光氧化还原蛋白修饰的制作方法

本发明涉及通过使用特定的硼酸酯和砜前体化合物，经由自由基产生的c-c键形成，用化学基团光氧化还原介导的蛋白质官能化。本发明还涉及可通过此方法产生的官能化蛋白质，以及特定的硼酸酯和砜前体化合物本身。

背景技术：

1、翻译后修饰(ptm)极大地扩展了天然蛋白质的结构和功能。平行的合成蛋白质官能化策略的出现，现在不仅允许它们的直接模拟，而且允许具有从药物携带到追踪、成像和配偶体交联的不同潜在功能的非天然蛋白质变体。然而，可通过这些修饰引入的官能团的范围仍然有限，尤其是对于反应性官能团。

2、使用细胞的翻译机制的方法提供了将选择的修饰安装至蛋白质中的一些优点，但可能在范围和效率上受到限制。在生物合成期间，fed非天然氨基酸前体可被降解或不可被耐受；对于具有反应性侧链的那些尤其如此。翻译后官能化提供了一种替代策略，通过其后期使用，其范围可能更广。原则上，它仅受所用反应条件与蛋白质底物的相容性及其背景的限制。

3、在翻译后官能化的一个形式中，容易产生的脱氢丙氨酸(dha)残基在蛋白质中用作单电子占据分子轨道(somo)受体(“自由基受体”或“somo亲集物”)，其对几种碳自由基形态具有高度反应性，从而允许选择性β、γ-c-c键形成，以“无痕/无迹”方式引入新的侧链。然而，侧链/碳自由基前体和产生它们的试剂(例如，来自金属或bh4-的单电子转移(set))的不相容性目前限制了这种技术的范围。尽管如此，这种均裂1e-化学具有优于典型的异裂2e-试剂的潜在优势。生物分子修饰的固有挑战包含：水相容性；要求“温和性”；以及对大多数生物环境中存在的过多生物源酸、胺、醇、和硫醇(现成2e-反应物)的低(或非)反应性。相反，水和天然蛋白质对大多数碳自由基的反应性较低。因此，在某些1e-化学反应中，适当放置的亲somo物(如dha)可以允许更一般的化学选择性和位点选择性。

4、存在set(以及从其的碳自由基引发，无论氧化或还原)的其它方法。催化蛋白质方法比现有的超化学计量方法具有明显的优势，现有的超化学计量方法可能驱动不需要的副反应。此外，如果受到相对温和的、潜在组织穿透性的触发(如光)的调节，则其可以允许额外的层，例如时间、空间和甚至动力学控制，以对那些1e-化学选择性的进行补充。光激发的外层电子转移(et)在小分子应用中已经出现了复苏现象。然而，其在位点选择性生物分子修饰中的用途已受到更多限制。主要的实例主要限制于肽，有时需要混合的有机溶剂和/或et体系，其倾向于氧化还原“窗口”的极值，并且已经注意到所产生的副反应。此外，依赖于某些前体部分，例如不能被重排/预定位的α-c-羧基或β-c-h，会限制反应位点和/或由于丰度而导致较低的位点选择性。因此，这些方法在蛋白质化学中尚未达到其全部潜力。

5、需要一种方法，其以可选择性地、可靠地，且在温和、中等氧化还原电位下进行，而且允许添加反应性官能侧链的方式，使具有翻译后修饰的蛋白质官能化。

技术实现思路

1、本发明人惊奇地发现，在光催化剂的存在下，使用特定的自由基前体，例如硼酸儿茶酚－酯衍生物和芳基磺酰基氟衍生物，允许在蛋白质或肽上的官能侧链和somo受体残基之间形成自由基驱动的c-c键。完整蛋白质内的这种c-c侧链改变允许蛋白质或肽的天然的、化学的、翻译后修饰。

