SARS-COV2抗体检测方法及相关产品与流程

【】本公开广泛涉及检测受试者中抗体的方法及其相关产品。【背景】covid-19是主要健康问题，已发展成为一种大流行，这场史无前例的危机导致医疗保健系统不堪重负，社会经济受到严重破坏。控制covid-19传播的关键公共卫生策略之一是及早发现感染者，以便及早阻断严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(sars-cov-2)的传播。尽管定量逆转录酶pcr(qrt-pcr)仍然是covid-19诊断的金标准，但它可能非常耗时，并且由于检测点的病毒遗传物质不足、样品制备效率低或患者病毒载量低，可能会发生假阴性诊断的发生率。在发病后14天(pio)时，大多数患者几乎无法检测到sars-cov-2病毒rna。检测sars-cov-2特异性抗体的血清学检测越来越多地用于补充基于pcr的检测，特别是在病毒载量低的有症状感染中。截至2020年8月17日，美国食品药品监督管理局(us-fda)批准使用37种血清学检测(us-fda，2020年)，主要针对2种免疫原性蛋白：(1)刺突(s)蛋白，这是暴露最多的病毒蛋白，以及(2)核衣壳(n)蛋白，它在感染期间大量表达。s蛋白负责通过细胞受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合病毒并将其进入宿主细胞。许多基于s蛋白的血清学检测可检测针对s1亚基、s2亚基或受体结合结构域(rbd)的特异性抗体，这些抗体无法捕获完整的抗体库，例如与s蛋白的各种结构域和构象表位结合的抗体。血清学诊断对于无症状患者和可能具有晚发性疾病的轻至中度疾病患者尤为重要。血清学诊断对于识别免疫和可能受到保护的个体也至关重要。因此，有必要提供一种替代方法来识别/表征受试者中的冠状病毒感染。特别是，需要提供一种检测受试者sars-cov2抗体的替代方法。【概要】在一个方面，提供了一种识别/表征冠状病毒感染的方法，任选地在受试者中sars-cov-2感染，所述方法包括：将来自受试者的样品与包含编码冠状病毒的刺突蛋白(s蛋白)的核酸的分离的宿主细胞接触；并检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。另一方面，提供了一种鉴定受试者对冠状病毒感染，任选地sars-cov-2感染具有免疫力的方法，所述方法包括：将来自受试者的样品与包含编码冠状病毒的刺突蛋白(s蛋白)的核酸的分离的宿主细胞接触/温育；并检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。在一些实施方式中，检测步骤包括使用荧光检测仪器，其中任选地，所述流式细胞仪是检测抗体或其片段与宿主细胞结合的仪器。在一些实施方式中，所述方法还包括将样品与一种或多种检测抗体或第二抗体接触/温育。在一些实施方式中，所述诊断方法为诊断方法，任选地是血清学诊断方法。在一些实施方式中，所述方法还包括执行进一步的测定，例如基于聚合酶链反应(pcr)的测定，以检测/确认冠状病毒感染，任选地sars-cov-2感染在一些实施方式中，所述方法是体外或离体方法。在又一方面，提供了一种核酸，任选地分离的和/或重组的核酸，编码用于严重急性呼吸综合征(sars)样冠状病毒(sars-cov-2)的刺突蛋白(s蛋白)。在又一方面，提供了一种病毒载体，任选地重组病毒载体，包含本文所述的核酸。在又一方面，提供了一种宿主细胞，任选地分离的宿主细胞，包括本文所述的核酸，其中所述宿主细胞任选地与本文所述的病毒载体进行转导。在一些实施方式中，宿主细胞表达所述s蛋白。在一些实施方式中，所述s蛋白包含全长s蛋白。在一些实施方式中，所述s蛋白/全长s蛋白包含seq id no：1、seq id no：3、seqid no：4、seq id no：5、或与seq id no：1、seq id no：3、seq id no：4、或seq id no：5共享至少约75％序列同一性的序列。在一些实施方式中，所述核酸包含seq id no：2、seq id no：6、seq id no：7、seqid no：8、或与seq id no：2、seq id no：6、seq id no：7、或seq id no：8共享至少约75％序列同一性的序列。在一些实施方式中，所述s蛋白/所述全长s蛋白包含seq id no：1或与seq id no：1共享至少约75％序列同一性的序列。在一些实施方式中，核酸包含seq id no：2，或与seq id no：2共享至少约75％序列同一性的序列。在一些实施方式中，宿主细胞结合抗原结合蛋白或其片段，任选地是抗体，还任选抗sars-cov-2抗体。【定义】本文所用的术语“抗原结合蛋白”广义地指任何基于肽的分子，其识别并结合到诸如表达s蛋白的靶标的细胞。抗原结合蛋白的例子包括抗体，包括5大类免疫球蛋白中的任何一类的抗体：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚类(同种型)(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)，以及它们的抗原结合片段。在一些实例中，抗原结合蛋白包括抗刺突蛋白iga、igg(包括igg1、igg2、igg3、igg4)和igm。本文中使用的与感染有关的术语“识别”或“表征”应被广义地解释为包括确定感染的存在、不存在、数量或疾病负担/严重程度的水平。识别或表征感染还可能包括识别/估计/预测先前的感染，感染的阶段(早期，晚期，恢复阶段，恢复期等)，感染的结果/预后(例如康复机会，死亡等)，测量针对感染的免疫应答和/或测量特定类别/亚类免疫球蛋白与总免疫球蛋白或总免疫球蛋白的比率/比例免疫球蛋白在一类。例如，可以测量igg1应答与总igg应答的比例。例如，抗体应答可指示感染的存在。例如，强烈的抗体应答(例如超过阈值)可能表明感染处于晚期和/或疾病更严重。例如，强抗体应答(例如强igm应答和/或igg应答，包括igg1、igg2、igg3和igg4)与疾病严重程度、肺炎、更严重的临床结局(如氧气供应需求和icu入院)中的一种或多种相关，任选地正相关。在各种示例中，在大约10天的pio和/或大约23天的pio处观察到相关性。例如，阳性igg1和/或igg3反应对中和病毒很重要，可能表明受试者的预后。本文中使用的术语“微”应广义地解释为包括约1μm至约1000μm的尺寸。本文中使用的术语“纳”应广义地解释为包括小于约1000nm的尺寸。本文所用的术语“粒子”广义地指离散实体或离散体。本文中描述的颗粒可以包括有机、无机或生物颗粒。本文描述的颗粒也可以是由多个子颗粒的集合体或小物体的片段形成的宏观颗粒。本公开的颗粒可以是球形的、基本上是球形的或非球形的，例如不规则形状的颗粒或椭圆形的颗粒。术语“尺寸”在用于指代粒子时广义上是指粒子的最大尺寸。例如，当颗粒基本上是球形时，术语“尺寸”可以指颗粒的直径；或者当颗粒基本上是非球形的时，术语“尺寸”可以指颗粒的最大长度。除非另有说明，本说明书中使用的术语“耦合”或“连接”旨在涵盖直接连接或通过一个或多个中间装置连接两者。术语“关联”，本文中指2个元素之间的广义关系时。这种关系包括但不限于物理、化学或生物关系。例如，当元素a与元素b关联时，元素a和b可以直接或间接地相互连接，或者元素a可以包含元素b，反之亦然。本文中使用的术语“相邻”在指2个元件时是指一个元件与另一个元件非常接近，并且可以但不限于相互接触的元件，或者还可以包括被设置在其之间的一个或多个其他元件分隔的元件。术语“和/或”，例如，“x和/或y”被理解为表示“x和y”或“x或y”，并且应被理解为这两种含义或为其中一种含义提供明确的支持。此外，在本文中的描述中，无论何时使用的术语“基本上”被理解为包括但不限于“完全”或“完全”等。此外，诸如“包括”、“包括”等术语在使用时，都是非限制性描述性语言，因为它们广泛包括在这些术语之后朗诵的要素/组成部分，以及未明确引用的其他组成部分。例如，当使用“包括”时，对“一个”特征的引用也意在引用该特征的“至少一个”。在适当情况下，诸如“包括”、“包括”等术语可被视为“包括”、“包括”等术语的子集。因此，在本文公开的实施例中使用诸如“包括”、“包含”等术语，可以理解的是，这些实施例为相应的实施例提供了诸如“组成”、“包含”等术语的教学。此外，诸如“大约”、“大约”等术语在使用时，通常表示合理的变化，例如披露值的+/-5％的变化，或披露值的4％的差异，或披露值3％的方差，披露值的2％的方差或披露值的1％的方差。此外，在本文中的描述中，某些值可以在一个范围内公开。显示范围端点的值旨在说明首选范围。每当描述一个范围时，该范围都旨在涵盖并教授所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。也就是说，不应将范围的终点解释为不灵活的限制。例如，对1％到5％范围的描述旨在具体披露子范围1％到2％、1％到3％、1％到4％、2％到3％等，以及单独披露该范围内的值，例如1％、2％、3％、4％和5％。应当理解，该范围内的单个数值还包括整数、分数和小数。此外，无论何时描述范围，该范围还旨在涵盖并教导来自所示数字端点的最多2个附加小数位或有效数字(如果适用)的值。例如，对1％到5％范围的描述旨在明确披露1.00％到5.00％的范围以及1.0％到5.0％及其所有中间值(例如1.01％、1.02％……4.98％，4.99％，5.00％和1.1％，1.2％…4.8％，4.9％，5.0％等)，跨越范围。上述特定公开的意图适用于范围的任何深度/广度。此外，在描述一些实施方式时，公开可以公开方法和/或过程作为特定步骤序列。然而，除非另有要求，可以理解的是，所述方法或过程不应局限于所公开的特定步骤序列。其他步骤序列可能是可能的。此处披露的步骤的特定顺序不应被解释为不适当的限制。除非另有要求，否则此处公开的方法和/或过程不应限于按照所写顺序执行的步骤。步骤的顺序可能会有所不同，但仍在公开的范围内。此外，可以理解的是，虽然本公开提供了具有本文讨论的一个或多个特征/特征的实施例，但这些特征/特征中的一个或多个也可以在其它替代实施例中被否认，并且本公开为此类免责声明和这些相关的替代实施例提供支持。【实施例说明】在受试者中识别/表征冠状病毒感染的方法的示例性、非限制性实施方式如下公开。在另一方面，提供了一种核酸，任选地分离的和/或重组的核酸，编码用于严重急性呼吸综合征(sars)样冠状病毒(sars-cov-2)的刺突蛋白(s蛋白)。在不同的实施方式中，所述核酸包括脱氧核糖核酸(dna)和/或核糖核酸(rna)。核酸可以是单链或双链。在不同的实施方式中，所述核酸还包括标记基因。标记基因可能是赋予选择细胞的能力的基因，以便只能选择表达该基因的细胞。标记基因的例子包括但不限于抗生素/耐药基因、荧光激活细胞分选(facs)可检测基因、酶基因和编码荧光蛋白的基因等。荧光蛋白的实例包括但不限于绿色荧光蛋白(gfp)、萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、藻胆蛋白等。在一个实施方式中，核酸包含gfp基因。在不同的实施方式中，核酸还包括核糖体内部进入位点(ires)序列。在不同的实施方式中，所述核酸包含质粒。在不同的实施方式中，核酸缺乏或不包含或缺少sars-cov-2的一个或多个其他基因/序列(编码s蛋白的基因/序列除外)。在各种实施方式中，核酸缺乏或不包含或缺乏编码一种或多种其他sars-cov-2蛋白(s蛋白除外)的基因/序列。在一些实施方式中，核酸缺乏或不包含或缺少编码复制、转录和感染性病毒组装所必需的病毒蛋白的多种其它基因之一。在一些实施方式中，核酸缺乏或不包含或缺乏编码一种或多种其它结构蛋白的基因/序列，包括小包膜(e)糖蛋白、膜(m)糖蛋白和核衣壳(n)蛋白、其它辅助蛋白和其它非结构蛋白包括nsp1至nsp16。