蛋白质的制造方法与流程

背景技术：

1、蛋白质治疗剂的市场显著增长，发展步伐不断加快。然而，对于本行业来说，维持所需质量属性(例如，糖基化)同时维持数量、降低生产成本并提供生产灵活性是一项挑战。为了继续满足市场需求，需要高效生产规模的蛋白质治疗剂的生产。

2、糖基化是所有蛋白质翻译后修饰(ptm)中最丰富的一种。它是由于将糖残基添加到蛋白质侧链中以形成糖蛋白而产生的。哺乳动物糖蛋白寡糖通常由有限数量的单糖构成，但是它们的结构多样性很大，主要是因为它们经常形成复杂的分支模式。

3、糖基化在许多特定的生物学功能(包括免疫防御、受精、病毒复制、寄生生物感染、细胞生长、炎症和细胞-细胞粘附)中起着重要作用。对于药物糖蛋白，糖基化会影响蛋白质构象的稳定性、清除率、对蛋白水解的保护，并且改善蛋白质的溶解度。由于不同的糖形可能具有不同的生物学特性，因此在生产过程中监测和控制糖基化的能力对于生物制药分子的质量至关重要。

4、然而，发酵期间的糖基化天然以一定程度的异质性存在，并且可以受到许多不同因素(如表达系统、过程条件、培养基组成、补料方案、纯化过程或其任何组合)的影响。因此，需要改善包括培养在内的蛋白质制造过程，同时保持蛋白质的糖基化模式一致。

技术实现思路

1、本公开文本涉及一种提高细胞的蛋白质产量的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括36℃的初始温度设定点、33℃的第二温度设定点和31℃的第三温度设定点；7.0的初始ph设定点和6.9的第二ph设定点；在0.15x 106个细胞/ml与0.45x 106个细胞/ml之间(例如，0.30x 106个细胞/ml)的初始活细胞密度(vcd)设定点；6.9的初始ph；在10％至40％之间的初始co2设定点；或其任何组合。在一些方面，所述合适的条件包括36℃的初始温度设定点、33℃的第二温度设定点和31℃的第三温度设定点；7.0的初始ph设定点和6.9的第二ph设定点；0.30x106的初始活细胞密度(vcd)设定点；以及在15％与25％之间的初始co2设定点。

2、本公开文本涉及一种控制细胞生长速率、细胞活力、活细胞密度和/或细胞滴度以产生蛋白质的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在36℃的初始温度设定点下在生物反应器中培养，并且将所述细胞在33℃的第二温度设定点和31℃的最终温度设定点下培养。

3、本公开文本还涉及一种提高细胞的蛋白质产量的方法，所述方法包括将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括(i)36.0℃的初始温度设定点和低于36.0℃的第二温度设定点；(ii)低于36.5℃的初始温度设定点和31.0℃的最终温度设定点；或(iii)低于36.5℃的初始温度设定点、33.0℃的第二温度设定点和低于33.0℃的最终温度设定点。

4、在一些方面，所述最终温度设定点发生在约228至约252小时。在一些方面，所述最终温度设定点发生在初始温度设定点之后约228小时、约234小时、约240小时、约246小时或约252小时。在一些方面，所述最终温度设定点为31.0℃并且发生在240小时之后。在一些方面，所述第二温度设定点发生在约120小时至约168小时。在一些方面，所述第二温度设定点发生在约120小时、约126小时、约132小时、约138小时、约144小时、约150小时、约156小时、约162小时或约168小时。在一些方面，在144小时之后所述第二温度设定点为33.0℃。

5、在一些方面，与不采用所述合适的条件的方法相比，所述条件将所述蛋白质产量提高至少150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％或至少约400％。在一些方面，所述方法降低细胞生长速率。在一些方面，所述细胞生长展现出从约30.0小时至约40.0小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出约35.1小时的平均第0-5天倍增时间。