2、本发明人发现的方法允许光驱动的电子转移，以产生侧链碳自由基前体，其允许c-c键形成而不需要苛刻的反应条件和有机溶剂。此外，控制反应氧化还原允许位点选择性修饰，具有良好的转化率和对蛋白质或肽的最小损害。具体地，本发明人已经发现，原位产生易氧化的硼酸儿茶酚－酯(baced)衍生物产生rh2c·自由基，其可形成天然残基和ptm的天然(βch2-γch2)键，而通过fe(ii)原位增强芳基磺酰氟衍生物和特定溴氟衍生物可产生rfxc·自由基，例如rf2c·，其形成带有h→f-标记的等价(βch2-γcxf)键。

3、本发明的这些反应方法可以快速进行，并且使用试剂量少。此外，这些处理是化学耐受的，允许将前所未有的范围的官能团整合到不同的蛋白质支架和位点中。在c自由基前体中的敏感基团的存在下，可以化学选择性地进行引发，使得能够安装先前不相容的侧链。这提供了在蛋白质中获得新功能和反应性的途径。本文所述的新方法和由其产生的蛋白质/肽可应用于许多领域，例如(a)安装自由基前体以用于均裂蛋白质上的自由基产生；(b)通过同时检测化学选择性和立体选择性，用天然的、非天然的和“零大小”标记的翻译后修饰的蛋白质底物研究酶功能；以及(c)产生获得对具有异源裂解共价键形成活性谱(在一个极端与小分子不同地反应或在另一个极端通过良好模拟与蛋白质靶选择性反应)的一般化“烷化蛋白”的途径。因此，获得的对新反应和蛋白质上的化学基团的翻译后访问可用于揭示和产生蛋白质功能。

4、因此，本发明人已经证明了下列的三重组合：(i)在温和、中等氧化还原电位下进行电子转移，其使用(ii)侧链官能化c·自由基前体与低、甚至亚化学计量的量的光催化剂“氧化还原匹配”，其由(iii)适当通量的光触发，允许产生和使用蛋白外和蛋白质上自由基以通过c-c键形成来修饰蛋白(参见图1)。所得到的化学允许安装具有新的功能模式的前所未有的侧链。

5、在第一实施方式中，本发明提供了一种用官能侧链部分官能化蛋白质或肽的方法，其中所述蛋白质或肽包括至少一个单电子占据分子轨道(somo)受体残基，其中所述somo受体是包括具有烯烃基团的侧链的残基；其中所述方法包括：

6、(a)使所述蛋白质或肽与自由基前体化合物和光催化剂接触，所述光催化剂在其光活化状态下具有当相对于饱和甘汞电极测量时小于或等于+1.2v的氧化半电势(eox)，以及

7、(b)将所得组合物暴露于光辐射以提供官能化的蛋白质或肽；

8、其中所述自由基前体化合物选自下式(ii)或式(iii)

9、

10、其中r为官能侧链部分，当使用式(ii)化合物时其通过基团-cfx-与蛋白质或肽连接，或者当使用式(iii)化合物时其通过基团-ch2-与蛋白质或肽连接；

11、x选自由氢、氟、氯、-c(o)oh、和-conh2所组成的组；

12、a为芳基或杂芳基，其任选地被一个或多个r2基团取代；

13、j为0、1、2、或3；

14、r1和r2独立地选自由卤素以及未被取代或被一个或多个选自由羟基、氧基、卤素、氨基、羧基、c(1-6)酯、和c(1-6)醚所组成的组的基团取代的c(1-6)烷基所组成的组；且

15、其中当式(ii)化合物用作自由基前体时，步骤(a)进一步包括使所述蛋白质或肽与fe(ii)源接触。

16、在上述方法的另一方面，r为(i)选自药物、糖、多糖、肽、蛋白质、疫苗、抗体、核酸、病毒、标记化合物、稳定化自由基前体、生物分子和聚合物的基团，它们中的任何一个可以任选地通过接头基团连接。

17、在上述方法的另一方面，接头为基团l1，其选自其中一个或多个非相邻的碳原子可任选被选自nh、o、s、-c(o)nh-或-nhc(o)-的基团取代的烷基；聚乙二醇及其类似物；糖类；多糖；聚甘氨酸；聚酰胺；或这些基团中的两个或更多个的组合。

