三螺旋束蛋白的亲和配体文库及其用途的制作方法

本公开涉及亲和色谱领域，并且更具体地涉及提供编码三螺旋束蛋白质结构域的核酸和多肽文库，其适用于选择特异性结合感兴趣的靶分子的亲和配体。本公开还涉及使用那些文库来鉴定和分离此类针对靶分子的亲和配体的方法。

背景技术：

1、生物产生的治疗剂的纯度受到当局的严格审查和监管，以确保安全性和有效性。因此，仍然需要有效纯化生物产生的治疗剂至高纯度的手段。

2、生物过程亲和色谱提供了一种通过几个步骤或单个步骤分离和纯化蛋白质的手段。然而，亲和配体的开发可能是资源密集型和耗时的。

3、为了促进亲和配体的发现，已经开发了亲和文库，可快速有效地筛选以鉴定感兴趣的靶标的配体。此类文库包括基于蛋白a结构域或z结构域的可用于纯化免疫球蛋白的文库，以及基于抗体的以便在纯化过程中利用特定抗原-抗体相互作用的文库。此外，能够产生高亲和力配体是产生用于生物过程纯化的亲和剂的另一个重要步骤。配体还应具有高稳定性，以承受生物加工的严酷条件，尤其是包含naoh的原位清洗(cip)方案。在许多纯化循环中重复使用树脂的能力对纯化过程的经济性具有深远的影响。基于蛋白a的igg结合树脂的演变证明了这一点，现代变体能够承受重复的0.5m naoh cip循环。这些igg结合结构域的特征在于与fc区中ch2和ch3结构域的界面具有高结合亲和力，通常低于50nm(graille等人(2000)proc natl acad sci usa.97:5399-5404)。另外，还存在对没有igg结合，但能够工程改造为与也具有高稳定性的其他模式的结合的亲和配体的需求。本公开解决了所述需求。考虑了可用作igg以外的模式或分子的高亲和力配体的一系列多肽。

4、然而，已知许多其他多样结构的生物大分子具有多样的蛋白质-配体相互作用机制，并且仍然需要找到这些大分子的亲和配体以利用生物过程亲和色谱提供的精简流程。

5、分子相互作用的多样性和机制是众所周知的(参见例如，du等人(2016)int.j.mol.sci.17.doi:10.3390/ijms17020144)。在生物大分子中遇到的一些蛋白质-配体相互作用的结构多样性的实例示于图1中，并且这些模型强调了拥有大量具有不同配体结构的亲和文库的需求和优势。

6、此外，即使在已知的支架文库中，仍然需要拥有许多不同的文库。例如，在一项研究中，针对配体发现对48个不同的支架家族进行查询，并且62个最佳配体全部来自单一支架文库(48个支架文库中的支架45)。这一非凡的发现强调了对配体结构多样性的需求，而不仅仅是特定配体结构内的高序列多样性。有效处理支架家族之间的配体多样性是配体发现工作中的主要技术挑战。在进一步的工作中，62个配体之间的序列相似性允许将这些配体分类为5个进化枝。虽然其他家族产生了约900个具有中等亲和力的配体，但这些配体缺乏与62个最佳配体相关的选择性。有趣的是，用于62个最佳配体的支架是为适应生物“锁和钥匙”亲和配体而开发的。来自其他支架类型的选择性配体的缺乏仅表明这种特定支架家族具有模拟同源受体所需的分子结构(coyle等人在approaches to the purification,analysis and characterization of antibody-based therapeutics中,(编辑，matte)elsevier,2020,第55-79页(在第65页)。

7、因此，亲和配体的稀缺以及文库之间的不同效用已经产生了对能够与代表多个配体-靶标结构的许多不同类型结构相互作用的配体文库的需求。本文所述的文库是解决这些需求的策略的一部分。

技术实现思路

1、亲和配体文库可用作针对靶分子的新亲和配体的来源，其满足了对使用生物过程亲和色谱纯化那些靶标的简单且经济的方式的需求。

2、在一个方面，本公开提供了核酸文库，其成员编码亲和配体，所述亲和配体包含由下式表示的氨基酸序列，从n末端到c末端，

3、[a]-x1qrrx2fix3x4lrx5dps-[x6]n-sax7llax8ax9x10x11ndx 12qapx13-[b](seq idno.1)，

4、其中(a)[a]包含α-螺旋形成肽结构域；

5、(b)x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x10、x11和x12中的每一个独立地是任何氨基酸；