在不同的实施方式中，核酸包括sars-cov-2基因/序列或sars-cov-2衍生的基因/序列或sars-cov-2相关基因/序列，该基因/序列由编码s蛋白的基因/序列组成。在不同的实施方式中，核酸编码由s蛋白组成的sars-cov-2蛋白。在又一方面，提供了一种病毒载体，任选地重组病毒载体，包含本文所述的核酸。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、杂交载体(例如腺-逆转录杂交病毒载体和腺-慢杂交病毒载体)等。在不同的实施方式中，病毒载体包括逆转录病毒载体。在不同的实施方式中，逆转录病毒载体包括慢病毒载体。病毒载体可用于转导能够支持s蛋白表达的多种细胞。宿主细胞的例子包括但不限于原代细胞、永生化细胞和胚胎干细胞。在不同的实施方式中，提供了一种病毒，任选地重组病毒，包含本文所述的核酸。病毒的例子包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、杂交种(例如腺-逆转录杂交种和腺-慢变异杂交种)等。所述病毒或病毒载体可以是重组病毒或重组病毒载体。在不同的实施方式中，病毒或病毒载体不包含冠状病毒，例如sars-cov-2。在不同的实施方式中，病毒或病毒载体不能复制或复制不称职。在又一方面，提供了一种宿主细胞，任选地分离的宿主细胞，包括本文所述的核酸，其中所述宿主细胞任选地与本文所述的病毒载体进行转导。在不同的实施方式中，宿主细胞包括哺乳动物细胞。在不同的实施方式中，哺乳动物细胞包括人细胞。在不同的实施方式中，宿主细胞包括人胚胎肾(hek)细胞/细胞系或其衍生物。在不同的实施方式中，宿主细胞包括hek293、任选的hek293t细胞。在不同的实施方式中，核酸被整合到宿主细胞基因组中(例如稳定转染)。在不同的实施方式中，宿主细胞来源于诸如稳定的细胞系的细胞系。在不同的实施方式中，宿主细胞表达s蛋白。在不同的实施方式中，s蛋白包括受体结合亚基(s1)和/或膜融合亚基(s2)。在不同的实施方式中，s蛋白包括n末端结构域(ntd)、受体结合结构域(rbd)、电位融合肽(pfp)/融合肽(fp)、庚重复-n(hr-n)、庚重复-c(hr-c)、跨膜结构域(tm)和/或细胞内尾部(ic)。在不同的实施方式中，s蛋白包含三聚体。在不同的实施方式中，s蛋白可接近或暴露在细胞表面。在不同的实施方式中，宿主细胞还表达荧光蛋白。在不同的实施方式中，宿主细胞是gfp阳性的。在不同的实施方式中，宿主细胞能够捕获针对s蛋白的特异性抗体的完整库。例如，宿主细胞的实施方式不仅能够捕获针对s蛋白的受体结合结构域(rbd)的抗体，而且还能够捕获针对s蛋白的其他结构域和/或s蛋白的构象表位的抗体。在本公开的各种实施方式中，所述病毒载体或宿主细胞，其中所述s蛋白包含全长s蛋白。在不同的实施方式中，其中所述s蛋白/全长s蛋白包括seq id no：1、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5或与seq id no：1、seq id no：3、seq id no：4或seq id no：5共享至少约75％的序列同一性。在不同的实施方式中，s蛋白/全长s蛋白包含与seq id no：1、seq id no：3、seqid no：4和/或seq id no：5共享至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施方式中，s蛋白/全长s蛋白包含与seq id no：1，seq id no：3，seqid no：4和/或seq id no：5共享至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、至少约99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％或至少约99.9％的序列同一性的序列。在不同的实施方式中，所述s蛋白/全长s蛋白包含不少于约1300个氨基酸残基、不少于约1250个氨基酸残基、不少于约1200个氨基酸残基、不少于约1150个氨基酸残基、不少于约1100个氨基酸残基、不少于约1050个氨基酸残基或不少于约1000个氨基酸残基。在不同的实施方式中，s蛋白/全长s蛋白包含不少于约1280个氨基酸残基、不少于约1279个氨基酸残基、不少于约1278个氨基酸残基、不少于约1277个氨基酸残基、不少于约1276个氨基酸残基、不少于约1275个氨基酸残基、不少于约1274个氨基酸残基，不少于约1273个氨基酸残基，不少于约1272个氨基酸残基，不少于约1271个氨基酸残基，不少于约1270个氨基酸残基，不少于约1269个氨基酸残基，不少于约1268个氨基酸残基，不少于约1267个氨基酸残基，不少于约1266个氨基酸残基，不少于约1265个氨基酸残基，不少于约1264个氨基酸残基，不少于约1263个氨基酸残基，不少于约1262个氨基酸残基，不少于约1261个氨基酸残基，不少于约1260个氨基酸残基，不少于约1259个氨基酸残基，不少于约1258个氨基酸残基，不少于约1257个氨基酸残基，不少于约1256个氨基酸残基，不少于约1255个氨基酸残基，不少于约1254个氨基酸残基，不少于约1253个氨基酸残基，不少于约1252个氨基酸残基，不少于约1251个氨基酸残基或不少于约1250个氨基酸残基。在不同的实施方式中，s蛋白/全长s蛋白包含约1000至约1500个氨基酸残基、约1100至约1400个氨基酸残基、约1200至约1300个氨基酸残基、约1250至约1300个氨基酸残基、约1260至约1280个氨基酸残基，约1270至约1280个氨基酸残基或约1270至约1275个氨基酸残基。在一个实施方式中，s蛋白/全长s蛋白包含约1273个氨基酸残基。在不同的实施方式中，s蛋白/全长s蛋白包括与seq id no：1、seq id no：3、seqid no：4和/或seq id no：5相比而包含一个或多个突变的蛋白质，例如缺失、插入和/或用其它氨基酸取代，例如保守取代。保守的替代表是本领域公知的，本领域技术人员可以通过使用此类表格或使用常规实验来找到有用的替代物。保守取代的例子是那些来自同一类或具有相似生化性质的所述氨基酸相互交换的那些。例如，一个碱性氨基酸可以被另一个碱性氨基酸取代，一个酸性氨基酸可以被另一个酸性氨基酸取代，一个芳香族氨基酸可以被另一个芳香族氨基酸取代，一个非极性脂肪族氨基酸可以被另一个非极性脂肪族氨基酸和极性、不带电荷的氨基酸被另一个极性氨基酸取代，不带电荷的氨基酸等在不同的实施方式中，突变对s蛋白/全长s蛋白的功能/活性具有最小或无影响。在不同的实施方式中，突变对蛋白质/全长s蛋白的结构或折叠的影响很小或无影响。在不同的实施方式中，突变对s蛋白/全长s蛋白的抗原特性影响很小或无影响。在不同的实施方式中，突变导致表位/结构域的变体，该变体是表位/结构域的功能变体。例如，功能变异表位/结构域能够被特异性识别和/或与未修饰/未突变的表位/结构域相同的抗体/抗原结合蛋白/抗原结合片段结合，至少达到基本相同的水平。可用于确定蛋白质的抗原特性或通过变异表位/结构域识别(或识别量)的方法在本领域是已知的。例如，elisa测定可用于比较抗体与s蛋白/全长s蛋白的特异性结合水平与抗体与包含突变的相应s蛋白/全长s蛋白的特异性结合水平，以确定突变是否影响突变蛋白与抗体的特异性结合。在不同的实施方式中，s蛋白/全长s蛋白包含约1至约200个突变、约1至约150个突变、约1至约100个突变、约1至约50个突变或约1至约20个突变。在不同的实施方式中，s蛋白/全长s蛋白包括来自sars-cov2病毒变体的s蛋白。例如，s蛋白/全长s蛋白是来自α变体(seq id no：3)，β变体(seq id no：4)，δ变体(seq idno：5)等的s蛋白。在不同的实施方式中，所述核酸包含seq id no：2、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8或与seq id no：2、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8共享至少约75％序列同一性的序列。在不同的实施方式中，核酸包括编码来自sars-cov2病毒变体的s蛋白的核酸。例如，s蛋白/全长s蛋白是来自α变体，β变体，δ变体等的s蛋白。在一些示例中，编码s蛋白变体的核酸包括seq id no：6(α变体)，seq id no：7(β变体)和/或seq id no：8(δ变体)。在不同的实施方式中，所述核酸包含与seq id no：2、seq id no：6、seq id no：7和/或seq id no：8共享至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。在一些实施方式中，所述核酸包含与seq id no：2、seq id no：6、seq id no：7和/或seq id no：8共享至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、至少约99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％或至少约99.9％的序列同一性的序列。在不同的实施方式中，核酸包含seq id no.2、seq id no：6、seq id no：7和/或seq id no：8的简并序列。在不同的实施方式中，编码s蛋白/全长s蛋白的核酸序列包括不少于约4000个核苷酸/碱基、不少于约3950个核苷酸/碱基、不少于约3900个核苷酸/碱基、不少于约3850个核苷酸/碱基、不少于约3800个核苷酸/碱基、不少于约3750个核苷酸/碱基，不少于约3700个核苷酸/碱基，不少于约3650个核苷酸/碱基，不少于约3600个核苷酸/碱基，不少于约3550个核苷酸/碱基或不少于约3500个核苷酸/碱基。在不同的实施方式中，编码s蛋白/全长s蛋白的核酸序列包含不少于约3830个核苷酸/碱基，不少于约3829个核苷酸/碱基，不少于约3828个核苷酸/碱基，不少于约3827个核苷酸/碱基，不少于约3826个核苷酸/碱基，不少于约3825个核苷酸/碱基，不少于约3824个核苷酸/碱基，不少于约3823个核苷酸/碱基，不少于约3822个核苷酸/碱基，不少于约3821个核苷酸/碱基，不少于约3820个核苷酸/碱基，不少于约3819个核苷酸/碱基，不少于约3818个核苷酸/碱基，不少于约3817个核苷酸/碱基，不少于约3816个核苷酸/碱基，不少于约3815个核苷酸/碱基，不少于约3814个核苷酸/碱基，不少于约3813个核苷酸/碱基，不少于约3812个核苷酸/碱基，不少于约3811个核苷酸/碱基，不少于约3810个核苷酸/碱基，不少于约3809个核苷酸/碱基，不少于约3808个核苷酸/碱基，不少于约3807个核苷酸/碱基，不少于约3806个核苷酸/碱基，不少于约3805个核苷酸/碱基，不少于约3804个核苷酸/碱基，不少于约3803个核苷酸/碱基，不少于约3802个核苷酸/碱基，不少于约3801个核苷酸/碱基或不少于约3800个核苷酸/碱基。在不同的实施方式中，编码s蛋白/全长s蛋白的核酸序列包括约2000至约4000个核苷酸/碱基、约3000至约4000个核苷酸/碱基、约3200至约4000个核苷酸/碱基、约3400至约4000个核苷酸/碱基、约3600至约3900个核苷酸/碱基，从约3700到大约3900个核苷酸/碱基，从大约3800到大约3850个核苷酸/碱基，从大约3820到大约3830个核苷酸/碱基或从大约3820到大约3825个核苷酸/碱基。在一个实施方式中，编码s蛋白/全长s蛋白的核酸序列包含约3822个核苷酸/碱基。在不同的实施方式中，编码s蛋白的核酸序列与seq id no：2、seq id no：6、seqid no：7和/或seq id no：8相比包括一个或多个突变，例如缺失、插入和/或与其他核苷酸/碱基的取代。