6、在一些方面，所述方法控制细胞活力。在一些方面，所述细胞活力展现出从约10.0x 106个细胞/ml至约15.0x 106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约11.2x 106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约0.05x 109个细胞/ml至约0.11x 109个细胞/ml的平均第0-14天活细胞密度积分(ivcd)。在一些方面，所述细胞活力展现出约0.10x 109个细胞/ml的平均第0-14天活细胞密度积分(ivcd)。在一些方面，所述方法控制滴度。在一些方面，所述滴度展现出约1.50g/l至约3.5g/l的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2.87g/l的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出从约20.0pg/细胞-天至约40.0pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约38.5pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述方法进一步包括修改上游生物反应器参数，其中所述上游反应器参数选自(i)补料时间，(ii)初始ph，(iii)ph转变，(iv)co2，(v)初始细胞密度或(vi)其任何组合。

7、在一些方面，所述方法控制所述蛋白质的糖基化谱。在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种n-连接的聚糖。在一些方面，所述n-连接的聚糖包括：g0f、g1f、g2f、s1g1f、s1g2f和/或s2g2f。在一些方面，所述方法进一步包括在第14天之后测量糖基化谱。在一些方面，所述蛋白质包含ctla4结构域。在一些方面，所述蛋白质是融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白包含fc部分。在一些方面，所述蛋白质是阿巴西普。在一些方面，所述蛋白质是如seq id no:5所示的氨基酸序列。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于选自阿巴西普的asn76(t5)、asn108(t7)和/或asn207(t14)的一个或多个残基处。在一些方面，g0f包括小于或等于约7.0％或约6.5％的相对丰度。在一些方面，g1f包括小于或等于约7.5％或为约7％的相对丰度。在一些方面，g2f包括小于或等于约25％或为约1.5％至约23％的相对丰度。在一些方面，s1g1f包括小于或等于约13.5％或为约12.5％的相对丰度。在一些方面，s1g2f包括大于或等于约33％或为约32％至约49％的相对丰度。在一些方面，s2g2f包括大于或等于约12％或为约14％至约48.5％的相对丰度。在一些方面，g2f包括约1.5％至约23％的相对丰度，s1g2f包括约32％至约49％的相对丰度，和/或s2g2f包括约14％至约48.5％的相对丰度。在一些方面，g2f包括小于或等于约25％的相对丰度，s1g2f包括大于或等于约33％的相对丰度，和/或s2g2f包括大于或等于约12％的相对丰度。在一些方面，g0f包括小于或等于约6.5％的相对丰度，g1f包括小于或等于约7％的相对丰度，g2f包括约1.5％至约23％的相对丰度，s1g1f包括小于或等于约12.5％的相对丰度，s1g2f包括约32％至约49％的相对丰度，和/或s2g2f包括约14％至约48.5％的相对丰度。在一些方面，g0f包括小于或等于约7.0％的相对丰度。在一些方面，g1f包括小于或等于约7.5％的相对丰度，g2f包括小于或等于约25％的相对丰度，s1g1f包括小于或等于约13.5％的相对丰度，s1g2f包括大于或等于约33％的相对丰度，和/或s2g2f包括大于或等于约12％的相对丰度。

8、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约2.0％与约10.0％之间的g0f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约2.5％与约10％、约2.5％与约9.5％、约2.5％与约9％、约2.5％与约8.5％、约2.5％与约8％、约2.5％与约7.5％、约2.5％与约7％、约2.5％与约6.5％、约3.0％与约10％、约3.0％与约9.5％、约3.0％与约9％、约3.0％与约8.5％、约3.0％与约8％、约3.0％与约7.5％、约3.0％与约7％、或约3.0％与约6.5％之间的g0f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约3.2％与6.6％之间、在约3.2％与约4.6％之间或在3.2％与约6.6％之间的g0f的相对丰度。在一些方面，g0f的相对丰度为约4.0％。

