中培养间充质谱系前体或干细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述细胞培养基是不含动物血清的。

2、hpl包括各种生长因子，如血小板源性生长因子(pdgf)、成纤维细胞生长因子2(fgf2)和表皮生长因子(egf)。诸位发明人发现了pdgf和fgf2在3d环境中促进间充质谱系或干细胞的重要性。因此，在一实例中，所述培养基是不含动物血清的并且包括pdgf和fgf2。在另一实例中，所述培养基进一步包括egf。在一实例中，在生物反应器中培养所述间充质谱系前体或干细胞。

3、诸位发明人还发现，当所述培养基不含动物血清时，在3d培养中在粘附材料上培养间充质谱系或干细胞对于在3d环境中生长是重要的。因此，在另一实例中，本公开涉及一种在三维培养中培养间充质谱系前体或干细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中的粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上，并且其中所述细胞培养基是不含动物血清的。在一实例中，所述培养基进一步包括pdgf和fgf2。在另一实例中，所述培养基进一步包括egf。在一实例中，在生物反应器中培养所述间充质谱系前体或干细胞。在一实例中，所述粘附材料为微载体。

4、诸位发明人随后发现，在3d培养中在某些粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞是有问题的，因为活细胞数量在峰细胞密度处或附近显著下降。令人惊讶的是，此问题通过在某些粘附材料，特别是可降解微载体，如具有可降解芯的那些微载体和/或低密度的微载体上培养间充质系或干细胞而得以缓解。因此，在一实例中，所述微载体是可降解的。在另一实例中，所述微载体具有可降解芯。在另一实例中，所述微载体具有碳水化合物聚合物或糖蛋白芯。

5、在各个实例中，如微载体等所述粘附材料可以是包被的。在一实例中，所述粘附材料是包被的。在另一实例中，所述微载体是包被的。在一实例中，用糖蛋白包被所述粘附材料或所述微载体。在一实例中，所述糖蛋白为胶原蛋白或玻连蛋白。在一实例中，所述玻连蛋白为人玻连蛋白或其合成模拟物。玻连蛋白的合成模拟物能够与间充质谱系前体或干细胞结合并支持间充质谱系前体或干细胞在其表面上生长。在另一实例中，所述糖蛋白是合成的。因此，在一实例中，本公开涵盖3d细胞培养，其包括在细胞培养基中的粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上，其中所述细胞培养基是不含动物血清的，并且其中用如粘连蛋白或胶原蛋白等糖蛋白包被所述粘附材料。

6、在另一实例中，所述微载体包括碳水化合物聚合物芯，其中所述碳水化合物聚合物以钙依赖性方式连接。

7、在一实例中，所述微载体的密度为约0.5g/ml至5g/ml。在另一实例中，所述微载体的密度为约0.5g/ml至3g/ml。在一实例中，所述培养基包括0.5g/l至5g/l的微载体。在另一实例中，所述培养基包括0.5g/l至3g/l的微载体。在另一实例中，所述培养基包括0.5g/l至2g/l的微载体。在另一实例中，所述培养基包括约1g/l的微载体。

8、在一实例中，所述微载体是多孔的。在另一实例中，所述微载体是大孔的。

9、在一实例中，所述细胞培养基是不含动物组分的。

10、诸位发明人还惊奇地发现，在生物反应器培养中每24小时更换指定量的培养基与细胞生长的改善有关。因此，在一实例中，本公开的方法包括每培养24小时更换60％至80％的培养基。在另一实例中，本公开的方法包括每培养24小时更换约70％的培养基。在这些实例中，培养基更换可以从在生物反应器中培养的第2天至第4天开始。在一实例中，培养基更换从在生物反应器中培养的第3天开始。

11、在一实例中，本公开的方法进一步包括通过使间充质谱系前体或干细胞与解离剂接触而使间充质谱系前体或干细胞与所述粘附材料解离。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在达到峰细胞密度后与所述粘附材料解离。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在生物反应器中培养约7天后解离。

12、在一实例中，本公开的方法进一步包括使所述粘附材料或所述微载体降解。在一实例中，通过向所述培养基中添加酶使所述粘附材料或所述微载体降解。在一实例中，所述微载体包括玻连蛋白，例如，包被在玻连蛋白中，并且所述酶是为重组果胶酶。在此实例中，所述微载体可以包括以钙依赖性方式连接的碳水化合物芯，在钙依赖性方式的情况下，可以向所述培养基中添加edta和如重组果胶酶等酶。

13、在一实例中，将间充质谱系前体或干细胞在3d培养中以5,000个细胞/ml至20,000个细胞/ml接种。在另一实例中，将间充质谱系前体或干细胞以10,000个细胞/ml接种。

14、在一实例中，间充质谱系前体或干细胞已经从主细胞库中培养扩增。在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞已经从主细胞库中以二维培养格式培养扩增。

15、在另一实例中，本公开的方法进一步包括从培养基中回收细胞，并且冷冻保存所回收的细胞。在一实例中，将所回收的细胞在冷冻保存前进行洗涤和浓缩。

16、在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞在三维培养中培养至少6天，优选地5天至8天，更优选地7天。

17、在一实例中，所述生物反应器为搅拌釜生物反应器。在另一实例中，所述生物反应器为填充床生物反应器。在另一实例中，所述生物反应器为搅拌釜生物反应器和/或填充床生物反应器。

18、在另一实例中，本公开涵盖一种组合物，其包括间充质谱系前体或干细胞的群体和细胞培养基，其中所述细胞培养基是不含动物血清的并且包括粘附材料、pdgf和fgf2，并且其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上。在一实例中，所述粘附材料如上文所定义。例如，所述粘附材料可以为微载体。

19、在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞为间充质前体细胞或间充质干细胞。在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞为间充质前体细胞。在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞为间充质干细胞。

20、在一实例中，所述培养基中的所述pdgf为pdgf-bb。在一实例中，所述培养基包括介于3.0ng/ml与120ng/ml之间的pdgf-bb。在另一实例中，所述培养基包括介于2pg/ml与6ng/ml之间的fgf2。在另一实例中，所述培养基包括小于0.8ng/ml的fgf2。在另一实例中，所述培养基进一步包括egf。在另一实例中，所述培养基进一步包括介于0.08ng/ml与7ng/ml之间的egf。

21、在一实例中，所述培养基包括α最小必需培养基或不含胎牛血清的扩展培养基。在一实例中，所述培养基是不含血清的。在一实例中，所述培养基将所述干细胞维持在未分化状态下。

22、在另一实例中，本公开涉及一种在生物反应器中培养干细胞的方法，所述方法包括在包括细胞培养基的生物反应器中培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述细胞培养基是不含动物血清的并且包括血小板源性生长因子(pdgf)和成纤维细胞生长因子2(fgf2)以及任选地egf。因此，在本实例中，所述培养基可以包括egf。