在不同的实施方式中，突变的核酸序列编码seq id no：1、seq id no：3、seqid no：4、seq id no：5的蛋白质，或与seq id no：1、seq id no：3、seq id no：4和/或seqid no：5共享至少约75％，至少约76％，至少约77％，至少约78％，至少约79％，至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％序列同一性的蛋白质。在不同的实施方式中，突变的核酸序列编码的蛋白质与seq id no：1，seq id no：3，seq idno：4和/或seq id no：5共享至少约99.1％，至少约99.2％，至少约99.3％，至少约99.4％，至少约99.5％，至少约99.6％，至少约99.7％，至少约99.8％或至少约99.9％的序列同一性。在不同的实施方式中，突变的核酸序列编码的蛋白质与seq id no：1、seq id no：3、seq id no：4和/或seq id no：5的蛋白质具有基本相同的功能、活性、结构、折叠和/或抗原性质。在不同的实施方式中，核酸序列是密码子优化的。在不同的实施方式中，如本文所述宿主细胞与抗原结合蛋白或其片段结合，任选地是抗体，还任选地与抗sars-cov-2抗体结合。在另一方面，提供了一种检测受试者中针对sars-cov-2的抗体或其片段的方法，所述方法包括：接触/温育来自受试者的样品与本公开的宿主细胞；和检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。在不同的实施方式中，所述样品包括生物样品。在不同的实施方式中，所述生物样品包括流体生物样品或液体生物样品。所述液体生物样品或液体生物样品可以是血液、血清、血浆、痰液、灌洗液、脑脊液、尿液、精液、汗液、泪液、唾液等。在一些实施方式中，液体生物样品或液体生物样品包括全血、血清、血浆或其加工的馏分。在一些实施方式中，所述液体生物样品包括血清或血浆。在一些实施方式中，流体生物样品包含抗原结合蛋白如抗体。在不同的实施方式中，从受试者收集/获得的样品为感染后(pio)约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天或约30天。在不同的实施方式中，样品是从怀疑具有感染的受试者收集/获得的。在不同的实施方式中，样品是从显示与感染相关的症状的受试者收集/获得的。在不同的实施方式中，样品是从无症状受试者收集/获得的。所述方法的实施方式允许多重检测，其中不同的亚型(例如iga、igg和igm)或igg亚类(例如igg1、igg2、igg3和igg4)可以在单次测试中检测和/或区分。因此，在不同的实施方式中，所述方法能够检测至少1种、至少约2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种不同的抗体，其中所述抗体选自由iga、igm、igg(包括igg1、igg2、igg3和igg4)组成的组。在一个实施方式中，抗体包含igg。有利地，与总igg相比，检测igg1可能会提高灵敏度。在一个方面，提供了一种识别/表征冠状病毒感染的方法，任选地在受试者中感染sars-cov-2，所述方法包括：将来自受试者的样品与包含编码冠状病毒的刺突蛋白(s蛋白)的核酸的分离的宿主细胞接触/温育；并检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。在不同的实施方式中，提供了一种识别/表征冠状病毒感染的方法，任选地在受试者中感染sars-cov-2，所述方法包括：如本文所述将来自受试者的样品与宿主细胞接触/温育；并检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。在不同的实施方式中，对至少约一种、至少约两种、至少约三种、至少约四种、至少约五种或至少约六种同种型(例如igm、igg和四个igg亚类)的阳性应答表明受试者具有现在或以前/过去的冠状病毒感染，任选地现在或既往/既往的sars-cov-2感染。在一些实施方式中，所述方法包括对受试者进行分层治疗的方法。例如，强烈的抗体应答可能表明潜在的严重临床结果，因此可以密切监测和/或给予早期干预/治疗。例如，鉴于发现无症状受试者几乎无任何igg2和igg4，igg2和/或igg4反应可能表明潜在的严重临床结果，因此显示igg2和/或igg4反应的受试者可以密切监测和/或给予早期干预/治疗。在不同的实施方式中，所述方法还包括治疗受试者冠状病毒感染的步骤，任选地sars-cov-2，当受试者被确定为具有冠状病毒感染时，任选sars-cov-2。治疗受试者可能包括向受试者施用冠状病毒/sars-cov-2治疗剂或能够缓解或减缓医疗状况和/或其症状的治疗剂。在其各种实施方式中，提供了一种治疗受试者中冠状病毒感染的方法，任选地sars-cov-2，所述方法包括将受试者的样品与本公开的宿主细胞接触/温育，检测抗体或其片段与宿主细胞的结合，并向受试者施用冠状病毒/sars-cov-2治疗剂或能够减轻或减缓医疗状况和/或其症状的治疗剂检测到绑定事件时。在又一方面，提供了一种鉴定受试者对冠状病毒感染(任选地sars-cov-2感染)具有免疫力的方法，所述方法包括：将来自受试者的样品与本公开的宿主细胞接触/温育；并检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。在另一方面，提供了一种鉴定对冠状病毒感染(任选地sars-cov-2感染)具有免疫力的受试者的方法，所述方法包括：将来自受试者的样品与包含编码冠状病毒的刺突蛋白(s蛋白)的核酸的分离的宿主细胞接触/温育；并检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。不希望受理论的束缚，据信igg1和igg3的存在指示th1反应，这是一种促炎反应，并且在针对病毒的保护性免疫中特别重要。不希望受到理论的束缚，认为igg2和igg4反应表明th2反应，这在介导针对病毒的保护性免疫方面效果较差。在所述方法的实施方式中，主要igg同种型的检测允许鉴定受试者中的免疫应答类型(th1或th2)。例如，检测到主要是igg1和/或igg3可能表明受试者对冠状病毒感染(任选地sars-cov-2感染)具有免疫力。在又一方面，提供了一种评估冠状病毒疫苗在受试者中效率的方法，任选地使用sars-cov-1疫苗，所述方法包括将来自受试者的样品与包含编码冠状病毒的刺突蛋白(s蛋白)的核酸的分离的宿主细胞接触/温育；并检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。在不同的实施方式中，受试者已经接受了至少一剂冠状病毒疫苗。在不同的实施方式中，受试者已经接受了两剂、三剂、四剂或更多剂的冠状病毒疫苗。在不同的实施方式中，检测步骤包括使用荧光检测仪器如流式细胞仪来检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。在不同的实施方式中，检测步骤包括执行流式细胞术以检测抗体或其片段与宿主细胞的结合。在不同的实施方式中，所述方法还包括将样品与一种或多种检测抗体或第二抗体接触/温育。在不同的实施方式中，检测抗体或第二抗体选自以下组：抗人iga、抗人igg、抗人igg1、抗人igg2、抗人igg3、抗人igg4、抗人igm、小鼠抗人igg1、小鼠抗人igg2、小鼠抗人igg3和小鼠抗人igg4。可以理解的是，也可以使用其他合适的检测抗体或第二抗体。在不同的实施方式中，检测抗体或第二抗体与荧光标签或分子偶联/附着/偶联/标记。在不同的实施方式中，荧光标签或分子包括荧光染料或荧光团。荧光标签或分子可以是任何可由荧光检测仪器(如流式细胞仪)检测到的标签或分子。实例包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)、alexa fluor 647、alexa fluor 488、绿色荧光蛋白(gfp)、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)、羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(cfda-se)、dylight488、藻红蛋白(pe)、碘化丙啶(pi)、佩里地宁叶绿素蛋白复合物(percp)、percp-cy5.5、pe-alexa fluor700、pe-cy5(三色)、pe-cy5.5、pe-alexa fluor 750、pe-cy7、别藻蓝蛋白(apc)、apc-cy7、apc-efluor 780、alexa fluor 700、cy5、draq-5、pacific orange、amine aqua、pacificblue、4',6-二脒基-2-苯基吲哚hcl(dapi)、alexa fluor 405、efluor 450、efluor605纳米晶体、efluor 625纳米晶体和efluor 650纳米晶体。在不同的实施方式中，所述方法具有高灵敏度和/或高特异性。在不同的实施方式中，所述方法对于sars-cov-2检测，任选地抗sars-cov-2iga、igm和/或igg(包括亚类)检测具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的灵敏度。在一示例中，所述方法分别在约5天pio和约10天pio时对igm检测具有约19％和约61％的灵敏度。在一示例中，所述方法分别在约10天pio和约23天pio时对igg检测具有约86％和约100％的灵敏度。在各种实例中，所述方法在约10天pio时分别对igg1、igg2、igg3和igg4检测具有约64％、约37％、约46％和约32％的灵敏度。在不同的实例中，所述方法在约23天pio时分别对igg1、igg2、igg3和igg4检测具有约100％、约74％、约94％和约67％的灵敏度。在不同的实施方式中，所述方法显示出比igm检测更高的igg检测灵敏度。在不同的实施方式中，所述方法显示出与igg2和/或igg4检测相比，igg1和/或igg3检测的灵敏度更高。在不同的实施方式中，所述方法对于sars-cov-2检测，任选地抗sars-cov-2iga，igm和/或igg检测具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或约100％的特异性。在不同的实施方式中，所述方法显示与来自先前感染严重急性呼吸综合征(sars)的受试者的一个或多个样品、对照/健康样品和从季节性人cov感染受试者获得的样品的抗体几乎无或无交叉反应性。在一示例中，在对照样品中未检测到特异性igm。在一示例中，所述方法对于igm检测的特异性约为100％。在一个例子中，所述方法对igg检测的特异性约为94％。在不同的实施方式中，与igg检测相比，所述方法对igm检测显示出更高的特异性。在各种实例中，所述方法对igg1、igg2、igg3和igg4的特异性分别为约97％、约98％、约98％和约98％。在不同的实施方式中，与igg1检测相比，所述方法对igg2、igg3和/或igg4检测具有更高的特异性。在不同的实施方式中，所述方法与基于elisa的方法相比具有更高的灵敏度和/或特异性。在不同的实施方式中，所述方法能够检测sars-cov-2在症状前感染、无症状感染和/或具有轻度症状的感染。在不同的实施方式中，所述方法对症状前感染、无症状感染和/或症状轻微的感染具有很高的敏感性。在不同的实施方式中，所述方法能够检测至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的症状前感染、无症状感染和/或具有轻度症状的感染。