与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的单域抗体的制作方法

发明领域本发明提供改进的靶向sars-cov-2的单域抗体、所述单域抗体在治疗和/或预防冠状病毒中的用途，以及所述单域抗体在使用各种方法、测定和试剂盒检测和诊断冠状病毒中的用途。

背景技术：

0、发明背景

1、单域抗体或纳米抗体是源自骆驼科免疫球蛋白的仅重链子集的重组抗原特异性可变域(vhh)。它们的小分子尺寸、易于表达、高亲和力和稳定性相组合使它们成为独特的靶向试剂，在生物医学科学中有许多应用。纳米抗体已经成为传统抗体的替代品，用于诊断试剂的开发，并用于非侵入性生物成像。正在一些适应症中探索纳米抗体的治疗潜力，所述适应症包括肿瘤和炎症性疾病(revets,de baetselier等人，2005；chanier和chames，2019)。

2、最新出现的sars-冠状病毒2(sars-cov-2)(zhou，yang等人，2020)已经使注意力集中到纳米抗体在病毒学中的用途，以研究病毒的基本生物学，但也作为可能的抗病毒剂。显然，需要了解sars-cov2的关键蛋白的结构-功能关系以开发疫苗和疗法。与其他冠状病毒一样，sars-cov2的单正链rna基因组编码四种主要的结构蛋白，即刺突蛋白(s)、包膜蛋白(e)、膜蛋白(m)和核衣壳蛋白(np)。其中，s蛋白在病毒附着、融合和进入宿主细胞中起着关键作用，包含负责病毒受体结合的n端(s1)亚单位和介导膜融合的c端结构域(s2)(li2016)。sars-cov2的细胞表面受体，像相关的冠状病毒sars-cov一样，是血管紧张素转化酶2(ace-2)，已将相互作用定位到s1中的大约300个氨基酸的受体结合域(rbd)(wan,shang等人，2020，yan,zhang等人，2020)。

3、我们报告了通过噬菌体展示技术在体外筛选天然美洲驼vhh库，令人惊讶地鉴定了一些对rbd具有高亲和力的纳米抗体。我们已经分析了具有最高亲和力(kd＝5.2nm)的vhh的结合性质，其阻断ace-2和sars-cov-2的rbd结构域之间的相互作用。

4、目前，对于由sars-cov-2引起的疾病covid-19没有治疗方法，因此存在对有效治疗方法的迫切需要。此外，需要合适的用于快速且有效地检测sars-cov-2的工具，以实现对病毒的准确诊断和监测。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明提供特异性地与sars-cov-2的s蛋白的受体结合域结合的单域抗体。

2、第一方面，提供包含互补决定区，互补决定区3(cdr3)的单域抗体。

3、第二方面，提供包含cdr2和cdr3的单域抗体。

4、第三方面，提供包含cdr1、cdr2和cdr3的单域抗体。

5、另一方面，提供抗sars-cov-2单域抗体，其包含与选自以下的序列具有至少70％的同一性的氨基酸序列：seq 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、101、102、103、104、105、106和107。

6、另一方面，提供编码本发明的单域抗体的多核苷酸序列。

7、又一方面，提供本发明的单域抗体的亲和力成熟的突变体。

8、又一方面，提供用于制备本发明的单域抗体的方法。

9、又一方面，提供包含本发明的单域抗体的药物组合物。

10、又一方面，提供用于医药的本发明的单域抗体或本发明的药物组合物。

11、又一方面，提供用于治疗受试者中的冠状病毒的方法，其包括给予受试者治疗活性量的本发明的单域抗体。

12、又一方面，提供本发明的单域抗体在制备用于治疗和/或预防冠状病毒的药物中的用途。

13、又一方面，提供用于检测冠状病毒蛋白的方法。

14、又一方面，提供用于诊断受试者中的冠状病毒感染的方法。

技术特征：

1.一种抗sars-cov-2单域抗体，其包含选自seq id no：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的互补决定区3(cdr3)，其中cdr3的氨基酸序列包含0至7个氨基酸修饰。

2.根据权利要求1所述的抗sars-cov-2单域抗体，其中所述单抗体结构域包含

3.根据权利要求1所述的抗sars-cov-2单域抗体，其中所述单抗体结构域包含

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗sars-cov-2单域抗体，其中所述氨基酸修饰是取代、插入或删除。

5.根据权利要求1至4所述的抗sars-cov-2单域抗体，其包含：

6.根据权利要求1至4所述的抗sars-cov-2单域抗体，其包含：

7.权利要求1至6所述的抗sars-cov-2单域抗体，其中所述单域抗体还包含四个框架区(fr1、fr2、fr3和fr4)。

8.权利要求1所述的抗sars-cov-2单域抗体，其包含与选自以下的序列具有至少70％的同一性的氨基酸序列：seq 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、101、102、103、104、105、106和107。

9.权利要求8所述的抗sars-cov-2单域抗体，其包含选自以下的氨基酸序列：seq idno：87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98和99。

10.一种编码根据权利要求1至9所述的单域抗体的多核苷酸。

11.一种包含权利要求10所述的多核苷酸的表达载体。

12.一种包含根据权利要求11所述的载体的宿主细胞或细胞系。

13.一种用于制备单域抗体的方法，其包括在表达表达载体的多核苷酸序列的条件下，在培养基中培养根据权利要求12所述的宿主细胞。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9所述的单域抗体。

15.根据权利要求1至9所述的单域抗体或根据权利要求14所述的药物组合物，其用于医药。

16.根据权利要求1至9所述的单域抗体或根据权利要求14所述的药物组合物，其用于冠状病毒感染的治疗或预防。

17.一种用于治疗或预防冠状病毒的方法，所述方法包括给予受试者治疗活性量的根据权利要求1至9中任一项所述的单域抗体。

18.根据权利要求1至9所述的单域抗体在制备用于治疗冠状病毒的药物中的用途。

19.根据权利要求16所述的所使用的单域抗体、或根据权利要求17所述的用于治疗或预防冠状病毒的方法、或根据权利要求18所述的单域抗体的用途，其中所述冠状病毒选自中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒1型(sars-cov-1)和covid-19。

20.一种包含根据权利要求1至9所述的单域抗体的药物装置，其中所述药物装置适合经由吸入递送所述单域抗体。

21.一种用于诊断受试者中的冠状病毒感染的方法，所述方法包括：

22.一种用于检测受试者中的冠状病毒蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤

23.一种用于检测来自患者的样品中的冠状病毒蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤

24.权利要求21、22或23中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒选自中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒1型(sars-cov-1)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sars-cov-2)。

25.一种用于检测冠状病毒的测定，其中所述测定包括使从患者获得的样品与权利要求1-16中任一项所述的单域抗体接触，其中所述单域抗体包含可检测标记分子或报道分子以选择性地分离患者样品中的冠状病毒，任选地，其中所述测定是酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)或荧光激活细胞分选(facs)。

26.一种用于检测冠状病毒的试剂盒，其中所述试剂盒包含：

技术总结
本发明涉及改进的靶向SARS‑CoV‑2的单域抗体、所述单域抗体在治疗和/或预防冠状病毒中的用途，以及所述单域抗体在使用各种方法、测定和试剂盒检测和诊断冠状病毒中的用途。

技术研发人员：霍健东,R·欧文斯,J·奈史密斯,D·斯图尔特
受保护的技术使用者：罗莎琳德·富兰克林研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15