通过诱导抗肌萎缩蛋白相关蛋白调节元件内的突变增强细胞中抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达及其治疗用途的制作方法

本发明涉及用于通过使用基因编辑酶在包含抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)调节元件的靶序列中诱导突变来增强抗肌萎缩蛋白相关蛋白在细胞中表达的组合物。本发明还涉及其用于治疗抗肌萎缩蛋白病的治疗用途。

背景技术：

1、杜兴氏肌营养不良症(dmd)是由抗肌萎缩蛋白基因中的突变引起的致死性x连锁神经肌肉病症。该疾病影响5000名新生男性中的1名，并且是人群中最常见的隐性病症之一。在缺乏抗肌萎缩蛋白的情况下，细胞骨架和细胞外基质之间的连接受损，导致肌肉强度/柔韧性和稳定性的丧失。dmd患者在12岁时局限于轮椅，并且通常由于心肺衰竭而死于其第二至第四个十年的生命中。尽管在基于基因、基于细胞和药理学的策略中已经取得了相当大的进展，但是目前对于dmd仍没有有效的治疗。

2、在基于基因的策略中，外显子跳跃和终止密码子通读显示有限的功效并且仅适用于特定的dmd患者亚组。外显子跳跃的使用通常是指使用合成的反义寡核苷酸来抑制剪接增强子位点以防止特定的外显子参与剪接(mann cj,et al.proc natl acad sci u sa.2001jan 2；98(1):42-7)。外显子跳跃方法只能用于某些可能具有缺失的患者，其中阅读框可以通过跳跃邻近该缺失的额外外显子来恢复(perry bshieh,neurotherapeutics.2018oct；15(4):840-848)。目前使用重组相关腺病毒(raav)和微抗肌萎缩蛋白的基因治疗是最有前途的方法(参见sakamoto m.et al.,biochem biophys rescommun.2002may 17；293(4):1265-72)，但治疗的安全性和有效性仍有待评估。此外，该方法递送截短的和部分功能性的抗肌萎缩蛋白，而不概括全长抗肌萎缩蛋白的益处。

3、适用于所有dmd患者以及潜在地也适用于becker患者而不考虑其遗传缺陷的替代治疗方法在于上调抗肌萎缩蛋白相关蛋白，其是能够补偿dmd中的原发性缺陷的抗肌萎缩蛋白的结构和功能旁系同源物。之前的研究证明抗肌萎缩蛋白相关蛋白水平增加3倍在dmd的不同动物模型中挽救了营养不良的病理生理学而没有任何毒性作用。之前描述了在基因、mrna和蛋白质水平上上调抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达的若干机制。例如，在wo2015/018503中，公开了包含编码融合蛋白的基因的重组腺相关病毒(aav)载体，所述融合蛋白包含与锌指蛋白融合的转录激活元件，允许抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达增加。以相同的方式，使用与转录激活结构域融合的具有失活核酸酶活性的cas9(dcas9)的组合开发了双aav系统。aav-dcas9与靶向抗肌萎缩蛋白相关蛋白的aav-grna的共注射允许改进dmd的mdx小鼠模型中的肌营养不良症状(参见liao h.et al.,cell.2017dec 14；171(7):1495-507)。wo2020/101042中公开了一种类似的方法。

4、另一种方法是靶向抗肌萎缩蛋白相关蛋白阻遏物元件以上调抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达。实际上，在5’utr/启动子-增强子区，已经鉴定了许多抗肌萎缩蛋白相关蛋白反式阻遏物(例如en1、en2和ets-2)。抗肌萎缩蛋白相关蛋白还受到3’utr区上的几种mirna(例如let7c、mir-206)和富含顺式-au的阻遏物序列的阻遏。最近，阻断抗肌萎缩蛋白相关蛋白mrna上let7 mir结合位点的2’-o-甲基寡核苷酸表明在鼠成肌细胞和dmd的mdx鼠模型中分别将抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达上调2倍和3倍(wo2019/183005)。抗肌萎缩蛋白相关蛋白的上调与显著的组织学和功能改进相关(mishra et al.,plos one.2017,12(10):e0182676)。wo2009/134710中也描述了在c2c12细胞中使用反义序列抑制mirna。然而，这些途径需要转基因的连续表达以激活抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达，并且仍然需要开发其中期望诱导抗肌萎缩蛋白相关蛋白上调的修饰是永久的策略。

5、最近，在永生化人成肌细胞中体外使用基于crispr/cas9的途径来缺失包含mirna结合位点的抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrn)基因的3’utr区(soblechero-martin et al.,2020,biorχiv preprint；doi.org/10.1101/2020.02.24.962316；kasturi sengupta etal.,molecular therapy:nucleic acids,2020,22)。调节元件的完整区域的缺失可诱导mrna不稳定性和抗肌萎缩蛋白相关蛋白的错误表达，从而激发最终的副作用。