在一示例中，所述方法能够检测97％的无症状感染者。在不同的实例中，所述方法具有比检测针对s蛋白的受体结合结构域(rbd)的中和抗体的方法更高的灵敏度和/或特异性。在不同的实施方式中，所述诊断方法为诊断方法，任选地是血清学诊断方法。在不同的实施方式中，所述方法还包括执行进一步的测定，例如基于聚合酶链反应(pcr)的测定，以检测/确认冠状病毒感染，任选地sars-cov-2感染在不同的实施方式中，所述方法是体外或离体方法。在一些实施方式中，所述方法可以是体内方法。在又一方面，提供了一种疫苗，其包含s蛋白/全长s蛋白(例如如上所述的s蛋白/全长s蛋白)和/或编码s蛋白/全长s蛋白的核酸(例如如上所述的核酸)。在各种实施方式中，疫苗缺乏或不包含或缺少sars-cov-2的多种其他基因/序列/蛋白质(编码s蛋白或s蛋白的基因/序列除外)之一。在一些实施方式中，疫苗缺乏或不包含或缺乏复制、转录和感染性病毒组装所必需的sars-cov-2的多种其他基因/序列/蛋白质。在一些实施方式中，疫苗缺乏或不包含或缺少小包膜(e)糖蛋白、膜(m)糖蛋白和核衣壳(n)蛋白、其它辅助蛋白和其它非结构蛋白(包括nsp1至nsp16)的其它基因/序列/蛋白质中的一种。在不同的实施方式中，提供了检测抗刺突蛋白抗体的方法，包括以下步骤：(a)温育从患者获得的用慢病毒颗粒转导的hek293t细胞的人生物样品，以在细胞表面稳定表达sars-cov2的s蛋白，以及(b)使用荧光激活细胞分选分析所述样品。还公开了如本文所述的产品或方法。【图的详细描述】本公开的实施例将从以下讨论中更好地理解并且容易地向本领域普通技术人员一人显而易见，如果适用的话，结合附图。应当理解，与结构、电气和光学变化有关的其它修改可以在不偏离本发明范围的情况下进行。实施例不一定是相互排斥的，因为有些可以与一个或多个实施例组合以形成新的示例性实施例。示例实施例不应被解释为限制公开的范围。图1.针对全长s蛋白的特异性抗体。在发病后中位数为5天pio(n＝34)、10天pio(n＝59)和23天pio(n＝66)的时间点从covid-19患者(n＝81)收集血浆样品。针对hek293t细胞表面表达的全长sars-cov-2-s蛋白的特异性(a)igm和(b)igg，以1:100稀释度筛选样品。对照样品包括来自康复sars患者的血浆样品(康复的sars，n＝20)，来自健康供体的血浆样品(健康，n＝22)和来自季节性人cov感染患者的血清(季节性cov，n＝20)。分析了具有阳性(c)igm和(d)igg应答的个体比例。数据显示为2个独立实验的平均值±sd，虚线表示健康供体的平均值+3sd。当结合大于健康对照的平均值+3sd时，样品定义为阳性。使用kruskal-wallis检验进行统计分析，然后进行事后邓恩多重比较检验。图中显示了不同时间点之间比较的p值，其中*表示p≤0.05，**表示p≤0.01。图2.针对全长s蛋白的特定igg亚类。在中位数为10天pio(n＝59)和23天pio(n＝66)的时间点从81名covid-19患者收集的血浆样品进一步筛查igg亚类，(a)igg1、(b)igg2、(c)igg3和(d)igg4。绘制了中位数为(e)10天pio和(f)23天pio的4个igg亚类反应。分析了在时间点(g)中位数10天pio和(h)中位数23天pio时有阳性应答的个体比例。数据显示为2个独立实验的平均值±sd，虚线表示健康供体的平均值+3sd。当结合大于健康对照的平均值+3sd时，样品定义为阳性。使用kruskal-wallis检验进行统计分析，然后进行事后邓恩多重比较检验。对于(a-d)，仅显示用于不同时间点之间比较的p值，其中*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001，****表示p≤0.0001。图3.前/无症状感染中的s蛋白特异性抗体谱。血浆样品是从疑似covid-19感染者中收集的，或者根据《新加坡传染病法》从普通人群中随机收集的。以1:100稀释度筛选样品，以针对hek293t细胞表面表达的全长sars-cov-2-s蛋白，以筛查特异性(a)igm、(b)igg、(c)igg1、(d)igg2、(e)igg3、(f)igg4。共分析了109份样品，包括pcr阳性和有症状感染的血清(pcr阳性，有症状；n＝16)、pcr阳性和无症状感染的血清(pcr阳性，无；n＝34)、pcr阳性和未知症状状态感染的血清(pcr阳性，未知；n＝11)、pcr阴性和未知症状状态感染的血清(pcr阴性，未知；n＝13)、pcr阴性/未进行和无症状感染的血清(pcr阴性/nd，无；n＝20)和来自pcr未知和未知症状状态感染的血清(pcr未知，未知；n＝15)。使用kruskal-wallis检验进行统计分析，然后进行事后邓恩多重比较检验。图中显示了pcr阳性、有症状和pcr阳性以及无症状感染之间比较的p值，其中*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001，****表示p≤0.0001。(g)通过血清学检测呈阳性的样品比例：sfb igm/igg、sfb所有同种型、cpass和rdt。当结合超过健康对照的平均值+3sd时，通过sfb测定将样品定义为阳性。具有阳性igm和/或igg的样品通过sfb igm/igg测定定义为阳性。具有阳性igm，igg，igg1，igg2，igg3和/或igg4的样品通过所有同种型sfb测定定义为阳性。数据显示为2个独立实验的平均值±sd，虚线表示健康供体的平均值+3sd。+，阳性；-，阴性；symp，有症状；无，无症状，nd，未进行。图4.总igg和igg1应答的比较。将来自nphl的所有109个样品的总igg应答与igg1应答进行比较：(a)pcr阳性和有症状感染(pcr阳性，有症状；n＝16)，(b)pcr阳性和无症状感染(pcr阳性，无；n＝34)，(c)pcr阳性和未知症状状态感染(pcr阳性，未知；n＝11)，(d)pcr阴性和未知症状状态感染(pcr阴性，未知；n＝13)，(e)pcr阴性/未进行且无症状感染(pcr阴性/nd，无；n＝20)，(f)pcr未知和未知症状状态感染(pcr-未知，未知；n＝15)。使用wilcoxon匹配对符号秩检验进行统计分析。显示了总igg和igg1应答之间比较的p值，其中*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001，****表示p≤0.0001。数据显示为2个独立实验的平均值±sd，虚线表示健康供体的平均值+3sd。nd，未进行。图5.全长s蛋白特异性抗体与疾病严重程度的关联。(a)igm中位数为5天pio。样品根据严重程度进行分类，表示轻度(临床严重程度0；n＝17)、中度(临床严重程度1；n＝11)和严重(临床严重程度2；n＝6)。(b)igm和(c)igg在中位数10天pio。根据严重程度对样品进行分类，表示轻度(临床严重程度0；n＝23)、中度(临床严重程度1；n＝12)和重度(临床严重程度2；n＝14)。(d)igg中位数23天pio。样品根据严重程度进行分类，表示轻度(临床严重程度0；n＝28)、中度(临床严重程度1；n＝22)和严重(临床严重程度2；n＝16)。数据以2个独立实验的平均值±sd表示。使用kruskal-wallis检验进行统计分析，然后进行事后邓恩多重比较检验。显示了不同时间点之间比较的p值，其中*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，p≤0.001，***表示p≤0.001。图6.特定igg亚类与全长s蛋白与疾病严重程度的关联。(a)igg1、(c)igg2、(e)igg3和(g)igg4，中位数10天pio。根据严重程度对样品进行分类，表示轻度(临床严重程度0；n＝23)、中度(临床严重程度1；n＝12)和重度(临床严重程度2；n＝14)。(b)igg1、(d)igg2、(f)igg3和(h)igg4在中位数23天pio时。样品根据严重程度进行分类，表示轻度(临床严重程度0；n＝28)、中度(临床严重程度1；n＝22)和严重(临床严重程度2；n＝16)。数据以2个独立实验的平均值±sd表示。使用kruskal-wallis检验进行统计分析，然后进行事后邓恩多重比较检验。图中显示了不同时间点之间比较的p值，其中*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001，****表示p≤0.0001。图7.phiv-sars-cov-2-sp-egpf的facs图谱分析和质粒图谱。将细胞选通：(a)fsc-a/ssc-a以排除细胞碎片，(b)fsc-a/fsc-h用于选择单个细胞，(c)fsc-a/pi用于选择活细胞(pi阴性群体)，(d，e，f，g，h)fitc/alexa fluor647。结合由被特异性抗体结合的gfp阳性s蛋白表达细胞的百分比决定，由alexa fluor 647和fitc阳性事件(门2)指示。(d)pbs对照；(e)6.25μg/ml ace-人类fc；(f)1μg/ml 5a6 s蛋白rbd特异性单克隆抗体；(g)健康对照血浆，按1:100稀释；(h)covid-19患者血浆，1:100稀释。图8.通过sfb测定和线性表位elisa比较总igg应答。在中位数为10天pio(n＝59)和23天pio(n＝66)的时间点从covid-19患者(n＝81)收集血浆样品。比较发病后中位数10天(pio)和(b)中位数23天pio时间点的总igg和igg1应答。通过sfb测定和线性表位elisa分析的时间点(c)中位数10天pio和(d)中位数23天pio时有阳性应答的个体比例。数据显示为2个独立实验的平均值±sd，虚线表示健康供体的平均值+3sd。当结合超过健康对照的平均值+3sd(n＝22)时，样品定义为阳性。图9.特异性igm(a-c)和igg(d-f)与全长s蛋白的关联，具有不同的临床结局、肺炎、氧气供给需求和重症监护病房(icu)入院情况。(a，d)肺炎，(b，e)氧气供给需求和(c，f)icu入院的阴性和阳性观察结果分别表示为-和+。数据以2个独立实验的平均值±sd表示。使用kruskal-wallis检验进行统计分析，然后进行事后邓恩多重比较检验。图中显示了不同时间点之间比较的p值，其中*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001，****表示p≤0.0001。图10.特异性(a-c)igg1、(d-f)igg2、(g-i)igg3和(j-l)igg4与全长s蛋白的关联，具有不同的临床结局、肺炎、氧气供给需求和重症监护病房(icu)入院情况。(a、d、g、j)肺炎、(b、e、h、k)氧气供给需求和(c、f、i、l)icu收治的阴性和阳性观察结果分别表示为-和+。数据以2个独立实验的平均值±sd表示。使用kruskal-wallis检验进行统计分析，然后进行事后邓恩多重比较检验。图中显示了不同时间点之间比较的p值，其中*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001，****表示p≤0.0001。图11.igg1和igg3亚类与中和能力的相关性。spearman r为0.6到0.8表示强相关性。图12.针对野生型(wt)、α和β变体的s蛋白特异性抗体谱。血浆样品是在发病后(pio)中位数31天从covid-19感染sars-cov-2患者中收集的(n＝57)。以1:100稀释度筛选样品，针对hek293t细胞表面表达的全长sars-cov-2-s蛋白的不同变体进行特异性igg筛查。数据显示为2个独立实验的平均值±sd。使用friedman检验对配对样品进行统计分析，然后进行事后邓恩多重比较检验。