开关寡核苷酸

本公开涉及寡核苷酸引物组及其在用于扩增和检测寡核苷酸、检测病原体或诊断感染(如sars-cov-2和covid-19)的方法中的用途。

背景技术：

1、环介导等温扩增(lamp)是快速的dna扩增技术(notomi et al.2000,tomita etal.2008)，其已应用于病原体(如病毒、细菌和疟疾)检测。lamp反应通常在恒温下发生，30分钟内即可扩增靶dna。lamp方法使用4或6个引物以结合靶dna的6个区域，并且特异性非常高。因为lamp仅需要一个恒定的温度，所以装置可以是简单的。起初，lamp使用4个引物，但后来发现包含两个额外的环引物可以缩短原始lamp所需的时间，并潜在地增加灵敏度(nagamine et al.2002)。warmstart rtx逆转录酶(new england biolabs,uk)的可用性使得在一个反应(rt-lamp)中使逆转录和lamp结合成为可能。

2、本发明人先前已经开发了一种用于检测sars-cov-2的快速covid-19检测试剂盒，其使用一步rt-lamp而无需rna提取(huang et al.2020)。整个反应于恒定的65℃可以短至20分钟。肉眼可以看到简单的颜色改变指示，以确认病毒rna扩增的结果。

3、识别6个不同靶序列的4至6个引物的使用在lamp方法中提供了高度的特异性和选择性，这在诊断应用中特别重要。尽管如此，一些报告表明，在进行rt-lamp测定时的遗留污染、引物二聚体的形成和自扩增可以导致假阳性(baek et al.(2020)；dao et al.(2020)；hsieh et al.(2014))。

技术实现思路

1、本发明人已经开发了一种具有改进的稳定性和可靠性的lamp或rt-lamp方法。所述方法使用设计为开关的短寡核苷酸，其包含与lamp反应引物之一所使用的序列互补的序列。所述寡核苷酸作为温度依赖性开关以结合lamp的必需引物。当温度低于lamp的工作温度(例如65℃)时，开关结合互补引物并抑制非特异性或脱靶扩增。在工作温度下，开关从引物分离，允许它结合靶rna/dna进行核酸的逆转录和扩增。

2、本发明人已经证明了，在使用先前描述的用于检测sars-cov-2的rt-lamp方法检测样本中的病毒rna时，寡核苷酸开关在提高(rt-)lamp的稳定性和可靠性以及降低假阳性发生率方面的功效(huang et al.2020)。本发明人还开发了用于单步rt-lamp反应的真空干燥的主混合物，简化了最终使用者的操作，并使长期储存和运输变得容易。新的rt-lamp测定已经用于测试从72名患者提取的rna样本，证明了相对于rt-qpcr的总体百分比一致性(agreement)为90％。rt-lamp的结果可以通过比色读数和荧光读数来报告，其可以通过肉眼来确定，并且同时通过荧光强度来量化。这种双重显示可以有助于数据解释与临床诊断。本发明人还验证了rt-lamp在47个临床口腔-鼻咽拭子样本中直接检测sars-cov-2的应用，而没有任何预处理和rna提取，具有89％的总体百分比一致性。这种改进的、廉价的且快速的比色测定方法比目前标准的rt-qpcr测定方法具有相当大的实际益处，并且具有作为一线筛选工具部署的巨大潜力。

3、因此，在第一方面，本发明提供了用于扩增dna的片段的方法的寡核苷酸引物组，所述引物组包含正向内引物(fip)、反向内引物(bip)、正向外引物(f3)、反向外引物(b3)和开关寡核苷酸，其中，所述开关寡核苷酸包含与所述正向引物或所述反向引物中的一个的片段互补的核苷酸序列，其中，所述开关寡核苷酸适于在低于用于dna扩增的温度范围的温度下与所述互补引物退火结合，并且其中，当互补引物结合至所述开关寡核苷酸时，所述开关寡核苷酸阻止所述互补引物扩增。

4、在另一方面，本发明提供了一种在使用环介导等温扩增(lamp)或逆转录环介导等温扩增(rt-lamp)检测靶dna或rna序列时减少假阳性的方法，其中，所述方法包括在lamp或rt-lamp反应中包括开关寡核苷酸，其中，所述开关寡核苷酸包含与用于扩增的正向内引物(fip)、反向内引物(bip)、正向外引物(f3)或反向外引物(b3)的片段互补的核苷酸序列，其中，所述开关寡核苷酸适于在低于用于扩增的温度范围的温度下与所述互补引物退火结合，并且其中，当互补引物结合至所述开关寡核苷酸时，所述开关寡核苷酸阻止所述互补引物扩增。

