用于表征MHCI肽结合的测定和试剂的制作方法

本技术涉及用于分析主要组织相容性i类(mhci)复合物的系统和方法。可使用非变性质谱分析、酶联免疫吸附测定(elisa)、时间分辨荧光共振能量转移(tr-fret)光谱进行分析，任选地结合经由尺寸排阻色谱法或毛细管电泳(例如毛细管区带电泳)的mhci复合物分离。在一些实施例中，这些方法应用于肽交换的mhci复合物，例如，使用预期存在于患者样品中的肽。

背景技术：

1、主要组织相容性复合物-i(mhci)是一种几乎广泛存在的蛋白复合物，其负责将抗原提呈细胞表面上的自身和外源来源的展示肽呈递至淋巴细胞。通过mhci的展示肽呈递是后天免疫应答朝破坏病变细胞或保护健康细胞的第一步。mhci复合物是一种非共价连接的蛋白异二聚体，其由重链(α)和轻链(β2微球蛋白，b2m)组成；一般而言，mhci复合物在没有8-11个残基展示肽配体的情况下是不稳定的。锥状展示肽生成路径利用将泛素化的细胞质蛋白降解成潜在展示肽的蛋白酶体。这些展示肽随后被输入至内质网中，在那里其被进一步改质(refine)，并且活性mhci/展示肽复合物在运送至细胞表面以呈递至细胞毒性或cd8(+)t细胞前，经由蛋白质伴护蛋白(chaperone)辅助过程形成，以识别并确定细胞命运。

2、mhci蛋白由主要组织相容性复合物基因复合物编码，并且也被称为人类白细胞抗原(hla)系统的成员。虽然总共有大约24个已知的mhci家族成员，但是最常见的mhci家族成员由hla-a、hla-b和hla-c基因座编码。每个hla组包含至少几十个或更多个等位基因，并且这些等位基因的差异表达导致蛋白输出的丰富多样性。实际上，有>20,000种不同的hla-a、hla-b和hla-c蛋白复合物，每种都具有自己的稳定性和典型的配体特异性。mhci蛋白系统的高度多样性使整个系统能够识别大量可能的抗原，包括源自非人来源的肽、转译后修饰的自身肽和体外合成的肽。

3、治疗规避性免疫标靶的目的发展领域涉及生成用于表征患者中的cd8(+)t细胞依赖性应答的先前未经表征的、未知的或经设计的抗原(包括新抗原肽序列)。然而，缺乏可用于生产、选择和鉴定体外最佳mhci复合物:抗原(包括新抗原)结合的稳固、高通量方法。

技术实现思路

1、本技术提供了用于测定用于广范围免疫疗法的mhci肽的组合物和方法。

2、本文描述了一种快速、高通量、多重监测测定法，以寻找潜在的新抗原肽，其可能呈递在患者的mhci分子上并且可与t细胞结合，并且可有助于为癌症患者开发适当的治疗。诸如elisa(酶联免疫吸附测定)、tr-fret(时间分辨荧光共振能量转移)和2d-lc-ms(二维液相色谱质谱法)等测定法可用于分析mhci-肽复合物。色谱法(诸如2d-lc)可与质谱法(ms)结合进行检测。

3、本文所描述的方法和系统利用非变性质谱分析表征与肽结合的mhci复合物。在一些实施例中，在进行非变性质谱分析前，先进行尺寸排阻色谱法(sec)或在其他情况下先进行毛细管电泳(ce)，例如毛细管区带电泳(cze)。在一些情况下，非变性质谱分析允许表征与mhci结合的肽，并证实特定肽与mhci复合物为非共价结合。在一些情况下，相较于色谱法(诸如sec)，ce还可允许用于检测以较低浓度存在的结合肽。在一些情况下，例如与2d-lc-ms方法中的二维分离相比，仅以sec、ce或cze进行单次色谱法分离，然后进行非变性质谱分析。在一些实施例中，与其他分析技术相比较，本文的方法还可提供增加的通量。

4、在一方面，本文提供了一种主要组织相容性复合物i类(mhci)蛋白复合物，其包括α链、β链和配体，该配体包含非天然uv可裂解氨基酸。

5、在一方面，本文提供了一种肽交换分析法，其通过提供包含测试肽和mhci/配体复合物的第一组合物，以确定mhci等位基因与测试肽的结合，该mhci/配体复合物包括(i)包含α链、β链的mhci分子和(ii)配体，其中该配体为包含非天然紫外线(uv)可裂解氨基酸的肽；将该第一组合物暴露于uv光，以在uv可裂解氨基酸处裂解该配体；以及将该第一组合物孵育一段时间以形成包含游离测试肽、该α链、该β链和/或mhci/-第二肽复合物的第二组合物；并确定该mhci等位基因是否与该第二肽结合。