显示了用于组间比较的p值，其中****表示p≤0.0001。图13.接种covid-19疫苗后针对野生型(wt)和δ变体的s蛋白特异性抗体谱。在接种第二剂辉瑞covid-19疫苗(n＝50)70天后，从接种疫苗的个体身上收集血浆样品。以1:100稀释度筛选样品，针对hek293t细胞表面表达的全长sars-cov-2-s蛋白的不同变体进行特异性igg筛查。数据显示为2个独立实验的平均值±sd。对student's t test进行统计分析。显示了用于组间比较的p值，其中****表示p≤0.0001。【实验部分】【实施例1】【实验模型及受试者详情】【伦理】针对covid-19、康复sars和季节性人类cov患者队列的研究设计和方案由国家医疗保健组织(nhg)领域特定审查委员会(dsrb)批准，并分别遵循批准的研究2012/00917、2020/00091和2020/00076中的伦理准则。根据批准的研究2017/2806和nus irb 04-140收集健康供体样品。根据《赫尔辛基人类研究宣言》获得了参与者的书面知情同意。在国家公共卫生实验室(nphl)接收的所有样品都是根据新加坡传染病法收集的，该法允许流行病学研究和使用数据进行分析以控制爆发(singapore statutes online，2003)。【血浆样品】【covid-19患者】从2020年1月至3月，共有81名患者被招募到研究中，他们在鼻咽拭子中检测出sars-cov-2的pcr阳性(pung等人，2020)。从患者记录中检索人口统计数据、临床和实验室参数以及住院期间的临床严重程度(表2)(amrun等人，2020年)。根据临床严重程度将患者分为3组：轻度(无肺炎；临床严重程度0)、中度(无缺氧肺炎；临床严重程度1)和重度(肺炎伴缺氧；临床严重程度2)。将患者的全血收集到bdcpttm管中，并以1700g离心20分钟以获得血浆组分。血浆样品根据3个时间点进行分类：发病后(pio)中位数5天、中位数10天pio和中位数23天pio。【康复的sars和季节性人类cov患者】在2003年爆发期间(leong等人，2006年)共联系并登记了先前被诊断患有sars-cov的20人(表2)。从上述康复的sars个体中分离血浆组分。本研究还使用了2012-2013年间收集的人类cov患者的存档样品(表2)。这包括使用seegene rv12呼吸道多重试剂盒确认的来自7种α-cov(229e/nl63)和6种β-cov(oc43)感染的感染后样品(jiang等人，2017年)。【nphl收到的样品】在国家公共卫生实验室(nphl)接收的血浆样品是从康复期病例、疑似感染者和一般人群中收集的，用于血清流行率研究。根据pcr状态和患者症状状态共对109个样品进行分类(表2)：(1)pcr阳性和有症状，n＝16，(2)pcr阳性和前/无症状，n＝34，(3)pcr阳性和患者症状状态未知，n＝11，(4)pcr阴性和患者症状状态未知，n＝13，(5)pcr状态-阴性/未进行且无症状，n＝20，(6)pcr状态未知和患者症状状态未知，n＝15。【方法详情】【s蛋白表达细胞系的产生】编码s蛋白的sars-cov-2 s基因(genbank：qhd43416.1)经过密码子优化(表3)以由人类哺乳动物细胞表达。全长s基因通过ires(内部核糖体进入位点)和egfp基因上游的xbai和bamhi位点克隆到phiv-egfp转移质粒中(表3)。然后将转移质粒phiv-sars-cov-2-sp-egpf与包装和包膜质粒(pmd2.g，pmdlg/prre和prsv-rev)共转染到hek293t细胞中。8-16小时后更换培养基(dmem+10％ fbs)，并在进一步温育48小时后收集上清液中的慢病毒颗粒。通过加入慢病毒上清液和8μg/ml聚凝胺来转导细胞，然后在室温下以1200×g离心1小时。在细胞培养箱中8-16小时后更换培养基。再温育48小时后，对表达egfp的hek293t细胞进行分选、扩增和冷冻保存。s蛋白的表达通过ace2结合得到证实(图8)。简而言之，将细胞以每孔1.5×105个细胞接种在96孔v底板中。首先将细胞与ace2-hufc(用人fc区域标记的ace2蛋白，6.25μg/ml)一起温育，然后用双染色进行二次温育，由alexa fluor 647偶联的抗人igg(1:500稀释)和碘化丙啶(pi；1:2500稀释)组成。在lsr4激光器(bd biosciences)上读取细胞，并使用flowjo(tree star)进行分析。【表3：密码子优化的sars-cov-2-s基因和用于测序全长sars-cov-2-s蛋白的引物的dna序列】【用于s蛋白抗体检测的流式细胞术】将表达s蛋白的细胞以每孔1.5×105个细胞接种在96孔v底板中。首先将细胞与人血清(在10％ fbs中以1:100稀释)温育，然后用双染色进行二次温育，由alexa fluor 647偶联的第二抗体(稀释1:500)和碘化丙啶(pi；稀释1:2500)组成。使用的第二抗体是偶联抗人igm或igg。对于检查igg亚类的测定，二次温育是小鼠抗人igg1，igg2，igg3或抗人igg4。在二次温育之后，然后将细胞与alexa fluor 647偶联的抗小鼠igg一起温育。在bdbiosciences lsr4激光上读取细胞并使用flowjo(tree star)进行分析。【线性表位igg elisa】如前所述进行elisa(amrun等人，2020)。简而言之，将maxisorp平底96孔板在4℃下用1:2000稀释的中性亲和素蛋白(1mg/ml)包被过夜。在加入混合或单一生物素化肽(在0.1％ pbst中1:2000稀释)和血浆样品(在0.1％ pbst中1:1000稀释)之前，将板用0.1％pbst中0.01％聚乙烯醇(pva)溶液(封闭缓冲剂)封闭。在封闭缓冲液中稀释的山羊抗人igg-hrp用于检测肽结合抗体。然后将四甲基联苯胺底物加入板中，并使用0.1m硫酸停止反应。使用infinite m200读板器(tecan，固件v_2.02_11/06)上的波长(450nm)进行吸光度测量。在所有步骤中，将板在室温下在旋转振荡器上温育1小时，并在步骤之间用0.1％ pbst洗涤2次。【genscript cpass中和抗体检测试剂盒】根据制造商的说明，通过genscript cpass中和抗体检测试剂盒分析血清样品。简而言之，首先将血清样品在提供的样品稀释缓冲液中以1:10稀释，然后以1:1的体积比与hrp偶联的rbd混合，并在37℃下温育30分钟。将混合物加入到试剂盒中捕获板中的孔中，以便在37℃下再次温育15分钟。洗涤后，将tmb溶液加入板中，并将板在25℃下在黑暗中温育15分钟。加入终止溶液后，立即用日出酶标仪(tecan)读取450nm处的吸光度。当抑制为～20％时，将样品定义为阳性-根据制造商的说明，抑制计算为抑制＝(1-样品的od值/阴性对照的od值)×100％。读数10-30％抑制被定义为临界结果。【wondfo sars-cov-2igg/igm快速诊断检测(rdt)】根据制造商的说明，通过wondfo sars-cov-2igg/igm rdt对血清样品进行分析。简而言之，首先将血清样品添加到样品孔中，然后再将检测缓冲液添加到缓冲液孔中。然后将测试试剂盒在室温下放置15分钟，然后目视读取。【量化与统计分析】【流式细胞术定量s蛋白抗体】通过lsr4激光器(bd biosciences)测定特异性抗体与细胞的结合并使用flowjo(tree star)进行分析。将细胞选通：(1)fsc-a/ssc-a以排除细胞碎片(图8a)，(2)fsc-a/fsc-h用于选择单个细胞(图8b)，(3)fsc-a/pi用于选择活细胞(pi阴性群体，图8c)，(4)fitc/alexa fluor 647(图8d-h)。结合由被特异性抗体结合的gfp阳性s蛋白表达细胞的百分比决定，由alexa fluor 647和fitc阳性事件(门2)指示。当结合超过健康对照的平均值+3sd(n＝22)时，样品定义为阳性。使用81名covid-19患者的队列(表2)，测定的灵敏度或真阳性率由(真阳性)/(真阳性+假阴性)定义，用百分比表示。sfb测定的特异性或真阴性率由(真阴性)/(真阴性+假阳性)定义，以百分比表示。为了计算特异性，包括三个对照组：康复sars(n＝20)，健康对照(n＝22)和季节性人类cov(n＝20)。【表2：有症状的covid-19患者、健康捐赠者、康复的sars、季节性人类cov患者以及国家公共卫生实验室(nphl)样品的人口统计学和临床信息】*供体之一的信息未知。**卫生部。sars：严重急性呼吸系统综合症冠状病毒属(coronavirus)；人类cov：人类冠状病毒【统计分析】统计分析是使用graphpad prism(graphpad软件)完成的。为了在多组之间进行比较，使用kruskal-wallis检验和使用邓恩多重比较检验的事后检验来确定显著差异。对于总igg和igg1应答之间的配对比较，使用wilcoxon匹配对符号秩检验。小于0.05的p值被视为显著值，其中*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001，****表示p≤0.0001。【表4：关键资源表】【结果】【感染过程中针对全长s蛋白的特异性抗体谱】为了表征covid-19患者的抗体谱，本公开的发明人开发了一种基于全长sars-cov-2-s蛋白(sfb测定)的流式细胞术测定，该测定允许检测更广泛的抗体库，例如与s蛋白的各种结构域和构象表位结合的抗体。为此，用慢病毒颗粒转导hek293t细胞，在细胞表面表达全长s蛋白。通过检查ace2-hufc(用人fc标记的ace2蛋白)和s蛋白rbd(受体结合结构域)特异性单克隆抗体克隆5a6与s蛋白表达细胞的结合，验证了s蛋白在细胞表面的表达(图7)。使用表达s蛋白的细胞，发明人在感染发病后(pio)中位数为5天，10天和23天的时间点检查了在感染过程中有症状的covid-19患者中针对全长s蛋白的抗体应答(n＝81；表2)。还并行评估了各组对照组(表2)：(1)康复的sars个体(n＝20)，(2)健康对照(n＝22)和(3)季节性人类cov患者(n＝20)。在covid-19患者中检测到针对s蛋白的特异性igm，中位数为10天pio的时间点的反应高于中位数为5天pio的时间点(图1a)。在对照组中未检测到特异性igm。共有19％的患者早在中位数5天时就有阳性igm应答(图1c)。中位数10天pio，61％的患者获得igm。值得注意的是，在所有对照组中均未检测到特异性igm，这突出了测定的特异性(图1a和1c)。与igm类似，时间点中位数23天pio的特异性igg应答高于中位数10天pio(图1b和1d)。86％的患者在中位数10天pio时检测到igg血清转换(图1d)，中位数23天pio达到100％血清转换。四名康复的sars个体表现出对sars-cov-2-s蛋白的igg交叉反应性(图1b和1d)。本发明人先前还报道了使用线性表位igg elisa的同一组患者的抗体应答(amrun等人，2020)。同样，观察到特异性igg(图8)。比较sfb测定和s蛋白线性表位igg elisa(s14p5，s20p2，s21p2)，sfb测定在2个时间点检测到更大比例的患者(图8)。有趣的是，n蛋白线性表位elisa(n4p5)早在10天pio时就检测到98％的患者的特异性igg，这表明针对n蛋白的特异性抗体的产生动力学可能不同。【igg1是特异性针对s蛋白的主要igg亚类】本公开的发明人接着研究了covid-19患者的特异性s蛋白igg亚类谱。在患者中检测到所有4种igg亚类反应，中位数23天pio时的反应高于中位数10天pio时的反应(图2a-d)。igg1应答占主导地位，其次是igg3，igg2，最后是igg4(图2e和2f)。igg亚类血清转换在中位数10天时较低(图2g)。