9、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约1.0％与约6％之间的g0f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约1.0％与约6％、约1.0％与约5.5％、约1.0％与约5.0％、约1.0％与约4.5％、约1.0％与约4.0％、约1.5％与约6％、约1.5％与约5.5％、约1.5％与约5.0％、约1.5％与约4.5％、约1.5％与约4.0％、约2.0％与约6％、约2.0％与约5.5％、约2.0％与约5.0％、约2.0％与约4.5％、或约2.0％与约4.0％之间的g0f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约2.1％与约4.0％之间、在约1.8％与约3.5％之间或在约1.8％与4.0％之间的g0f的相对丰度。在一些方面，g0f的相对丰度为约3.4％。

10、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约5％与约12％之间的g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约5％与约12％、约5％与约11.5％、约5％与约11％、约5％与约10.5％、约5％与约10％、约5.5％与约12％、约5.5％与约11.5％、约5.5％与约11％、约5.5％与约10.5％、约5.5％与约10％、约6％与约12％、约6％与约11.5％、约6％与约11％、约6％与约10.5％、约6％与约10％、约6.5％与约12％、约6.5％与约11.5％、约6.5％与约11％、约6.5％与约10.5％、约6.5％与约10％、约7％与约12％、约7％与约11.5％、约7％与约11％、约7％与约10.5％、或约7％与约10％之间的g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约7.2％与约9.8％之间、在约6.3％与10.6％之间或约7.2％与约10.6％之间的g2f的相对丰度。在一些方面，g2f的相对丰度为约7.8％。

11、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约5％与约21％之间的g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约5％与约21％、约5％与约20.5％、约5％与约20％、约5％与约19.5％、约5％与约19％、约5.5％与约21％、约5.5％与约20.5％、约5.5％与约20％、约5.5％与约19.5％、约5.5％与约19％、约6％与约21％、约6％与约20.5％、约6％与约20％、约6％与约19.5％、约6％与约19％、约6.5％与约21％、约6.5％与约20.5％、约6.5％与约20％、约6.5％与约19.5％、约6.5％与约19％、约7％与约21％、约7％与约20.5％、约7％与约20％、约7％与约19.5％、约7％与约19％、约7.5％与约21％、约7.5％与约20.5％、约7.5％与约20％、约7.5％与约19.5％、约7.5％与约19％、约8％与约21％、约8％与约20.5％、约8％与约20％、约8％与约19.5％、或约8％与约19％之间的g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约8.2％与约14.1％、约8.0％与约18.6％、或约8.2％与约14.1％之间的g2f的相对丰度。在一些方面，g2f的相对丰度为约12.4％。在一些方面，g2f进一步包含半乳糖-α-1,3-半乳糖部分(g2f-gal)，其中所述g2f-gal包括小于或等于约1.4％的相对丰度。在一些方面，g2f-gal包括在约1.0％至约1.4％之间的相对丰度。在一些方面，g2f-gal包括在约0.4％至约0.9％之间的相对丰度。

12、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约29％与约38％之间的s1g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约29％与约38％、约29％与约37.5％、约29％与约37％、约29％与约36.5％、约29.5％与约38％、约29.5％与约37.5％、约29.5％与约37％、约29.5％与约36.5％、约30％与约38％、约30％与约37.5％、约30％与约37％、约30％与约36.5％、约31.5％与约38％、约31.5％与约37.5％、约31.5％与约37％、约31.5％与约36.5％之间的s1g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约31.6％与约35.1％、约31.3％与约36.5％、或约31.3％与约36.5％之间的s1g2f的相对丰度。在一些方面，s1g2f的相对丰度为约33.3％。