5、在另一方面，本发明提供了一种环介导等温扩增(lamp)或逆转录环介导等温扩增(rt-lamp)的方法，所述方法包括：(a)将权利要求1的引物组与模板dna或rna、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dntp)、dna聚合酶和任选的逆转录酶在溶液中混合；并且(b)将混合物加热至所述dna聚合酶的工作温度。

6、在某些情况下，所述开关寡核苷酸适于阻止在所述开关寡核苷酸的3’端的延伸，和/或包含暗淬灭剂部分。

7、在另一方面，本发明提供了一种用于扩增dna的片段的试剂盒，其中，所述试剂盒包含引物组(包括所述开关寡核苷酸)。在某些情况下，所述试剂盒包含其它组分，如(i)dna聚合酶；(ii)逆转录酶；(iii)ph指示剂和/或比色指示剂；(iv)荧光团；(v)脱氧核糖核苷酸三磷酸(dntp)；(vi)缓冲液组分；和/或(vii)使用说明书。在某些情况下，将引物组和任选的所述试剂盒的一种或多种附加组分干燥，并可以组合成试剂混合物。

8、在另一方面，本发明提供了所述引物组或所述试剂盒在检测或扩增靶dna或rna序列的方法中的用途。

9、在某些情况下，所述方法包括：逆转录rna以产生cdna，并且扩增逆转录的cdna。

10、在某些情况下，所述方法用于检测样本中病原体(如病毒，如冠状病毒科(coronaviridae)或sars-cov-2)的多核苷酸。

11、在某些情况下，所述互补引物包含seq id no:1或seq id no:2的核苷酸序列，或与seq id no:1或seq id no:2具有至少50％序列同一性的变体，和/或，其中，所述开关寡核苷酸包含seq id no:8的核苷酸序列或与seq id no:8具有至少50％序列同一性的变体。所述引物组还包含：反向内引物(bip)，其包含seq id no:3的核苷酸序列或与seq id no:3具有至少50％序列同一性的变体；正向外引物(f3)，其包含seq id no:4的核苷酸序列或与seq id no:4具有至少50％序列同一性的变体；反向外引物(b3)，其包含seq id no:5的核苷酸序列或与seq id no:5具有至少50％序列同一性的变体；正向环引物(lf)，其包含seqid no:6的核苷酸序列或与seq id no:6具有至少50％序列同一性的变体；和/或，反向环引物(bf)，其包含seq id no:7的核苷酸序列或与seq id no:7具有至少50％序列同一性的变体。在某些情况下，所述引物组包含具有seq id no:9至14的核苷酸序列的另外六个引物。

12、在另一方面，本发明提供了一种用于检测sars-cov-2或用于诊断受试者的sars-cov-2感染或covid-19的试剂盒，所述试剂盒包含：具有seq id no:2至8的核苷酸序列的一组6个引物和开关寡核苷酸或具有seq id no:2至14的核苷酸序列的一组12个引物和开关寡核苷酸，dna聚合酶，逆转录酶，比色ph指示剂，脱氧核糖核苷酸三磷酸(dntp)，以及任选的缓冲液，任选地其中，所述试剂盒包含真空干燥的试剂混合物。

13、在另一方面，本发明提供了一种检测样本中的sars-cov-2或诊断受试者的sars-cov-2感染或covid-19的方法，所述方法包括：(i)获得样本或从受试者获得生物样本；(ii)逆转录以从所述样本中的rna产生cdna；(iii)使用具有seq id no:2至8的核苷酸序列的一组6个引物和具有seq id no:2至14的核苷酸序列的开关寡核苷酸或一组12个引物和开关寡核苷酸来扩增逆转录的cdna；(iv)检测扩增的dna；并且确定sars-cov-2的存在或诊断受试者的sars-cov-2感染或covid-19。

14、现在将通过示例而非限制的方式，并参考附图，更详细地描述本公开。当给出本公开时，对于本领域技术人员而言，许多等效的修改和变化将是显而易见的。因此，所阐述的本公开的示例性实施方案被认为是说明性的而非限制性的。在不脱离本公开的范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行各种改变。本文引用的所有文件，无论是上文还是下文，都通过引用的方式明确地以其整体并入本文。

15、本公开包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许的或者被声明为明确避免的。如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一个引物”通常包括两个或更多个这种引物。

16、本文使用的部分标题仅为了方便，而不应理解为任何形式的限制。

17、除非另有定义，否则本技术中使用的所有技术和科学术语具有与本技术技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。在本技术的说明书中使用的术语仅仅是出于描述特定的实施方案的目的，而非用于限制本技术。本技术中使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。

18、以下实施例中没有具体条件的实验方法通常遵循常规条件或制造商推荐的条件。实施例中使用的各种常用的化学试剂均为市售产品。