到中位数23天pio时，所有患者的igg1应答均为阳性，而74％、94％和67％的患者对igg2、igg3和igg4反应呈阳性(图2h)。这证明了covid-19患者的所有针对s蛋白的igg亚类随着时间的推移的同种型转换，其中igg1应答是最主要的igg亚类。【sfb检测具有特异性和敏感性】本公开的发明人接下来评估了sfb测定法在诊断sars-cov-2中的效用。使用对照组(康复的sars(n＝20)，健康对照组(n＝22)和季节性人类cov(n＝20))，sfb测定对igm和igg检测的特异性分别为100％和94％(表1)。igm检测未观察到交叉反应。对于igg，在4/20康复的sars患者中观察到交叉反应，但在健康对照和季节性人类cov患者中无观察到交叉反应。sfb测定对igg1，igg2，igg3和igg4的特异性分别为97％，98％，98％和98％。对于igg1，发明人观察到与1/20康复的sars患者和1/22的健康对照的交叉反应性。对于igg2、igg3和igg4，在1/22健康对照中检测到交叉反应。使用81名covid-19患者的队列(表2)，虽然sfb测定法对igm检测的灵敏度较低(在时间点中位数分别为5天pio和10天pio为19％和61％)，但sfb测定对igg检测更敏感，在时间点中位数分别为10天pio和23天pio为86％和100％(表1)。不出所料，在抗体应答较低的时间点中位数10天pio中位数，sfb测定对igg1、igg2、igg3和igg4检测的灵敏度较低，分别为64％、37％、46％和32％。在中位数23天pio的较晚时间点，sfb测定的灵敏度更高，对igg1和igg3检测的敏感性为100％和94％，但对igg2和igg4检测的敏感性较低，分别为74％和67％。【表1：特定s蛋白抗体的受试者工作特征(roc)谱】*阈值定义为健康对照的平均值+3sd(n＝22)【sfb检测可检测前/无症状感染】在建立了用于有症状感染的血清学分析的sfb测定之后，发明人继续进一步检查该测定的敏感性并评估该测定对于在诊断实验室接收的样品进行血清学诊断的可行性，其中关于样品的信息可能有限。新加坡国家公共卫生实验室(nphl)接收了从康复期病例、疑似感染者和一般人群中收集的样品，以进行血清流行率研究。共筛选109个样品，按pcr状态和症状状态分组(表2)：(1)pcr阳性和症状，n＝16，(2)pcr阳性和前/无症状，n＝34，(3)pcr阳性和未知症状状态，n＝11，(4)pcr阴性和未知症状状态，n＝13，(5)pcr状态阴性/未进行且无症状，n＝20，(6)pcr状态-未知和未知症状状态，n＝15。与早期81名covid-19患者的研究结果一致，sfb测定在pcr阳性和有症状的感染中检测到针对s蛋白的igm(图3a)和igg(图3b)，以及igg亚类(图3c-f)。更重要的是，该测定还检测了pcr阳性和前/无症状感染中针对s蛋白的特异性igm和igg以及igg亚类，其中igg1是主要的igg亚类。对于所有同种型，该组的抗体应答明显低于pcr阳性和有症状感染样品的抗体应答。同样，对于其余4组，所有同种型反应也低于pcr阳性和有症状感染样品观察到的反应。igg1也是观察到的主要igg亚类，而igg2和igg4的水平可以忽略不计。有趣的是，对于所有组，观察到比总igg应答更大的igg1应答(图4)。这表明使用sfb测定法检测igg1可能会提供更高的灵敏度。【sfb与市售血清学检测的比较】nphl接收的所有样品首先通过两种市售血清学测定进行评估：(1)genscriptcpass s蛋白rbd中和抗体检测试剂盒，因为它能够检测靶向s蛋白rbd的中和抗体，以及(2)wondfosars-cov-2igg/igm快速诊断检测(rdt)，具有未公开的抗原特异性，由于快速检测形式和易于应用于高通量筛选。除了从pcr阳性和有症状感染中收集的样品(两种商业抗体检测呈阳性)外，其余92个样品中的大多数都产生了两种商业检测的临界或差异结果，并通过sfb检测选择进行分析。相比之下，发现sfb测定是高度敏感的。对于pcr阳性和有症状的感染，所有同种型sfb测定与两种市售测定相当，可检测100％的感染(图3g)。更重要的是，所有同种型sfb测定能够检测到97％的pcr阳性和前/无症状感染，而cpass和rdt测定分别为32％和35％。对于pcr阳性和未知症状状态样品，所有同种型sfb测定检测到100％的样品，而cpass测定为18％，rdt测定为100％。同样，对于其余3组，sfb测定比cpass和rdt测定更灵敏(图3g)，能够检测到62％的pcr阴性和未知症状状态样品，95％的pcr阴性/未进行且无症状感染，以及80％的pcr未知和未知症状状态样品。这一发现证明了sfb测定的高灵敏度，使该测定可以作为检测无症状感染的工具。【与疾病严重程度相关的s蛋白抗体】使用其他血清学方法(例如elisa)，最近的研究报告了针对s蛋白和n蛋白的高水平特异性抗体与疾病严重程度之间的关联(amrun等人，2020；long等人，2020a；okba等人，2020年；qu等人，2020；zhang等人，2020)。因此，还研究了当前队列中是否存在特异性igm和igg与全长s蛋白和疾病严重程度之间的这种关联，以及这种关联是否具有特定igg同种型的特异性。这一点尤其重要，因为2型反应(例如高水平的igg2和igg4)已被假设与疾病增强有关(arvin等人，2020年；alwis等人，2020年；liu等人，2019)。将患者分为三组：轻度(无肺炎，临床严重程度0)、中度(无缺氧肺炎，临床严重程度1)或重度(肺炎伴缺氧，临床严重程度2)(wong等人，2020)。不出所料，在中位数5天pio，igm应答低，无观察到三个疾病严重程度组之间的任何显著差异(图5a)。通过中位数10天pio，特异性igm应答与疾病严重程度相关，其中严重组的患者表现出显著更高的igm应答(图5b)。在2个时间点(中位数为10天和23天)，特异性igg应答也与疾病严重程度有关(图5c和5d)。进一步检查了特定的igm和igg应答是否与特定的临床结局相关，例如肺炎(图9a和9d)，氧气供应需求(图9b和9e)和重症监护病房(icu)入院(图9c和9f)。虽然仅在时间点(中位数为23天pio)发现特异性igg应答与肺炎之间存在关联，但早在时间点(中位数为10天pio)就观察到特异性igm和igg应答与更严重的临床结局(如氧气供应需求和icu入院)的关联。还观察到所有特异性igg亚类与疾病严重程度之间的关联在中位数10天和23天pio(图6)2个时间点无特异性同种型失衡。在中位数时间为23天pio，在肺炎患者和需要入住icu的患者中检测到较高的igg1，igg2，igg3和igg4反应，但中位数为10天pio时未检测到(图10a，10d，10g，10j)。相比之下，早在10天pio时就发现所有igg亚类的较高反应与氧气供应需求之间存在关联(图10b，10e，10h，10k)。目前控制covid-19大流行的策略需要限制世界人口，这在长期内是不可持续的。逐步放宽控制措施将需要对人口进行阳性监测，以确保及早发现新感染、追踪和隔离接触者，并继续采取社交距离措施以阻止传播。血清学检测有助于确认有症状的感染和检测症状前、无症状或已康复的个体。发明人先前已经开发出一种基于elisa的s蛋白和n蛋白上4种免疫显性igg线性表位的血清学测定(amrun等人，2020)。为了捕获更广泛的s蛋白抗体库，本研究基于全长s蛋白开发了流式细胞术测定。该检测更省时-两小时内即可获得结果。该测定也非常适合检测有症状患者的抗s蛋白抗体。有症状的covid-19患者在感染过程中获得了特异性igm和igg，所有患者在感染后期(中位数为23天pio)都有可检测到的抗体应答(图1)。该测定的一个定义特征是其检测针对s蛋白的特定igg亚类的能力。在本公开的队列中，发现所有igg亚类都是由covid-19患者获得的，其中igg1是最主要的igg亚类。与总igg类似，igg亚类在感染后期的反应明显更大，并且与疾病严重程度密切相关。这与ni等人(ni等人，2020年)的一项研究一致，该研究还发现igg1对s蛋白和n蛋白的rbd有主要反应。将igg亚类纳入血清学检测非常重要，可以弥合在了解针对covid-19的保护性免疫和防止再次感染的可能性方面的知识差距。igg1和igg3诱导，通常表示th1反应(kawasaki等人，2004)，是一种促炎反应，在针对病毒的保护性免疫中特别重要。igg1和igg3对许多不同的病毒具有更高的中和能力(hofmeister等人，2011；richardson等人，2019；walker等人，2020年)。随着越来越多的无症状个体具有与有症状个体相似的传播能力的报告(bai等人，2020；hu等人，2020年)，很明显，无症状感染者在传播中发挥作用，对于阻止无症状传播以及有效控制covid-19疾病也至关重要。本公开的发明人发现sfb测定能够有效地检测pcr阳性和前/无症状感染。sfb检测可能是检测covid-19感染的更有效工具，并且在确定暴露方面可能更具信息性。据报道，cpass检测(genscript，2020年)和rdt检测(bilcare，2020年)的灵敏度分别为94％和86％，但发现sfb检测更敏感，能够在商业cpass和rdt检测结果不一致或临界的情况下检测特异性抗体。检测到特异性igm和igg，其中igg1是最主要的igg亚类。pcr阳性和无症状前/无症状患者的抗体应答显著降低，这与最近的一项研究一致(long等人，2020b)。尽管抗体水平较低，但该测定能够检测到97％的这些感染，其中cpass和rdt无产生明确的血清学结果。这表明需要更灵敏的检测，例如sfb检测，以检测抗体应答较弱的预/无症状感染，特别是用于确定人群中的暴露。sfb测定相对于cpass测定的更高灵敏度可归因于测定的靶标-sfb测定基于全长s蛋白，允许捕获针对各种结构域和构象表位的抗体，而cpass测定旨在检测针对s蛋白rbd的特异性中和抗体，这些抗体阻断rbd结构域与ace2之间的相互作用，它在宿主细胞上的受体。rdt的靶标尚未披露。它也有可能基于s蛋白的特定结构域，因此捕获较小的s蛋白抗体库。靶标也可能是不同的蛋白质，例如n蛋白，从而识别具有不同动力学的抗体诱导的不同抗体集。重要的是，通过sfb测定法检测igg1亚类是确定病毒暴露的关键，并且比单独检测igg提供更好的灵敏度-在所有组中观察到与总igg相比，igg1应答显著更高(图4)。这可能是由于第二抗体，因为第二抗人igg抗体可能无法以相似的效率与所有igg亚类结合。更重要的是，更大的igg1应答(超过总igg)可能是由于前带效应，其中高水平的抗体导致缺乏抗原结合(goh等人，2015；lieberman等人，1988年；taborda等人，2003年；zollinger和mandrell，1983)。有研究报告，早在一个月后，针对sars-cov-2的特异性igg就会迅速衰减(ibarrondo等人，2020年；seow等人，2020)。虽然随着时间的推移，igg水平可能会下降，但缺乏igg结合也可能部分是由于前带效应。因此，检测总igg的一个子集(即igg1抗体)可能优于总igg的全部库。血清学测定是对用于covid-19诊断的pcr测定的补充。作为正在进行的血清流行病学研究的sfb测定的初步评估，本公开测试了nphl队列中pcr阴性的潜在暴露个体。共有13个此类样品的临界阳性或与cpass和rdt测定不一致。sfb检测检测到这些病例中的8/13(62％)，表明其中一小部分已被感染/暴露于病毒。新加坡的大多数covid-19病例都是居住在难以保持社交距离的宿舍的移民工人人口(chew等人，2020年)。作为新加坡卫生部(moh)对宿舍居民监测的一部分，从无症状且pcr阴性/未进行状态的宿舍居民身上收集样品，以评估宿舍中的传播情况。共有20个样品在cpass和rdt中处于临界或差异。