18、在上述第一实施方式的另一方面，r为(ii)官能团rf；或通过接头基团l2连接的一个或多个官能团rf；其中rf为

19、-氢、c3-10环烷基、芳基或杂芳基；其中所述环烷基、芳基和杂芳基未被取代或被一个或多个选自＝o、＝nra、y和(c1-6烷基)-y的基团取代；或

20、-反应性基团y，选自c2-6烯基、c2-6炔基、卤素、羟基、-ora、-sra、-s(o)ra、-s(o)2ra、-oso3ra、-nrac(o)rb、-nraco2rb、-nhc(o)nrarb、-nhcnh2nrarb、-nraso2rb、-n(so2ra)2、-nhso2nrarb、-oc(o)ra、-c(o)ra、-co2ra、-c(o)nrarb、-c(o)(nhnh2)、-onh2、-c(o)n(ora)rb、-so2nrarb或-so(nra)rb；氰基、硝基、c1-6叠氮烷基、-nrarb和-(nrarbrc)+；

21、其中：

22、ra、rb和rc在每种情况下独立地表示氢、c1-6烷基、c3-10环烷基、杂环基、苯基、苯甲基和杂芳基，其中在ra、rb和rc处的烷基、环烷基、杂环基、苯基、苯甲基和杂芳基未被取代或被一个或多个选自卤素、羟基、＝o、-nh2、-so3-、和c1-6烷氧基的取代基取代；且

23、l2选自其中一个或多个非相邻碳原子可任选被选自nh、o、s、-c(o)nh-或-nhc(o)-的基团取代的烷基；聚乙二醇及其类似物；糖类；多糖；聚甘氨酸；聚酰胺；或这些基团中的两个或更多个的组合。

24、在另一方面，r为(ii)官能团rf；或通过接头基团l2连接的一个或多个官能团rf；其中rf为选自以下的反应性部分：c2-6烯基、c2-6炔基、卤素、-oc(o)ra、-c(o)ra、-co2ra、-c(o)(nhnh2)、-onh2和c1-6叠氮烷基；或r含有式的反应性部分，其中a如权利要求1所定义；且其中反应性部分可任选地通过接头基团l2连接；

25、其中l2为其中一个或多个非相邻碳原子可任选被选自nh、o、s、-c(o)nh-或-nhc(o)-的基团取代的烷基。

26、在另一方面，反应性部分选自卤素、c1-6叠氮基、c2-6炔基、优选

27、在第二实施方式中，本发明提供了一种用官能侧链部分官能化包括至少一个如以上第一实施方式中所定义的somo受体残基的蛋白质或肽的方法，其中所述方法包括：

28、(a)使所述蛋白质或肽与自由基前体化合物、fe(ii)源和光催化剂接触，所述光催化剂在其光活化状态下具有当相对于饱和甘汞电极测量时小于或等于+1.2v的氧化半电势(eox)；以及

29、(b)将所得组合物暴露于光辐射以提供官能化的蛋白质或肽；

30、其中所述自由基前体化合物为下式(iv)的基团，

31、

32、其中r为官能侧链部分，其通过基团-cfx-与蛋白质或肽连接；并且其中基团r选自-coord和-conrdre，其中rd表示氢、c1-6烷基、c3-10环烷基、杂环基、苯基、苯甲基或杂芳基，其中在rd处的烷基、环烷基、杂环基、苯基、苯甲基和杂芳基未被取代或被一个或多个选自卤素、羟基、＝o、-nh2、c1-6烷氧基和-nhcore的取代基取代；且re表示氢或c1-4烷基。

33、在第三实施方式中，本发明提供了一种用具有结构的官能侧链部分官能化包括至少一个如上文第一实施方式中所定义的somo受体残基的蛋白质或肽的方法，其中该方法包括

34、(a)使所述蛋白质或肽与自由基前体化合物、fe(ii)源和光催化剂接触，所述光催化剂在其光活化状态下具有当相对于饱和甘汞电极测量时小于或等于+1.2v的氧化半电势(eox)；以及