6、发明概述

7、本发明人已经开发了针对dmd的新的基于抗肌萎缩蛋白相关蛋白上调的治疗策略，其使用基因编辑酶(如crispr-cas系统)来破坏抗肌萎缩蛋白相关蛋白启动子上的阻遏物结构域或干扰mir或其它rna去稳定元件的结合位点以分别去阻遏抗肌萎缩蛋白相关蛋白转录和翻译并因此上调抗肌萎缩蛋白相关蛋白水平。与之前的方法(如外显子跳跃/寡核苷酸)相反，该策略在dna水平起作用，并且因此预期的修饰将是永久的。与调控元件的完整区域的缺失相反，本发明人在本文中使用基因编辑酶(如具有单一向导rna的crispr/cas)，以在靶序列内精确诱导突变。与调节元件的缺失相反，本文使用的方法允许保持邻近靶向阻遏物结合位点的调节元件的稳定性并减少副作用。此外，与基于缺乏重要结合位点的截短蛋白的传统基因治疗相比，上调内源性抗肌萎缩蛋白相关蛋白的特异性靶向策略将产生全长抗肌萎缩蛋白相关蛋白，其具有更好的治疗和免疫潜力。使用该策略，本发明人特别表明，与其它阻遏物结合位点相比，let7c结合位点、mir-196b结合位点、erf结合位点和en1结合位点2的特异性破坏允许有效增加抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达。令人惊讶地，单个阻遏物结合位点，特别是let7c结合位点的特异性破坏与包含阻遏物结合位点簇的阻遏物结合位点的完整区域的缺失一样有效地增加抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达。在dmd的mdx小鼠模型中，与对照相比，共同施用表达cas9的raav和表达靶向let7c结合位点的单一grna的raav改进肌肉结构和组织学。这为抗肌萎缩蛋白病的治疗开辟了新的视角。

8、本发明涉及用于增强细胞中抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达的方法，其包括向细胞中引入包含至少一种基因编辑酶的组合物，所述基因编辑酶能够在靶序列内诱导位点特异性突变，所述靶序列包含选自下组的抗肌萎缩蛋白相关蛋白基因的阻遏物结合位点：ets-2-阻遏物因子(erf)结合位点，优选由序列cggaa组成；同源盒蛋白engrailed-1(en1)结合位点2，优选由gtagtgg组成；let7c结合位点，优选由seq id no:1组成；和mir-196b结合位点，优选由seq id no:2组成，并且其中所述突变破坏阻遏物结合位点而不缺失整个阻遏物结合位点序列。

9、在具体实施方案中，所述基因编辑酶是位点特异性核酸酶、碱基编辑器或引物编辑器，更特别地，是包含向导rna的crispr/cas基因编辑酶，所述向导rna包含与所述靶序列互补的序列，所述靶序列包含抗肌萎缩蛋白相关蛋白阻遏结合位点。在优选实施方案中，所述grna包含选自下组的序列：seq id no:3-17和25。

10、在具体实施方案中，当所述组合物包含至少两种作为序列特异性核酸酶的基因编辑酶时，所述核酸酶以这样的方式连续使用：即第一序列特异性核酸酶诱导靶序列内的第一位点特异性突变事件，并且一旦修复了第一突变事件，则第二序列特异性核酸酶用于诱导靶序列内的第二位点特异性突变事件。

11、在另一方面，本发明涉及用于增强抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达的组合物，其包含至少一种能够在靶序列内诱导位点特异性突变的基因编辑酶，所述靶序列包含至少一个选自下组的抗肌萎缩蛋白相关蛋白基因的阻遏物结合位点：ets-2-阻遏物因子(erf)结合位点，优选由序列cggaa组成；同源盒蛋白engrailed-1(en1)结合位点2，优选由序列gtagtgg组成；let7c结合位点，优选由seq id no:1组成；和mir-196b结合位点，优选由seq id no:2组成，并且其中所述突变破坏阻遏物结合位点而不缺失整个阻遏物结合位点序列。一些优选实施方案中，抗肌萎缩蛋白相关蛋白基因的阻遏物结合位点是let7c结合位点，优选由seq id no:1组成。

12、在具体实施方案中，所述组合物包含crispr/cas基因编辑酶，所述crispr/cas基因编辑酶包含向导rna，所述向导rna包含与包含所述抗肌萎缩蛋白相关蛋白阻遏结合位点的所述靶序列互补的序列。在优选实施方案中，所述grna包含选自下组的序列：seq id no:3-17和25。

13、在具体实施方案中，所述基因编辑酶由核酸构建体编码，优选包括在病毒载体中，更优选aav载体中。

14、在一个优选实施方案中，本发明涉及如上所述的组合物，其用于治疗抗肌萎缩蛋白病，优选杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症或x连锁扩张型心肌病。

15、在另一方面，本发明涉及包含如上所述的组合物和药物赋形剂的药物组合物及其在治疗抗肌萎缩蛋白病，优选杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症或x连锁扩张型心肌病中的用途。

16、在另一方面，本发明涉及在至少一个靶序列内包含位点特异性突变的工程化细胞，所述靶序列包含选自下组的抗肌萎缩蛋白相关蛋白基因的阻遏物结合位点：let7c结合位点、mir-196b结合位点、erf结合位点和en1结合位点2；优选let7c结合位点；并且其中所述突变破坏阻遏物结合位点而不缺失整个阻遏物结合位点序列，以及其在治疗抗肌萎缩蛋白病，更优选杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症或x连锁扩张型心肌病中的用途。

技术实现思路