用于增强聚烯烃材料的生物可降解性的方法

本发明涉及一种用于增强聚烯烃材料的生物可降解性的方法。

背景技术：

1、近50年来，合成聚合物以其例如轻重量、可调的物理性能、低成本、易加工等有利特征，已经在广泛应用中涌入了我们的生活。特别地，聚烯烃(po)构成了最广泛使用的聚合物材料，并几乎占城市固体废物的总塑料含量的60％。全世界的po回收率低于10％，剩下的废物材料主要来自于被不适当地丢弃的一次性包装。因为塑料材料的广泛弃置和生物持久性的缺点，发现塑料材料在世界各地的环境中积累，对野生动物造成破坏性影响。因此，开发一项避免聚合物废物累积到环境中的策略的必要性，已经变得十分紧急。

2、基于生物技术的策略可以通过利用酶催化的特异性和选择性，实现增强生物降解并获得特定高价值产品。alshehrei f.[alshehrei f.2017.journal of applied&environmental microbiology,第5卷(1):8]公开了通过微生物酶的攻击来诱导塑料的生物降解的潜力；然而，这些方法的效率仍然很低，且还不能构成大规模减少塑料废物的可靠方法。

3、restrepo-flórez等人[restrepo-flórez et al.int.biodeterior.biodegrad.2014,88,83-90]描述了聚烯烃对微生物攻击的抗性。sheik等人[sheik etal.international biodeterioration&biodegradation.105(2015):21]描述了低密度聚乙烯(ldpe)在暴露于200至1000kgy剂量的伽玛辐射后形成羰基，而较低剂量则无效，并且有证据表明真菌对用最高剂量照射的ldpe条的塑料降解是有效的。与材料工业中常用的剂量相比，实验中采用的吸收剂量非常高，即，10-30kgy用于杀菌，20-50kgy用于催化聚合和接枝，50-150kgy用于诱导交联。由于需要高水平的能量，这种预处理可能难以适用于在工业水平上处理大量的废物聚合物材料。因此，开发可替代的可持续预处理方法的必要性仍然至关重要。旨在增加聚烯烃的生物可降解性的预处理方法的价值，与即将向工业转移的可靠性严格相关。

4、旨在生物降解pe所面临的第二个挑战是识别有效的生物技术工具(酶/微生物)。值得注意的是，所述用于诱导降解其他商业扩散塑料(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)或尼龙)的酶对聚烯烃的降解完全无用。事实上，前者含有可水解的酯键或酰胺键，而聚烯烃链则完全由碳原子和氢原子构成。与前者相比，c-c和c-h键的能量很高且难以断裂。事实上，由于缺乏活性炭，c-c和c-h键不容易通过水分子的氧的亲核攻击而水解。

5、用于诱导pe生物降解的微生物通常通过筛选未知微生物群落和评估其降解潜力来“盲目”选择。膜或粉末形式的聚合物，与在垃圾场收集的含有微生物菌群(consortia)的土壤一起培养。分离出能够使用pe作为唯一碳源生长的微生物，并可能地对参与生物降解的酶进行进一步表征。yang[yang等人，environ.sci.technol.2014,48,13776]和bertocchini[bombelli等人，current biology 27,r283–r293,april 24,2017]的工作代表了该方法的一个示例，该工作独立地鉴定了一些食用聚烯烃材料的蠕虫。主要的实验证据为pe被蠕虫粉碎并吞咽。此外，作者提出了潜在的生物降解活性的不稳定证据。在细节方面，yang从蠕虫肠道中分离出一些细菌菌株，但没有确定任何假定的相关酶。bertocchini在将蠕虫匀浆涂抹在聚乙稀膜表面后检测到一些活性。但没有分离出特定的微生物，也没有鉴定出任何酶。此外，weber等人认为，bertocchini的实验缺乏与阴性对照的比较，以证明检测到的信号可以归因于生物降解的pe，而不是来自蠕虫匀浆的生物材料。结论是，塑料材料明显的宏观消耗可以归因于蠕虫的咀嚼和吞咽，而不是真正的生物降解。而且必须考虑到，这种粉碎活动产生的微塑料比大塑料废物对环境和野生动物的危害大得多。