sfb检测检测到95％的这些病例。这些发现表明，血清学检测组合使用是补充pcr检测的关键诊断工具，也进一步证明了sfb检测的高灵敏度。虽然检测无症状感染需要高灵敏度，但具有高特异性也很重要。血清学检测的一个主要限制是假阳性诊断的风险。由于sfb检测由六个测试(igm，igg和四个igg亚类)组成，因此允许内部验证。对于测试的98/109样品，检测到两种或多种同种型的阳性应答。11/109测试的样品仅对一种同种型有阳性应答，其中4/11也通过cpass或rdt测试发现阳性，另外4/11虽然通过cpass和rdt测试呈阴性，但pcr呈阳性。这表明应谨慎解释边缘阳性结果。sfb测定的另一个限制是它是一种基于细胞的测定。对细胞培养的依赖性需要提前计划以确保足够的细胞计数，从而限制了测定在高通量筛选中的应用。血清学检测相辅相成，提供更好的诊断-允许hts的cpass和rdt检测可以作为第一轮筛选，更灵敏的sfb检测可以提供临界/差异样品的确认和进一步调查。本文描述的方法可以适于使用不同的荧光团在一次测试中检测所有六种同种型的测定。这有利于减少每个样品的测试次数。同样值得注意的是，虽然本研究使用了大型流式细胞仪(lsr4，bd biosciences)，但该测定也可以开发用于便携式流式细胞仪，例如accuri(bd biosciences)，它可以部署在机场或边境等地方的小型实验室环境中。本公开的发明人还观察到抗体应答也与疾病的严重程度密切相关。这也与最近的其他研究一致，表明抗体水平与疾病严重程度之间存在关联(amrun等人，2020年；long等人，2020a；okba等人，2020年；qu等人，2020；zhang等人，2020)。抗体应答与igg2或igg4相对于igg1或igg3抗体的同种型失衡无关。假设由ii型细胞因子反应诱导的igg2和igg4能够介导病毒感染增强或疾病增强(arvin等人，2020年；alwis等人，2020年；liu等人，2019)。然而，发现无症状患者几乎无任何igg2和igg4。因此，尽管igg1和igg3水平很高，但在严重患者中观察到的针对s蛋白的igg2和igg4水平可能是最近在印本前研究中提出的部分原因(hoepel等人，2020年)。这是一个极其重要的问题，值得进一步研究。综上所述，目前的发现表明sfb可用于有症状感染的血清学确认。sfb也可与其他血清学检测相结合，以检测无症状感染者并获得社区血清流行率。这将是血清监测的工具，并为社区中未发现和未确诊的covid-19病例的程度提供重要的见解。此外，sfb测定还可用于检查先前感染的个体在康复后很长时间内的抗体应答，以便更好地了解针对covid-19的抗体介导保护的持久性。sfb测定的高灵敏度在疑似感染的临床调查和集群内的流行病学联系中也特别有用，这可能会产生临界/差异结果，甚至被灵敏度较低的血清学测定遗漏。它有助于追踪缩小范围的工作，以限制社区传播的程度。在世界各国政府寻求逐步重新开放经济的时候，这一点尤其重要。这将大大有助于形成更好的公共政策决策，以管理和限制covid-19感染。【实施例2】材料：·1.5ml微量离心管·1×pbs缓冲液·山羊抗人igg alexa fluor 647(thermofisher)·山羊抗人igm alexa fluor 647(thermofisher)·triton x灭活血浆来自健康对照、急性和康复的covid患者【贮藏】染色的样品将在4℃的黑暗中储存直至采集。【准备和运输】人体样品必须储存在具有二级收容(冷却箱)的三重生物危害自封袋(在冰上)中以便运输。【一般准则】1.生物安全柜(bsc)和实验室设备(即移液枪、微量移液器)的表面应在使用前后用1％的virkon溶液擦拭。2.工作人员应按以下方式穿戴相应的个人防护装备：a.一次性实验室外套，安全护目镜，口罩，发网套，鞋套，双层手套(内乳胶，外丁腈)。3.将生物危害袋(双层袋)、装有1％的virkon溶液的废液瓶以及装有多折毛巾和1％的virkon溶液的容器放入平衡计分卡中，用于擦拭工作。4.将bsc工作区分为(1)清洁区、(2)工作区和(3)废物区。5.通过吸出1％的virkon并将其留在废物容器中，然后将其丢弃到双袋生物危害废物箱(放置在bsc中)来净化使用的血清移液器。6.任何需要从平衡计分卡中取出的东西都应通过1％的virkon溶液进行净化，步骤如下：a.用1％的virkon溶液润湿多折毛巾，然后擦拭手套。b.在放入净化区域之前，对清洁区域内的区域进行净化并擦拭物体表面。c.等待5分钟，然后再将它们取出平衡计分卡。7.完成后，用1％的virkon溶液(等待5分钟)和70％乙醇擦拭bsc，架子，移液器和其他设备/物体的壁和表面进行消毒，然后再将它们从bsc中取出。让1％的virkon中的废液净化过夜。将生物危害袋丢弃到更大的生物危害袋中并送去高压灭菌。【程序】用血浆样品对细胞进行facs染色(在bsc-ii中进行)：1.用pbs洗涤表达sars-cov-2刺突蛋白的el4细胞2.以1:100稀释血浆样品。轻轻轻弹试管混合a.注意：所有血浆样品在用于本sop之前首先由ln团队进行氚同灭活。3.将稀释的血浆加入el4细胞中，轻轻重悬并在30℃下温育4分钟。4.用pbs洗涤2次(以1500×rpm离心5分钟)。5.加入稀释的第二抗体1:500(山羊抗人igg alexa fluor 647或山羊抗人igmalexa fluor 647)，轻轻重悬并在30℃的黑暗中温育4分钟。6.用pbs洗涤3次(以1500×rpm离心5分钟)。7.除去上清液，注意不要干扰细胞沉淀。留下一些体积以防止细胞变干。8.将细胞储存在4℃的黑暗中，直到在lsrii(4个激光)上采集。【bd lsr ii(4激光)流式细胞仪的操作】1.将流式细胞仪置于待机状态。2.断开废物、空气管路和护套管与相应容器的连接。3.丢弃废物并加满1l漂白剂，然后重新连接废管。4.释放护套容器中的压力并重新填充pbs，然后再重新连接管道。5.释放夹以去除管道中的任何气泡。6.在打开bd facsdiva软件之前检查激光输出。7.运行彩虹校准“8峰”颗粒以检查发射荧光团。8.在采集之前脉冲涡旋每个样品管，确保阈值速率不超过15，000个事件/秒。9.将管子丢弃到生物危害废物容器中。10.对其他样品和/或面板重复步骤8和9。a.在样品进样口(sip)下方放置一个装满virkon的烧杯，以收集任何残留的回流。11.重新运行彩虹校准“8峰”颗粒以检查发射荧光团。12.采集后，按以下步骤清洗机器：a.运行facs清洁溶液5分钟，流速设置为“高”；b.运行facs冲洗溶液5分钟，流速为“高”；c.将水流5分钟，流速设置为“高”。13.在关闭细胞仪和计算机之前，将细胞仪置于待机状态。【废弃物管理】·多余的人体样品将被丢弃到1％的virkon中并放置去污至少24小时，然后丢弃到水槽中。·一次性耗材(例如血清移液器、吸头、试管和板)在处置在双袋生物危害废物袋之前，应浸泡在1％的virkon中。·所有设备使用后用1％的virkon和70％乙醇进行净化。·生物安全柜在使用后用1％的virkon进行去污，并在每次实验前后进行uv-ed。【实施例3】用慢病毒颗粒转导hek293t细胞，以在细胞表面稳定表达sars-cov2的s蛋白。将表达s蛋白的细胞与患者的血浆一起温育30分钟，然后和与荧光团偶联的抗人抗体温育20分钟。在流式细胞术中检测到特异性抗体的结合(图1)。发明人筛选了一个队列，包括61名健康对照和66名患者(图1)。与健康对照组或季节性cov无交叉反应。虽然在sars-cov-1召回患者中观察到一些交叉反应(4/20)，但水平相对较低。在所有sars-cov-2中均检测到特异性igg，其中所有66名sars-cov-2患者的特异性igg应答均明显高于对照组。所建立的测定法也可以应用于检测其它同种型。发明人验证了igm检测的测定方法(图1)，这对于检测感染早期患者或无症状患者可能分别很重要。虽然igm测定的灵敏度较低，在36/59名患者中检测到特异性igm，但包括sars-cov-1患者在内的所有对照组均未观察到交叉反应。igm测定可以补充igg测定-igm测定的高特异性意味着任何igm阳性测试都表明存在感染。发明人还验证了用于检测igg亚类的测定法(图2)。众所周知，igg1和igg3在中和病毒方面很重要。通过igg亚类测定，发明者能够检测患者血浆中的igg亚类。所有测试的患者(n＝66)都有强烈的igg1应答。62/66患者有igg3反应；49/66患者有igg2反应；44/66患者有igg4反应。在这66名最终康复的患者中，中和igg1和igg3的强烈存在表明igg1和igg3对保护很重要。事实上，发明者发现igg1和igg3反应与血浆中抗体的中和能力密切相关(图11)。此外，已经确定igg1和igg3的存在表明th1反应。th1反应是一种促炎反应，在对病毒的保护性免疫中尤为重要。igg2和igg4反应表明th2反应，在介导针对病毒的保护性免疫方面效果较差。通过这种测定，检测主要igg同种型存在的应用可以了解特定患者可能具有的免疫反应类型(th1或th2)。这对于识别免疫和可能受到保护的个人非常重要。了解igg同种型对于完善当前针对covid-19的候选疫苗至关重要。s流式测定非常适合于检测有症状患者的抗s蛋白抗体。此外，s流测定还可用于检测特异性抗体低且在其他血清学检测中可能无法检测到的感染。使用由20个临界样品组成的样品队列，发明人发现s流igg/igm测定的灵敏度与其他血清学测试相当，能够检测70％(14/20)的样品(表5)。s流igg1测定的灵敏度略高，能够检测75％(15/20)的样品。总之，组合s流测定(igg/m，igg1，igg2，igg3和igg4)能够检测到90％(18/20)的样品。这表明s血流测定可以单独或与其他血清学测定结合使用，以检测可能已经或可能未被发现的边缘感染。这将为社区中未发现和未诊断的covid-19病例的程度提供重要的见解。【表5：通过各种血清学检测(包括s血流测定)对临界样品进行血清学分析】通过测试3仅测试了15/20。【实施例4】测定基于以下发现：4种亚型抗体igg(igg1)中有1种在covid-19患者中占主导地位，特别是在感染后中位数23天。igg1的存在可以清楚地确定患者是否具有covid-19感染，并且高度区分covid-19患者与季节性ncov、sars和健康患者。方法：将sars-cov-2基因与绿色荧光蛋白(gfp)一起引入人细胞。产生gfp和病毒s蛋白的细胞使用高速细胞分选仪(如facs aria)进行分离。这些细胞被添加到covid-19患者血清中。产生的s蛋白与血清中存在的抗体结合，并使用荧光读数器检测结合的抗体。图7显示了荧光强度与抗体存在百分比，图2显示了在感染后第10天和第23天显示igg1比其他亚型存在较强。【实施例5】使用上述相同的方法，发明人通过生成细胞系来表达来自sars-cov-2新出现的变体的s蛋白，从而进一步开发了该测定法。新增内容包括sars-cov-2的α和β变种。表达α和β变体的细胞已经使用一组来自covid-19患者的恢复期血浆样品进行了验证，其中发明人发现，与对野生型(wt)的反应相比，对α和β变体的抗体应答显著降低(图12)。本文公开的方法可用于通过研究针对接种covid-19疫苗后从个体收集的血浆样品中的变异的抗体应答来检查疫苗对α和β变异的潜在功效。此外，发明人还开发了用于sars-cov-2的δ变体的测定方法。发明者发现，接种covid-19疫苗后，疫苗对野生型刺突蛋白产生了强烈的抗体应答。然而，针对δ变异株的抗体应答显著降低，表明疫苗对δ变异株的潜在效力较低(图13)。【参考资料】ahmed,s.f.,quadeer,a.a.,and mckay,m.r.(2020).preliminaryidentification of potential vaccine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更灵敏，其可以检测igg但不能在100％的患者中进行测试(与本文描述的测定的实施方式不同)。