35、(b)将所得组合物暴露于光辐射以提供官能化的蛋白质或肽；

36、其中所用的自由基前体化合物具有以下结构其中基团a和x如以上第一实施方式中所定义。

37、在上述实施方式的另一方面，当官能侧链部分包括如上定义的反应性部分时，所述方法可进一步包括使肽或蛋白质经由反应性部分之一反应以将官能侧链连接至另外的分子。

38、在优选的方面，所述另外的分子为药物、糖、多糖、肽、蛋白质、疫苗、抗体、核酸、病毒、标记化合物、生物分子或聚合物。

39、在上述任何实施方式的另一方面，somo受体残基为脱氢丙氨酸。

40、在上述实施方式的另一方面，基团a为苯基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基或吡嗪基。

41、在上述实施方式的优选方面，基团a为吡啶基、嘧啶基或苯并噻唑基。

42、在上述实施方式的进一步优选方面，基团a为2-吡啶基。

43、在上述实施方式的另一方面，基团x为氟。

44、在上述实施方式中任一个的另一方面，fe(ii)源为硫酸铁(ii)、feotf2、fe(clo4)2、fef2、或(nh4)2fe(so4)2，优选feso4·7h2o。

45、在上述实施方式中任一个的另一方面，光催化剂为ru(ii)或ir(ii)基催化剂，优选ru(ii)催化剂。

46、在上述实施方式的进一步优选方面，ru(ii)光催化剂为ru(bpy)3cl2或ru(bpm)3cl2。

47、在上述实施方式中任一个的另一方面，光辐射在300至600nm，优选400至500nm，更优选430至470nm的范围内。

48、在上述实施方式的另一方面，当自由基前体化合物是式(iii)化合物时，式(iii)化合物通过在步骤(a)中使蛋白质或多肽接触包括-bch2r部分的官能化硼化合物、和由下式(iiib)表示的儿茶酚衍生物，来原位产生：

49、

50、其中r、r1和j如以上实施方式的任一个所定义。

51、在第四实施方式中，本发明提供了一种官能化的肽或蛋白质，其包括至少一个式(ia)的残基：

52、

53、其中x选自氢、氟、-cooh、和-conh2，优选氟；

54、rz为氢或甲基；

55、且

56、r如以上实施方式的任一个所定义。

57、在上述实施方式的另一方面，r为c1-6卤代烷基、c1-6叠氮烷基、或

58、在上述实施方式的另一方面，式(ia)残基为实施例2a至2ag中列出的任何一种化合物。

59、在上述实施方式的另一方面，x为氟。

60、在第五实施方式中，本发明提供了一种官能化的肽或蛋白质，其包括至少一个式(ib)的残基：

61、

62、其中ry为氢或甲基；

63、其中rbac为c1-6烷基，其中末端碳原子被至少一个卤素取代，或rbac由下式表示

64、

65、其中z为卤素。

66、在第六实施方式中，本发明提供了共价连接根据上述第四个或第五实施方式的官能化的蛋白质或肽与另外的蛋白质或肽的方法，其中官能化的蛋白质或肽中的基团r或rbac为c1-6卤代烷基，且其中另外的蛋白质或肽包括能够与卤代烷反应形成共价键的基团。

67、在上述实施方式的另一方面，官能化的蛋白质或肽是另外的蛋白质或肽的底物，并且卤代烷基团被保持在其它蛋白质或肽的结合袋中，以便使所述卤代烷基团与能够与卤代烷基团反应的基团接近。

68、在第七实施方式中，本发明提供了共价连接根据第四实施方式的官能化蛋白质或肽与另外的蛋白质或肽的方法，其中在官能化蛋白质或肽中的基团r是其中另外的蛋白质或肽包括能够与自由基形态反应形成共价键的基团，且其中a如以上实施方式的任一个所定义。

69、在第八实施方式中，本发明提供了根据下式(ii)或(iii)的化合物：

70、

71、其中a、x、r1、和j如以上实施方式的任一个所定义。