6、文献中描述的旨在合理选择用于pe生物降解的生物技术工具唯一办法是考虑到漆酶(laccases)降解木质素(最持久的天然生物聚合物)的能力，尝试采用漆酶。这些酶是由白腐真菌(white-rot fungi)分泌的，而且能够催化(多)酚类底物(例如木质素)的氧化。尽管漆酶的氧化还原电位较低(0.5至0.8v)，这将限制这些酶对唯一的酚类物种的活性，但这一类酶被成功地用于降解非酚类芳香族持久性污染物，例如染料、农药、多环芳烃、激素类化学品等[xiaoting jin等人，2016.conditions optimizing and application oflaccase-mediator system(lms)for the laccase catalyzed pesticidedegradation.scientific reports.6:35787]。这种应用被所谓的漆酶介体系统(lms)所允许，其需要氧化还原介体的加入。与这种lms相关的限制是介体的高成本，且需要高介体/底物比率(从5:1至100:1或更大)。此外，考虑到饱和聚烯烃链的可氧化性显著低于芳香族化合物的可氧化性，用开发用于氧化芳香族底物的像lms这样的系统来氧化聚乙烯，预期具有非常低的效率。事实上，由mayer和staples[laccase:new functions for an oldenzyme.phytochemistry 60(2002)551–565]公开的lms不仅氧化芳香化合物，而且氧化脂肪族化合物的潜力明确仅限于多不饱和和芳香烯丙醇，其特征在于密集不饱和和电子离域，由于自由基反应中间体的稳定性而导致的高反应性。因此，漆酶(以及分泌漆酶的微生物)不代表用于聚烯烃材料生物降解的有前景的候选材料。

7、因此，市场上需要一种用于增强聚烯烃材料的生物可降解性的方法，该方法需要少的能源、低成本试剂、环境可持续性、其是高效的、适用于处理大量的聚烯烃材料，其使用能够降解聚烯烃材料的高效生物技术工具。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的在于提供一种用于增强聚烯烃材料的生物可降解性的方法，该方法需要少的能源、低成本试剂、环境可持续性、其是高效的、适用于处理大量的聚烯烃材料，其使用能够降解聚烯烃材料的高效生物技术工具。

2、该目的通过所附权利要求中概述的方法实现，权利要求的限定构成了本专利申请的组成部分。

3、特别地，本发明的第一个目的涉及一种用于增强聚烯烃材料的生物可降解性的方法,其包括以下步骤：

4、a.提供聚烯烃材料；

5、b.将聚烯烃材料与至少一种脂肪试剂混合，脂肪试剂/聚烯烃材料的重量比为1/5至1/1；

6、c.加热与至少一种脂肪试剂混合的聚烯烃材料至所述聚烯烃材料的熔融温度，以获得熔融材料；

7、d.使所述熔融材料在室温下冷却足够的时间，以获得凝固产品；

8、e.将所述凝固产品与至少一种真菌菌丝体在至少一种真菌培养基的存在下进行培养，所述菌丝体选自分泌非特异性过加氧酶(unspecific peroxygenases)(upo)(ec1.11.2.1)的真菌菌株。

9、根据本发明的方法的优选实施方案，所述聚烯烃材料优选选自：低密度聚乙烯(ldpe)、聚丙烯(pp)、高密度聚乙烯(hdpe)。更优选地，所述聚烯烃材料为低密度聚乙烯(ldpe)。

10、根据本发明的方法的优选实施方案，所述至少一种脂肪试剂优选选自：脂肪酸(fa)、植物油。更优选地选自：油酸(oa)、橄榄油(oo)。

11、根据本发明的方法的优选实施方案，所述至少一种真菌菌丝体优选为杨树菇(agrocybe aegerita)菌丝体。

12、根据本发明的方法的优选实施方案，所述真菌培养基优选地包括钠、钾、镁、铁(ii)阳离子、硝酸根、磷酸氢根、硫酸根、氯阴离子且进一步地真菌培养基优选无任何碳源。术语“碳源”是指来自可以通过代谢反应获得碳的那些物质。碳源的一个非限制性示例为碳水化合物。

13、如本领域技术人员所知，碳源既可以具有结构功能(形成所述生物质的组分)，也可以用作能量来源。虽然像植物或蓝细菌这样的自养有机体可以利用大气或溶解的co2作为无机碳源，但菌丝体和其他异养有机体则依赖有机化合物。

14、更优选地，真菌培养基是包括硝酸钠、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化亚铁(ii)的改良察氏肉汤培养基。如本领域技术人员所熟知，察氏肉汤培养基是一种商业上已知的真菌生长培养基，但根据本发明的察氏肉汤培养基是通过只混合无机盐(硝酸钠、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化亚铁(ii))而不混合任何碳源来改进的，以迫使菌丝体消耗作为唯一可用的碳源的聚合物。