本领域技术人员可以理解，可以在不脱离广泛描述的公开的精神或范围的情况下对本文公开的实施例进行其它变化和/或修改。例如，在本文的描述中，不同示例性实施例的特征可以跨不同的示例性实施例混合、组合、互换、合并、采用、修改、包括等等。因此，本实施例在所有方面都被认为是说明性的，而不是限制性的。                         序列表<110>  agency for science, technology and research<120>  sars-cov2抗体检测方法及相关产品<130>  2101421<150>  sg10202009679p<151>  2020-09-29<160>  15<170>  patentin version 3.5<210>  1<211>  1273<212>  prt<213>  冠状病毒<400>  1met phe val phe leu val leu leu pro leu val ser ser gln cys val1               5                   10                  15asn leu thr thr arg thr gln leu pro pro ala tyr thr asn ser phe            20                  25                  30thr arg gly val tyr tyr pro asp lys val phe arg ser ser val leu        35                  40                  45his ser thr gln asp leu phe leu pro phe phe ser asn val thr trp    50                  55                  60phe his ala ile his val ser gly thr asn gly thr lys arg phe asp65                  70                  75                  80asn pro val leu pro phe asn asp gly val tyr phe ala ser thr glu                85                  90                  95lys ser asn ile ile arg gly trp ile phe gly thr thr leu asp ser            100                 105                 110lys thr gln ser leu leu ile val asn asn ala thr asn val val ile        115                 120                 125lys val cys glu phe gln phe cys asn asp pro phe leu gly val tyr    130                 135                 140tyr his lys asn asn lys ser trp met glu ser glu phe arg val tyr145                 150                 155                 160ser ser ala asn asn cys thr phe glu tyr val ser gln pro phe leu                165                 170                 175met asp leu glu gly lys gln gly asn phe lys asn leu arg glu phe            180                 185                 190val phe lys asn ile asp gly tyr phe lys ile tyr ser lys his thr        195                 200                 205pro ile asn leu val arg asp leu pro gln gly phe ser ala leu glu    210                 215                 220pro leu val asp leu pro ile gly ile asn ile thr arg phe gln thr225                 230                 235                 240leu leu ala leu his arg ser tyr leu thr pro gly asp ser ser ser                245                 250                 255gly trp thr ala gly ala ala ala tyr tyr val gly tyr leu gln pro            260                 265                 270arg thr phe leu leu lys tyr asn glu asn gly thr ile thr asp ala        275                 280                 285val asp cys ala leu asp pro leu ser glu thr lys cys thr leu lys    290                 295                 300ser phe thr val glu lys gly ile tyr gln thr ser asn phe arg val305                 310                 315                 320gln pro thr glu ser ile val arg phe pro asn ile thr asn leu cys                325                 330                 335pro phe gly glu val phe asn ala thr arg phe ala ser val tyr ala            340                 345                 350trp asn arg lys arg ile ser asn cys val ala asp tyr ser val leu        355                 360                 365tyr asn ser ala ser phe ser thr phe lys cys tyr gly val ser pro    370                 375                 380thr lys leu asn asp leu cys phe thr asn val tyr ala asp ser phe385                 390                 395                 400val ile arg gly asp glu val arg gln ile ala pro gly gln thr gly                405                 410                 415lys ile ala asp tyr asn tyr lys leu pro asp asp phe thr gly cys            420                 425                 430val ile ala trp asn ser asn asn leu asp ser lys val gly gly asn        435                 440                 445tyr asn tyr leu tyr arg leu phe arg lys ser asn leu lys pro phe    450                 455                 460glu arg asp ile ser thr glu ile tyr gln ala gly ser thr pro cys465                 470                 475                 480asn gly val glu gly phe asn cys tyr phe pro leu gln ser tyr gly                485                 490                 495phe gln pro thr asn gly val gly tyr gln pro tyr arg val val val            500                 505                 510leu ser phe glu leu leu his ala pro ala thr val cys gly pro lys        515                 520                 525lys ser thr asn leu val lys asn lys cys val asn phe asn phe asn    530                 535                 540gly leu thr gly thr gly val leu thr glu ser asn lys lys phe leu545                 550                 555                 560pro phe gln gln phe gly arg asp ile ala asp thr thr asp ala val                565                 570                 575arg asp pro gln thr leu glu ile leu asp ile thr pro cys ser phe            580                 585                 590gly gly val ser val ile thr pro gly thr asn thr ser asn gln val        595                 600                 605ala val leu tyr gln asp val asn cys thr glu val pro val ala ile    610                 615  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背景技术：

技术实现思路