13、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在33％与约45％之间的s1g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约33％与约45％、约33％与约44.5％、约33％与约44％、约33％与约43.5％、约33％与约43％、约33％与约42.5％、约33.5％与约45％、约33.5％与约44.5％、约33.5％与约44％、约33.5％与约43.5％、约33.5％与约43％、约33.5％与约42.5％、约34％与约45％、约34％与约44.5％、约34％与约44％、约34％与约43.5％、约34％与约43％、约34％与约42.5％、约34.5％与约45％、约34.5％与约44.5％、约34.5％与约44％、约34.5％与约43.5％、约34.5％与约43％、或约34.5％与约42.5％之间的s1g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约34.2％与约37.7％、约35.5％与约42.3％、或约34.2％与约42.3％之间的s1g2f的相对丰度。在一些方面，s1g2f的相对丰度为约36.5％。在一些方面，s1g2f进一步包含半乳糖-α-1,3-半乳糖部分(s1g2f-gal)，其中所述s1g2f-gal包括小于或等于约4.7％的相对丰度。在一些方面，s1g2f-gal包括在约2.3％至约4.7％之间的相对丰度。在一些方面，其中s1g2f-gal包括在约1.4％至约1.8％之间的相对丰度。

14、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约13％与约25％之间的s2g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约13％与约25％、约13％与约24.5％、约13％与约24％、约13％与约23.5％、约13％与约23％、约13.5％与约25％、约13.5％与约24.5％、约13.5％与约24％、约13.5％与约23.5％、约13.5％与约23％、约14％与约25％、约14％与约24.5％、约14％与约24％、约14％与约23.5％、约14％与约23％、约14.5％与约25％、约14.5％与约24.5％、约14.5％与约24％、约14.5％与约23.5％、约14.5％与约23％、约15％与约25％、约15％与约24.5％、约15％与约24％、约15％与约23.5％、约15％与约23％、约15.5％与约25％、约15.5％与约24.5％、约15.5％与约24％、约15.5％与约23.5％、或约15.5％与约23％之间的s2g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约18.1％与约22.9％、约15.4％与约20％、约15.4％与约22.9％之间的s2g2f的相对丰度。在一些方面，s2g2f的相对丰度为约18.5％。

15、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约18％与约36％之间的s2g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约18％与约36％、约18％与约35.5％、约18％与约35％、约18％与约34.5％、约18％与约34％、约18％与约33.5％、约18.5％与约36％、约18.5％与约35.5％、约18.5％与约35％、约18.5％与约34.5％、约18.5％与约34％、约18.5％与约33.5％、约19％与约36％、约19％与约35.5％、约19％与约35％、约19％与约34.5％、约19％与约34％、约19％与约33.5％、约19.5％与约36％、约19.5％与约35.5％、约19.5％与约35％、约19.5％与约34.5％、约19.5％与约34％、约19.5％与约33.5％、约20％与约36％、约20％与约35.5％、约20％与约35％、约20％与约34.5％、约20％与约34％、约20％与约33.5％、约20.5％与约36％、约20.5％与约35.5％、约20.5％与约35％、约20.5％与约34.5％、约20.5％与约34％、或约20.5％与约33.5％之间的s2g2f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约23.2％与约33.8％、约20.8％与约32.6％、或约20.8％与33.8％之间的s2g2f的相对丰度。在一些方面，s2g2f的相对丰度为约23.5％。

16、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约2％与约8％之间的s1g3f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约2％与约8％、约2％与约7.5％、约2％与约7％、约2％与约6.5％、约2％与约6％、约2％与约5.5％、约2.5％与约8％、约2.5％与约7.5％、约2.5％与约7％、约2.5％与约6.5％、约2.5％与约6％、约2.5％与约5.5％、约3％与约8％、约3％与约7.5％、约3％与约7％、约3％与约6.5％、约3％与约6％、约3％与约5.5％、约3.5％与约8％、约3.5％与约7.5％、约3.5％与约7％、约3.5％与约6.5％、约3.5％与约6％、约3.5％与约5.5％、约4％与约8％、约4％与约7.5％、约4％与约7％、约4％与约6.5％、约4％与约6％、或约4％与约5.5％之间的s1g3f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约4.4％与约5.6％、或约4.0％与约5.5％之间的s1g3f的相对丰度。在一些方面，s1g3f的相对丰度为约4.6％。