6、(c)n表示存在的x6残基的数量，并且是一到十的整数，

7、(d)x9和x13中的每一个独立地是a、k或r；并且

8、(e)[b]不存在，是vd，或者是包含以下氨基酸序列的肽结构域：

9、vdgqagqgggsglndifeaqkiewhehhhhhh(seq id no.9)、

10、gqagqgggsglndifeaqkiewhehhhhhh(seq id no.10)、

11、vdglndifeaqkiewhehhhhhh(seq id no.11)或

12、glndifeaqkiewhehhhhhh(seq id no.12)。

13、在某些实施方案中，[a]的α-螺旋形成肽结构域包含葡萄球菌蛋白a(spa)结构域(诸如z-结构域、a-结构域、b-结构域、c-结构域、d-结构域或e-结构域，并且在一些实施方案中优选z-结构域)的碱稳定螺旋1。在一些实施方案中，[a]包含具有以下氨基酸序列的肽：vdakfdkeleearaeierlpnlte(seq id no.2)、vdakfdkel eearakierlpnlte(seq idno.3)、vdakfdkeleevraeier lpnlte(seq id no.4)、vdakfekeleearaeierlpnlte(se q idno.5)、vdakfdkeleeiraeierlpnlte(seq id no.6)或vdakfdkeleearaeierlpalte(seq idno.7)。对于这些实施方案中的任一个，[a]的n末端之前可以是m或maqgt(seq id no.8)。

14、在某些实施方案中，核酸文库是表1中seq id no.13-18的文库中的任一个。在其他实施方案中，本公开的核酸文库的[a]为vdakfdkeleearaeierlpnlte(seq id no.2)，n为一，并且x13为k。

15、在一些实施方案中，本公开的核酸文库中的任一个可包含肽标签，任选地，其中所述肽标签是血凝素、c-myc、单纯疱疹病毒糖蛋白d、t7、gst、gfp、mbp、strep标签、his标签、myc标签、tap标签或flag标签。

16、在某些实施方案中，亲和配体还包含c末端赖氨酸或半胱氨酸。

17、对于一些实施方案，核酸文库是噬菌体展示文库、酵母展示文库、rna展示文库或dna展示文库。噬菌体展示文库特别有用，并且可包含大约106至109个理论上不同的核酸序列。

18、在另一方面，本公开提供了鉴定与感兴趣的靶分子选择性相互作用的多肽的方法，其包括(a)将感兴趣的靶分子暴露于由本公开的核酸文库的表达产生的多肽；以及(b)将选择性相互作用的多肽与不与所述靶分子选择性相互作用的多肽分离。在此方法中，实施方案包括使感兴趣的靶分子在噬菌体、细菌或细胞的表面上表达，或者附接至、拴系于固体支持物或以其他方式与固体支持物缔合。

19、本公开还提供了筛选文库以获得以高亲和力特异性结合感兴趣的靶分子的多肽(即，亲和配体)的方法，所述文库包含由表达本公开的核酸文库而产生的多个多肽，所述方法通过(a)在适于多肽与靶分子特异性结合的条件下，将所述文库的样品与一定浓度的所述分子一起孵育；(b)在相同条件下但没有靶分子的情况下孵育文库的第二样品；(c)在适于多肽与固定的靶分子结合的条件下，使所述第一和第二样品中的每一个与所述固定的靶分子接触；(d)针对每个样品检测与固定的靶分子结合的所述多肽；以及(e)通过计算来自所述第一样品的结合多肽的量与来自所述第二样品的结合多肽的量的比来确定所述多肽对所述靶分子的亲和力。

20、本公开的再其他面涉及鉴定一种或多种与感兴趣的靶分子特异性结合的亲和配体的方法，其包括：(a)使所述靶分子与噬菌体展示文库接触；(b)将特异性结合(或结合至)所述靶分子的噬菌体与不选择性结合所述靶分子的噬菌体分离，以产生富集的噬菌体文库；(c)使用所述富集的噬菌体文库重复步骤a)和b)来产生进一步富集的噬菌体文库；(d)重复步骤c)，直到所述进一步富集的噬菌体文库相对于原始噬菌体文库富集至少约10倍至约106倍或更多；以及(e)将所述进一步富集的噬菌体文库铺板并从中分离和表征单个克隆，从而鉴定一种或多种特异性结合所述感兴趣的靶分子的亲和配体。

21、在前述方法的一些实施方案中，靶分子结合或附接至固体支持物。在其他实施方案中，噬菌体展示文库结合或附接至固体支持物。在任何一种情况下，靶分子都可以是腺相关病毒(aav)或aav衣壳，并且更具体地说，aav是aav8或aav8血清型变体。

22、在另一方面，本公开提供了包含多个合成或重组多肽的多肽文库组合物，每个多肽包含本文所述的核酸文库的亲和配体。

23、在另一个方面，本公开涉及鉴定特异性结合感兴趣的靶分子的多肽的方法，其包括：(a)将感兴趣的靶分子暴露于本公开的多肽文库组合物；(b)将特异性结合所述靶分子的多肽与不选择性结合所述靶分子的多肽分离；以及(c)鉴定被所述靶分子结合的多肽中的一种或多种。