成熟软骨细胞及含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法与流程

本发明涉及成熟软骨细胞及含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法。

背景技术：

1、在外科领域的手术中，大量进行由骨/软骨移植所进行的重建术。被使用作为供体的部位，一直以来是使用头盖骨、肋骨、肋软骨、髂骨等。然而，若大量采集软骨，则无法避免供体在采骨后发生功能性问题或变形的可能性。在需要多次重建手术的病例中，大多伴随着许多采骨部的牺牲。并且，采集量也有极限。

2、于是，vacanti等人发明了组织工程法，所述组织工程法是将动物的软骨组织进行酶处理，并从所得到的有限数量的软骨细胞使软骨再生。此方法是将软骨细胞接种于由人工合成的分解性聚合物所制作而成的网格结构的支架(scaffold)，且使细胞在支架附着增殖而再生软骨组织的发明[1,2]。但是，因为软骨组织在支架中没有均匀地生成软骨，所以至今还没有得到临床上可应用的结果。再者，已知支架的合成聚合物若在生物体内被吸收则会诱发炎症，并引起再生软骨的吸收[3-4]。如vacanti等人后来所报告，包含大量细胞的人工软骨结构为了生长和增殖通常需要高氧环境。因此，在软骨未形成到结构的中心的情形，不会形成软骨膜[5]。因此，其等的血液和营养素的供给受到很大限制。由此可知，会引起细胞死亡和人工构筑物的不可避免的坏死，之后，会丧失形状和功能。

3、现有技术文献

4、非专利文献

5、非专利文献1:vacanti ca,langer r,schloo b,vacanti jp.syntheticpolymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilageformation.plast reconstr surg.1991；88:753-759

6、非专利文献2:cao y,vacanti jp,paige kt,upton j,vacantica.transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct toproduce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear.plastreconstr surg.1997；100:297-302

7、非专利文献3:santavirta s,konttinen yt,saito t,et al.immune responseto polyglycolic acid implants.j bone joint surg br.1990；72:597-600.

8、非专利文献4:neidel j,zeidler u.independent effects of interleukin 1onproteoglycan synthesis and proteoglycan breakdown of bovine articularcartilage in vitro.agents actions.1993；39:82-90.

9、非专利文献5:vacanti ca.the history of tissue engineering.j cell molmed2006；10:569-576.

10、非专利文献6:yanaga h.,imai k.,koga m.,yanaga k.cell-engineered humanelastic chondrocytes regenerate natural scaffold in vitro and neocartilagewith neo-perichondrium in the human body post-transplantation.tissue eng.parta.2012；18:2020-2029

11、非专利文献7:yanaga h.,imai k.,fujimoto t.,yanaga k.generating earsfrom cultured autologous auricular chondrocytes by using two-stageimplantation in treatment of microtia.plast reconstr surg.2009；124:817-825

技术实现思路

1、发明所欲解决的课题

2、迄今为止，即使移植培养软骨细胞，因为无法获得对于确保移植所需的组织大小而言为足够的细胞量，所以也难以进行临床应用。本发明目的在于提供一种适于移植的成熟软骨细胞的制造方法及包含成熟软骨细胞的含有成熟软骨细胞的组合物。

3、解决课题的技术手段

4、本说明书中记载的最初的发明涉及成熟软骨细胞的制造方法。此成熟软骨细胞例如如后文所述可用于软骨再生术等。

5、此成熟软骨细胞的制造方法包含使用第一培养用培养基培养软骨而获得成熟软骨细胞的软骨培养工序。

6、而且，第一培养用培养基为包含氢化可的松和fgf-2的培养基。

7、软骨的例子为耳郭软骨。软骨可为经切碎的软骨(微小软骨)。

8、软骨培养工序例如包含在2％以上且15％以下的碳酸气体以及1％以上且10％以下的氧气的环境下培养软骨的工序。软骨培养工序可以在初代培养和传代培养中使用不同的培养基。例如，在初代培养中可以使用包含自身血清和fgf-2的培养基。并且，例如在将软骨或成熟软骨细胞冷冻保存一定时间后进行培养的情形，也可以使用包含自身血清、fbs、氢化可的松以及fgf-2的培养基。

9、本说明书中记载的与上述不同的发明涉及含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法。

10、此方法包含：

11、软骨培养工序，其使用第一培养用培养基培养软骨而获得成熟软骨细胞；

12、含有成熟软骨细胞的组合物的取得工序，其获得包含成熟软骨细胞的组合物，所述组合物包含成熟软骨细胞和通过软骨培养工序而获得的条件培养基(conditionedmedium)。

13、而且，第一培养用培养基是包含氢化可的松以及fgf-2的培养基。

14、软骨的例子为耳郭软骨。软骨可为经切碎的软骨。

15、软骨培养工序例如包含在2％以上且15％以下的碳酸气体以及1％以上且10％以下的氧气的环境下培养软骨的工序。软骨培养工序也可以在初代培养和传代培养中使用不同的培养基。例如，在初代培养中可以使用包含自身血清以及fgf-2的培养基。并且，例如在将软骨或成熟软骨细胞冷冻保存一定时间后进行培养的情形，也可以使用包含fbs、氢化可的松以及fgf-2的培养基。

16、条件培养基例如包含白细胞介素8(il-8)、生长相关基因(gro)、单核细胞趋化因子-1(mcp-1)以及vegf。

17、含有成熟软骨细胞的组合物是用于软骨再生的移植所使用的组合物。

18、含有成熟软骨细胞的组合物是使用于耳郭形成、外耳道形成、鼻形成、下颌形成、颧骨的硬组织凹陷成形术、颅的硬组织凹陷成形术、气管、漏斗胸等硬组织凹陷成形术的组合物。

19、本说明书中记载的与上述不同的发明涉及血管再生促进剂的制造方法。

20、血管再生促进剂包含含有成熟软骨细胞的组合物，所述含有成熟软骨细胞的组合物包含血管诱导因子和vegfr2阳性细胞。

21、而且，此方法包含通过上述的含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法而制造含有成熟软骨细胞的组合物的工序。

22、发明功效

23、根据本发明，可提供适于移植的成熟软骨细胞的制造方法。例如，通过在移植时同时加入培养软骨细胞和条件培养基(例如成熟软骨细胞的上清液)并进行移植，而可提高软骨周围的血管再生，使软骨细胞移植的生存率提升，扩大移植软骨的大小并使其能长期生存。通过此方法所移植的再生软骨通过充分供给血液和营养素，而抑制细胞死亡和坏死，之后，形状和功能得以保持。并且，因为向软骨供给营养，所以大量的软骨细胞植活，软骨吸收受到抑制，而得到迄今未得到的大的再生软骨。

24、在移植时同时加入培养软骨细胞和软骨细胞产生的上清液，可促进软骨形成，使再生软骨大幅增大，使移植成功。若将软骨细胞和上清液(条件培养基)一起移植，则会在软骨周围发生血管新生，可达成高移植率。于是，在从培养细胞确认到存在何种因子后，特异性地发现了几个高浓度的引起血管诱导的细胞因子/趋化因子。将成熟软骨细胞和包含所述成熟软骨细胞产生的促进血管形成的特异性细胞因子/趋化因子特别是gro、il8、mcp-1、vegf的上清液(cm，conditioned medium，条件培养基)添加至软骨细胞，而可抑制移植后的吸收，使植活率提升。