17、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的s1g3f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约0.5％与约4％、约0.5％与约3.5％、约0.5％与约3％、约0.5％与约2.5％、约1％与约4％、约1％与约3.5％、约1％与约3％、或约1％与约2.5％之间的s1g3f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn108(t7)处，并且包括在约1.4％与约2.2％、约1.1％与约1.9％、或约1.1％与约2.2％之间的s1g3f的相对丰度。在一些方面，s1g3f的相对丰度为约1.8％。

18、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的s2g4f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约0.5％与约4％、约0.5％与约3.5％、约0.5％与约3％、约0.5％与约2.5％、约1％与约4％、约1％与约3.5％、约1％与约3％、或约1％与约2.5％之间的s2g4f的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于残基asn76(t5)处，并且包括在约1.9％与约2.4％、约1.4％与约2.1％、或约1.4％与约2.4％之间的s2g4f的相对丰度。在一些方面，s2g4f的相对丰度为约2.3％。

19、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8至约11的nana的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8.3至约11、从约9.5至约10.1、或从约8.3至约10.1的nana的摩尔比。在一些方面，所述nana的摩尔比为约10.0。

20、在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.1至约2.0的ngna的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从0.90至约1.20、或从约0.3至约1.2的ngna的摩尔比。在一些方面，所述ngna的摩尔比为约1.0。

21、在一些方面，所述糖基化谱是经由n-连接的碳水化合物谱释放方法分析的。在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种去唾液酸化聚糖(结构域i)、单唾液酸化聚糖(结构域ii)、二唾液酸化聚糖(结构域iii)和/或三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域iv+v)。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域i)具有从约28至约37、从约29至约32、从约28至约32或从约29至约37的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域i)具有约31的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域ii)具有从约26至约28、从约27至约33、从约26至约33、从约27至约28的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域ii)具有约27的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域iii)具有从约27至约28、从约22至约31、从约27至约31或从约22至约28的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域iii)具有约27.4的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域iv+v)具有从约13至约16、从约8至约16或从约8至约16的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域iv+v)具有约14.6的摩尔比。

22、在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种o-连接的聚糖。在一些方面，所述糖基化谱不包括多于一个的半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-gal)连接。在一些方面，所述ctla4包含c末端赖氨酸。在一些方面，所述c末端赖氨酸包括约20％至约25％的相对丰度。在一些方面，所述c末端赖氨酸包括约3％至约10％的相对丰度。在一些方面，所述o-连接的聚糖位于残基ser129、ser130、ser136和/或ser139处。在一些方面，所述生物反应器包括包含葡萄糖或半乳糖的补料培养基。在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一些方面，所述细胞是cho-k1细胞、cho-dxb11细胞或cho-dg44细胞。

23、本公开文本的方法还包括分析ctla4-fc融合蛋白的双触角聚糖的方法，所述方法包括测量与所述ctla4蛋白中的一个或多个天冬酰胺残基附接的一种或多种n-连接的聚糖，其中所述双触角聚糖中的一种是g2f。在一些方面，所述双触角聚糖选自g0f、g1f、g2f、s1g1f、s1g2f和/或s2g2f。在一些方面，经由超高效液相色谱和荧光检测(uplc-flr)测量所述双触角聚糖。在一些方面，在所述测量之前切割所述ctla4-fc融合蛋白的fc结构域。在一些方面，所述方法进一步包括从所述生物反应器中收获所述蛋白质。在一些方面，所述方法进一步包括使所述蛋白质运行通过病毒灭活过程。在一些方面，所述病毒灭活过程用0.5％triton x-100运行。

24、在一些方面，所述方法进一步包括调整所述蛋白质的浓度。在一些方面，所述方法进一步包括配制所述蛋白质。