6、在一方面，本文提供了一种用于确定最佳mhci等位基因-配体组合的方法，该方法涉及：提供在变性条件下纯化的多个mhciα链单体，通过合并该多个mhciα链单体、多个β链单体以及含有非天然uv可裂解氨基酸的配体，以形成反应混合物，在允许形成mhci-配体复合物的条件下孵育该反应混合物，并确定是否形成该mhci-配体复合物。

7、在一方面，本文提供了一种用于检测mhci等位基因与测试肽的结合的方法，该方法涉及：提供包括测试肽和mhci/配体复合物的第一复合物，其包括含有α链、β链的mhci分子和配体，其中该配体为包括非天然、紫外线(uv)可裂解氨基酸的肽，然后将该第一复合物暴露于uv光下，以在uv可裂解氨基酸处裂解该配体，并检测该第二复合物中的mhci/测试肽复合物，从而检测该mhci分子与该测试肽的结合。

8、在一方面，本文提供了一种鉴定mhci结合配体的方法，该方法包括在允许形成mhci/配体复合物的条件下，将多个mhci等位基因链单体与多个β链单体和配体接触，其中该配体为含有非天然uv可裂解氨基酸的肽，并检测该mhci/配体复合物，从而鉴定mhci结合配体。

9、在一方面，本文提供了一种用于确定最佳mhci等位基因-配体组合的方法，该方法涉及：提供在变性条件下所纯化的多个mhciα链单体，通过合并该多个mhciα链单体、多个β链单体以及含有非天然uv可裂解氨基酸的配体，以形成反应混合物，在允许形成mhci-配体复合物的条件下孵育该反应混合物，并确定是否形成该mhci-配体复合物。

10、在一方面，本文提供了一种含有肽的试剂盒，该肽包含非天然uv可裂解氨基酸、mhciα链单体和mhciβ链单体。

11、在一方面，本文提供了一种系统，其含有：含有非天然uv可裂解氨基酸的肽；多个mhciα链单体；多个mhciβ链单体；以及能够允许形成mhci/配体复合物的第一试剂。

12、本公开进一步涉及使用尺寸排阻色谱法或毛细管电泳结合非变性质谱分析，以监测肽交换的mhci复合物的方法。

13、在一方面，本发明提供了一种监测样品中肽交换的主要组织相容性i类(mhci)复合物的方法，其包括：(a)获得包含目的肽的经肽交换的mhci复合物；(b)对该肽交换的mhci复合物进行尺寸排阻色谱法(sec)、毛细管电泳(ce)或毛细管区带电泳(cze)；以及(c)在(b)的色谱法或毛细管电泳之后，对该mhci复合物进行非变性质谱分析(ms)，以鉴定包含目的肽的mhci复合物。

14、在一方面，本发明提供了一种监测样品中肽交换的主要组织相容性i类(mhci)复合物的方法，其包括：(a)获得包含目的肽的肽交换的mhci复合物以及在允许可交换肽与该目的肽之间进行肽交换的条件下，将该复合物暴露至一种或多种目的肽；(b)对该肽交换的mhci复合物进行尺寸排阻色谱法(sec)、毛细管电泳(ce)或毛细管区带电泳(cze)；以及(c)在(b)的色谱法或毛细管电泳之后，对该mhci复合物进行非变性质谱分析(ms)，以鉴定包含目的肽的mhci复合物。

15、在一方面，本发明提供了一种监测mhci复合肽的t细胞识别的方法，其包括：(a)获得包含目的肽的经肽交换的mhci；(b)将该肽交换的mhci复合物与包含t细胞的样品接触；(c)将t细胞结合的mhci复合物与未结合的mhci复合物分开；(d)对该肽交换的mhci复合物进行尺寸排阻色谱法(sec)、毛细管电泳(ce)或毛细管区带电泳(cze)；以及(e)在(d)的色谱法或毛细管电泳之后，对该mhci复合物进行非变性质谱分析(ms)，从该样品中鉴定出包含被t细胞识别的肽的mhci复合物。

16、在一方面，本发明提供了一种监测mhci复合肽的t细胞识别的方法，其包括：(a)获得包含可交换肽的主要组织相容性i类(mhci)复合物，并在允许肽交换的条件下，将该复合物暴露至一种或多种目的肽；(b)将该肽交换的mhci复合物与包含t细胞的样品接触；(c)将t细胞结合的mhci复合物与未结合的mhci复合物分开；(d)对该肽交换的mhci复合物进行尺寸排阻色谱法(sec)、毛细管电泳(ce)或毛细管区带电泳(cze)；以及(e)在(d)的色谱法或毛细管电泳之后，对该mhci复合物进行非变性质谱分析(ms)，从该样品中鉴定出包含由t细胞识别的肽的mhci复合物。