15、根据本发明的方法的优选实施方案，优选地，在步骤c和步骤d之间，所述方法还包括以下步骤：

16、·一旦达到聚烯烃材料的熔融温度，保持该温度4分钟至6分钟的时间；更优选为5分钟。

17、根据本发明的方法的优选实施方案，优选地，在所述方法的步骤d中，将熔融材料在室温下冷却4分钟至6分钟的时间。更优选为5分钟。

18、根据本发明的方法的优选实施方案，优选地，在所述方法的步骤e中，所述培养在23℃至29℃的温度，60％至90％的相对湿度(rh)下发生，持续1个月至5个月的时间。更优选地，温度为26℃，rh为70％至80％，时间为3个月。

19、根据本发明的方法的可替代实施方案，所述方法的步骤c和d优选依次重复1至5次。

20、本发明旨在开发一种有效的方法来解决塑料污染的环境问题，利用化学和生物技术来增强聚烯烃生物降解的潜力。特别地，所要求保护的方法集中在双重策略上，该策略包括设计预处理步骤，使用脂肪试剂，以帮助材料被真菌菌丝体定植，以及选择可以有效氧化聚烯烃材料的合适的真菌菌株。

21、在表达能够氧化和裂解饱和烃的失活的c(sp3)-h键的酶(主要是单加氧酶(monooxigenases)和过加氧酶)的那些菌株中寻找用于降解混合的ldpe生物的真菌菌株。

22、在潜在的酶和真菌菌株中，根据本发明优选的是真菌杨树菇(aae)[gupta等人，bmc genomics(2018)19:48；liers等人，fems microbiol ecol(2011)78:91]。

23、这种选择是由三个不同方面的结合造成的：

24、-aae表达一种过加氧酶(aaeupo)，能够氧化烷烃；

25、-已知一些细菌表达胞质或膜结合的氧化酶(cyt450或alkb家族)，作为胞质或膜结合酶的特性意味着其只能在微生物细胞内发挥其生物催化活性；相反，真菌降解酶是被分泌的，这消除了内化底物的需要。这一特性对聚烯烃的生物降解是决定性的，因为其允许攻击长链，所述长链超过～500da(相当于40c长的pe)的长度限制，这是能够穿过细胞膜的最大重量。

26、-像大多数真菌的细胞一样，杨树菇细胞生长为细长的、丝状结构，即菌丝，其形成一个密集的网，称为菌丝体；这也可以通过“挖掘”聚烯烃材料来发挥机械作用，类似于植物根的作用。

27、这些特性通过结合真菌菌丝体的机械压力和分泌的氧化酶的生物催化能力来实现协同的生物降解作用。

28、更具体地，本发明方法的步骤a至d针对的是聚烯烃材料的致密且高能的链堆积，其限制了酶的攻击，因为目标部分的流动性和可及性非常低。事实上，为了使生物催化的酶作用得以发生，底物的聚烯烃链必须进入催化袋并适当折叠，以适应它，并随后与酶形成活化的复合物。这个过程导致能量需求随着底物链的构象自由度的降低而增加。对聚烯烃进行专门的处理，旨在在酶攻击前松散聚烯烃链的紧密堆积，可能是促进随后酶裂解的关键。本发明的方法通过在略高于聚烯烃熔融温度(tm)的温度下，将聚烯烃材料与脂肪试剂(fa或植物油)混合，成功地解决了这一挑战。脂肪试剂有一个烃的尾部，其构象和刚度取决于其长度以及不饱和的存在和位置。该尾部会夹杂在聚烯烃的主体中，并干扰链堆积。此外，由于其极性头部(羧基或酯基)，其在聚烯烃基质内的整合能够破坏链之间的相互作用，导致聚烯烃材料的溶胀和软化。

29、本发明的方法的优点是需要少量的能量，仅需要将聚烯烃材料加热至其tm以上，而脂肪试剂可以来源于食品和油化学工业的废物。

30、根据本发明的方法的优选实施方案，所述优选的真菌菌丝体为白腐担子菌的真菌菌丝体：杨树菇(aae)。aae表达并分泌一种过加氧酶(aaeupo)，该酶能够氧化烷烃，并且如下面给出的示例所证明的，现在已经有利地证明其也能够降解聚烯烃。

31、此外，本发明的方法有利地采用了菌丝体网而不是单细胞真菌悬浮液，以便利用菌丝的机械作用。

32、上述每一个技术特征都导致了特定的优势：

33、-用脂肪试剂的步骤旨在松散聚烯烃链堆积，促进菌丝定植和酶作用；

34、-与真菌菌丝体的培养允许深入渗透到凝固产品中，并具有氧化聚烯烃链的突出能力。